对弧菌致病菌的检测用什么培养基

品种名称：TCBS琼脂 (硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂)

品种编号：025020

TCBS琼脂用途：用于肠道致病性弧菌特别是霍乱弧菌和副溶血性弧菌的选择性分离培养。

在自然情况下，人类是霍乱弧菌的唯一易感者。在地方性流行区，除病人外，无症状感染者也是重要传染源。高比例的无症状携带者有利于疾病的扩散，根据卫生状况，无症状携带者和病人的比率波动在10:1～100:1之间。

传播途径主要是通过污染的水源或未煮熟的食物如海产品、蔬菜经口摄入。居住拥挤，卫生状况差，特别是公用水源是造成暴发流行的重要因素。人与人之间的直接传播不常见。在正常胃酸条件下，如以水为载体，需饮入大于1010个细菌方能引起感染;如以食物作为载体，由于食物高强度的缓冲能力，感染剂量可减少到102～104个细菌。任何能降低胃中酸度的药物或其他原因，都可使人对霍乱弧菌感染的敏感性增加。

图鉴：

TCBS琼脂使用原理：

多价蛋白胨、酵母膏粉提供碳氮源、维生素和生长因子;氯化钠可刺激弧菌的生长;蔗糖是可发酵的糖类;胆酸钠、牛胆汁粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群;霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该

pH值可增强其生长;硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂;溴麝香草酚蓝和麝香草酚蓝是pH指示剂;琼脂是培养基的凝固剂。

TCBS琼脂配方(每升)：

酵母膏粉5g

多价蛋白胨 10g

氯化钠10g

柠檬酸钠10g

硫代硫酸钠10g

胆酸钠 3g

牛胆汁粉 5g

蔗糖20g

柠檬酸铁 1g

琼脂15g

溴麝香草酚蓝0.04g

麝香草酚蓝0.04g

最终pH 8.6±0.2

TCBS琼脂使用方法：

1、称取TCBS琼脂培养基89g，加入蒸馏水或去离子水1 L，加热搅拌煮沸1—2min溶解后，勿高压灭菌，冷至50左右，倾注灭菌平皿，待凝固后备用。

2、取待检菌的新鲜纯培养物划线接种于平板上，36±1℃培养18—24h。

质量控制：

此培养基倾注平皿冷却后呈绿色，无沉淀。下列菌株接种后于36±1℃培养18—24h，结果如下：

菌名菌号生长状况菌落特征

霍乱弧菌Vb0 好黄色

副溶血性弧菌VPL4-90 好蓝绿色

大肠埃希氏菌ATCC25922 不长或差半透明

贮存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。规格：250g

食品致病菌检测

食品致病菌快速检测技术 时间:2004-05-11 10:24:00 来源:食品商务网 沙门氏菌、李斯特氏菌、大肠杆菌O157、弯曲杆菌等食物致病菌已成为危害食品安全的头号杀手。如何快速而准确地检测这些致病菌，是有效遏制这些杀手、确保食品安全的首要任务。 常规食品微生物检测方法包括反复增菌、菌落分离及多种生化和血清学鉴别实验，不仅步骤复杂，而且耗费时间，难以适应飞速发展的现代食品生产和流通领域。因此为了确保食品的安全性，开发快速检测致病菌的方法非常重要。 随着生物、化学、材料科学以及计算机领域的进步，新的快速检测和识别方法层出不穷，这些方法主要包括微量生化试剂盒、抗原－抗体检测、DNA检测，以及常规检测的改进方法。微量生化试剂盒主要用于食品微生物的纯培养的生化鉴别上，与常规方法原理相同。一般是特别针对肠道菌或非肠道菌（如弯曲杆菌、李斯特氏菌、厌氧菌、非发酵性G－菌和G ＋菌）而设计，采用鉴别某种微生物的多种微量培养基及底物，其结果可人工识读；如结合自动保温、监测并记录设备，再与计算机中储存的数据库比较而自动鉴别的话，则可进行多样品大规模快速检测。 DNA检测方法包括应用探针、PCR技术和噬菌体技术，这些检测方法已商品化。探针检测一般是检测rRNA，因其rRNA在细菌中的高拷贝数，无须扩增，检测灵敏。PCR技术是用小片段的 DNA探针或引物，与特异性模板杂交，并用Taq酶扩增。几次循环后，PCR可以在2h 内扩增单拷贝DNA到1百万倍，所以从理论上说无须增菌培养。但由于食品和培养基中存在的抑制剂，可能阻止引物连接和减低扩增效率，所以在检测食品时，还是需要在检测前先进行增菌培养。应用噬菌体对其宿主的高度专一性的特点，进行食品致病菌的检测的实例就是沙门氏菌的检测，其中所使用的噬菌体经过基因工程改造而携带有可检测标记。如有沙门氏菌存在，此噬菌体将标记带给宿主并表达，从而被检出。 抗体检测方法是利用抗原－抗体的高度专一性结合的特点。由于反应简单和易操作，现已开发了许多方法用于食品检测。最简单的是乳胶凝集（LA），此法采用抗体包埋的有颜色的乳胶珠或胶体金颗粒，用于从食品中分离的纯培养的快速血清学识别或分型，LA的改良方法是反向被动乳胶凝集（RPLA），法常用于检测食品萃取液中的毒素。例如，食品中金黄色葡萄球菌即可采用此法检出：葡萄球菌的表面存在A蛋白，具有种属特异性，该A 蛋白能与人及多种哺乳动物的免疫球蛋白IgG的Fc段结合，因此可采用IgG包埋的乳胶颗粒，结合血浆纤维蛋白原与凝集因子的凝集反应，来检测金葡菌的有无。 酶联免疫分析（ELISA）是食品病原菌检测最常用的抗体分析方法。常设计成“三明治夹心”实验：固体基质上连接抗体，用来捕获增菌培养物中的抗原，与酶相连的第二抗体用于检测。塑料微孔板的侧壁、涂抹棒等检测用具常作为固体基质。在食品微生物检测的国家标准中，金葡菌肠毒素即是采用此法检出的。 免疫沉淀或免疫层析也是采用“夹心法”，但是没有采用酶连接物，而是用耦联在有色乳胶珠或胶体金上的抗体来检测。该方法简便易行，无须洗涤或操作，在获得增菌样品后，短短十来分钟即可完成。现已商品化的李斯特氏菌检测试剂盒即采用此方法。 此外，用含脱水培养基的一次性板卡，以替代传统的琼脂平板；用荧光法检测细菌ATP，以快速在线检测细菌总数；将生色物质和荧光物质加入到培养基内，以快速检测特征酶活力———这些方法，在食品微生物的快速检测中都已成为常用方法。 快速方法的优点是可从大量食品样品中快速筛选某致病菌或毒素。但要注意的是，快速

微生物计数培养基适用性验证报告.doc

非无菌产品微生物限度检查用培养基 适用性验证

目录 1.验证目的 (1) 2.参照标准 (1) 3.验证项目 (1) 4.验证工作小组及职责 (1) 5.试验材料 (2) 6.试验过程 (3) 7.验证周期 (4) 8.附件 (4)

1、验证目的： 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数用培养基应进行培养基的适应性检查，本次验证的目的是为了确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基适合需氧菌总数计数、霉菌和酵母菌总数计数的测定。 2、参照标准：《中国药典》2015年版四部 3、验证项目：胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基适用性验证 4.验证小组及职责 4.1 验证小组 4.2 验证职责 5.试验材料 5.1验证所用培养基：

5.2验证用菌株培养 5.2. 仪器设备： 5.2.1. XXXXX立式压力蒸汽灭菌器 5.2.2.XXXX水平流净化工作台 5.2.3.XXXXXX干燥箱 5.2.4.XXXXX型霉菌培养箱 (20～25℃) 5.2.5. XXXXX电热恒温培养箱(30～35℃) 5.3. 稀释剂： 0.9%无菌氯化钠溶液 6.试验过程 6.1菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培

养物，加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2?8℃，可在24小时内使用。 6.2、适用性检查 培养基适用性检查 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的菌悬液与黑曲霉的孢子悬液（均不大于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注适用性检查的胰酪大豆胨琼脂培养基，用于检查胰酪大豆胨琼脂培养基的需氧菌总数计数适用性。其中，接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的培养皿于30-35℃培养，时间不超过3天。接种白色念珠菌与黑曲霉的孢子的培养皿于30-35℃培养，时间不超过5天。 取白色念珠菌的菌悬液与黑曲霉的孢子悬液（均不大于100cfu），分别注入无菌平皿中，立即倾注适用性检查的沙氏葡萄糖琼脂培养基，用于检查沙氏葡萄糖琼脂培养基的霉菌和酵母菌总数计数适用性。培养温度为20-25℃，培养时间不超过5天。 上述每一试验菌株平行制备两个平皿，同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述实验。 阴性对照 为确认试验条件符合要求，同时进行培养基阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

常见致病菌的检测

常见致病菌的检测 摘要：近年来食品药品安全的问题屡见不鲜，做好致病菌的检测，是防范于未然的措施，因而显得尤为的重要，也越来越受到人们的重视。这就要求我们对一些常见的致病菌检测技术的要有一定的了解。 关键词：致病菌，肠球菌，霉菌和酵母菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌。一.肠球菌 （1）、形态与染色【1】 肠球菌为革兰阳性（G+）球菌,广泛分布于自然环境及人和动物消化道内。20世纪80年代以来，肠球菌严重感染的发生率和病死率明显升高，并且由于肠球菌的固有耐药和获得性耐药，使许多常用抗菌药物在治疗肠球菌感染时失败。因此，从分子水平对肠球菌致病因子、肠球菌引起的感染机制与治疗的研究显得尤为重要。肠球菌为圆形或椭圆形、呈链状排列的革兰阳性球菌，无芽胞，无鞭毛，为需氧或兼性厌氧菌。本菌对营养要求较高，在含有血清的培养基上生长良好。 （3）致病性【1】 一般而言，肠球菌的毒力不高。与金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌相比，肠球菌对大多数动物的半数致死量（LD50）值相当高，而且肠球菌很少引起蜂窝织炎和呼吸道感染。 肠球菌只有在宿主组织寄殖，耐机体非特异及免疫防御机制，并引起病理改变，才能导致感染。粘附测定显示肠球菌可通过细菌表面表达的为粘附素，吸附至肠道、尿路上皮细胞及心脏细胞。这些粘附素的表达亦受细菌生长环境的影响。另外，肠球菌可产生一种聚合物质（系一种蛋白表面物质，可聚集供体与受体菌，以利质粒转移），在体外增强其对肾小管上皮细胞的粘附。 细菌生长环境亦影响肠球菌与多形核白细胞反应。血清中生长的肠球菌与多形核白细胞反应较弱，而肉汤中生长的细菌反应较强。体外多形核白细胞对肠球菌的有效杀灭作用需血清补体蛋白参与，而抗肠球菌抗体可增强该作用。 （4）、肠球菌属主要检测步骤如下：【2】 方法一：肠球菌平板计数法检验程序 25g (mL) + 225 mL 缓冲蛋白胨水

培养基适用性检查记录

培养基适用性检查记录 质量部

培养基名称：沙氏葡萄糖琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含 菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照沙 氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，20-25℃培养5天计数。被检培养基同 法操作。 四、结果判断 五、结论 本品按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”及培养基适用性检验操作规程检验，结果：□符合规定□不符合规定。

培养基名称：胰酪大豆胨琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]第代 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]第代 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]第代 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml 的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取11个无菌平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌皿30-35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉20-25℃培养5天计数。被检培养基同法操作。 四、结果判断

食品中常规致病菌快速检测(恒温扩增芯片法)

食品中常规致病菌快速检测（恒温扩增芯片法） 1范围 本标准规定了食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测方法。 本标准适用于食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、志贺氏菌和侵袭性大肠埃希氏菌的快速检测。 2术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 微流控芯片microfluidic chip 利用微加工技术，在硅、石英玻璃或高分子材料等基质上加工出各种微细结构，如管道、反应池、微泵、微阀等功能单元，进行样品的处理和分子的微系统。 3设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1冰箱：2℃~5℃、-20℃±5℃。 3.2恒温培养箱：36℃±1℃。 3.3均质器。 3.4漩涡震荡仪。 3.5电子天平：感量0.1g。 3.6水浴锅：能升温至95℃。 3.7高速离心机：12000rpm/分钟。 3.8瞬时离心机。 3.9生物安全柜。 3.10微型分光光度计。 3.11恒温扩增仪。 3.12微流控芯片。 3.13低速离心机。 3.14微量移液器。 3.15无菌离心管：1.5ml、200ul。 3.16无菌吸管：50ml。 3.17锥形瓶：容量1000ml、500ml。 3.18量筒：容量500ml。 3.19擦镜纸。

4 培养基和试剂 4.1食源性致病菌加强型培养基：配置方法见附录A 中A.1。4.2适用型核酸提取试剂盒。 4.3生理盐水：配置方法见附录A 中A.2。 4.4 适用型核酸检测试剂盒（生物芯片法）：碟式芯片结构示意图，见图 1。 图1 碟式芯片结构示意图 5 检测程序 食品中常规致病菌的快速检测程序，见图2。 样本前处理 25g （mL ）样品+225mL 食源性共増菌培养基36℃±1℃，16h ～20h 取100ul 共増菌培养液收集菌体，提取核酸浓度范围50pg/ul~50ng/ul 配置反应体系，上芯片上机 芯片离心 样本

版药典培养基适用性验证

版药典培养基适用性验 证 公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-

培养基验证文件 药 有 限 公司 制药有限公司 验证立项申请表

验证方案的审批 验证方案目录 1、概述 2、验证目的 3、验证范围 4、验证项目小组成员及职责 5、验证合格标准 6、试验材料 7、菌液制备 8、适用性检查 9、验证记录 10、验证结论及综合评价 计数培养基适用性检查的验证方案 1. 验证目的：

需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基是否适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数测定。 2. 参照标准：《中国药典》2015年版四部1105非无菌产品微生物限度检查法。 3. 验证项目：胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基的适用性检查。 4.验证小组人员及职责： 5. 合格标准：被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。 6. 试验材料： 6.1. 被验证产品：胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基。 6.2. 仪器设备： 6.2.1. YXQ-LS-100G型立式压力蒸汽灭菌器

6.2.2. GHT-00双人净化工作台 6.2.3. BSC-110011A2-X 生物安全柜 6.2.4. MJ-250I型霉菌培养箱 (20～25℃) 6.2.5. LRH-250生化培养箱 (30～35℃) 6.2.6. 电热恒温干燥箱 6.2.7微波炉 6.3. 验证用培养基 6.4. 验证用菌株：(第代) 7. 菌液制备 按6.4规定程序培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成约为50~100cfu∕ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含 0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制成约为50~100cfu∕ml的黑曲霉孢子悬液。 8. 适用性检查：

新版GMP培养基适用性检查验证方案课件.doc

培养基适用性检查 验证方案 文件编号：VMP-VV-501-00 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日

验证立项申请表

验证方案审批表

1.概述 通过验证以确认所采用的培养基适合于细菌、霉菌及酵母菌的测定及控制菌的检查，根据特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 2.验证目的及范围 为了确认所采用细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查的培养基是否符合微生物限度检查法的规定要求，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 3.验证风险评估 对于本次验证的执行进行了如下的风险分析： 4.验证前准备 4.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 4.2将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。

无菌移液管。 5.验证内容 5.1测试环境条件要求 所有检查在环境洁净度C级下的局部A级洁净度的单向流空气区域内隔离系统内进行，其全过程严格遵守无菌操作，能防止微生物污染。 5.2计数培养基 5.2.1验证用菌种及培养基： 5.2.1.1来源：食品药品检验所 5.2.1.2菌落计数用菌种 注：编号由菌种首字母-传代代数-配制日期组成。 5.2.2培养基及其制备方法：取市售的脱水培养基，分别按照规定方法进行配制后灌装于洁净的三角烧瓶中，然后加塞灭菌，在实验前加温熔化备用。 5.2.3菌液制备 5.2.3.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。5.2.3.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48小时，取此培养液1ml，加0.9％无菌氯化钠溶液至10ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，使菌数约为50～100cfu/ml，做活菌计数备用。

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立

牛奶中三种常见食源性致病菌快速检测方法的建立食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一,导致食源性疾病的有病原微生物、寄生虫及其代谢产物、天然毒素以及化学性有毒有害物质等等。微生物引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。 在发达国家70%～80%的细菌性食物中毒是由沙门氏菌引起的,在我国甚至 达到90%;引起沙门氏菌中毒的食品中,蛋类、奶类等动物性产品约占90%,沙门氏菌生存能力较强,可在乳制品中生存几个月。单增李斯特菌广泛存在于自然界中,且在冷藏温度4℃下依然能够生长,引起单增李斯特菌食物中毒的食品主要有: 奶及奶制品、肉制品、水产品、蔬菜及水果,其中以乳制品最为常见,单增李斯特菌能够给高风险人群带来严重的感染性疾病。 志贺氏菌又称痢疾杆菌,是引起人类细菌性痢疾中最为常见的食源性致病菌,该菌也是食品卫生相关法规及标准中要求必须检测的项目之一。本文以牛奶中常见的食源性致病菌单增李斯特菌、沙门氏菌和志贺氏菌为目标菌种,利用环介导等温扩增技术和高分辨率熔解曲线技术建立了多重LAMP检测体系和多重 HAND-HRM检测体系,结果如下:1.针对单增李斯特菌溶血素蛋白(hly)基因、沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因和志贺氏菌侵袭性质粒抗原H(ipaH)序列的高度保守序列设计引物,通过引物筛选分别建立了三种食源性致病菌的LAMP反应体系。 进一步经过引物筛选,及对影响反应效率和特异性的镁离子浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化,建立了多重LAMP反应体系。对多重LAMP反应体系进行特异性和灵敏度检测。 在特异性检测中含有目标菌的模板出现扩增,空白对照和非目标菌均未发生特异性扩增,提示该多重LAMP反应体系特异性强。在灵敏度检测中单增李斯特菌

无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程

无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程 目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。 范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。 依据：中国药典》2015年版 《药品生产质量管理规范》2010年修订 《中国药品检验标准操作规程》2010年版 责任：QC化验员对实施本规程负责。 内容: 1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。 2、材料及设备 2.1 生化培养箱 2.2 生物安全柜 2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供） 2.4 灭菌试管、灭菌注射器 2.5 0.9%无菌氯化钠溶液 2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。3、无菌检查培养基的适用性检查 3.1无菌性检查 取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。 3.2灵敏度检查 3.2.1菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），

并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104] 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B) 63501] 生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F) 98001] 黑曲霉[Aspergillus niger CMCC(F) 98003] 3.2.2菌液制备 3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备 3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3ml 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨，使之成为均匀悬液。 3.2.2.1.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。 3.2.2.1.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。 3.2.2.1.4 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌。 3.2.2.2 生孢梭菌菌悬液的制备 3.2.2.2.1取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30～35℃培养18～24小时，取一支灭菌中试管，用灭菌注射器吸取硫乙醇酸盐流体培养基中底部三分之二处的新鲜菌液1ml，加入

梅里埃快速病原体检测解决方案

梅里埃快速病原体检测解决方案多重呼吸道病原体检测 项目建议书 提供精准快速的病原体结果

流行病数据与现状 呼吸道感染： 呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。呼吸道感染通常由病毒、细菌、非典型病原体等引起，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择对应的治疗方案。呼吸道感染是临床的常见病，其发病具有着明显的季节性：甲型流感在中国北方多出现于每年1-2月，而在中部地区亦可多出现于6-8月，在南方地区则多现于每年的4-6月；而乙型流感则多发于寒冷季节。 中国各个地区流感发病率 表格引自Yu H等“Characterization of Regional Influenza Seasonality Patterns in China and Implications for Vaccination Strategies: Spatio-Temporal Modeling of Surveillance Data” 我国主要的流感病原体是甲型流感H1和H3型以及乙型流感。除了甲型流感和乙型流感之外，其他多种病原体也能造成呼吸道感染，比如鼻病毒、肠病毒、冠状病毒、腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒及呼吸道合胞病毒等。急性呼吸道感染的发生同人体免疫力降低有着直接的关系，儿童和老年人都是易感人群。一项针对儿童患者的流行病学研究发现：肠病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒是造成儿童急性上呼吸道感染的主要病原体。

引起儿童急性呼吸道感染的致病体 表格引自顾艳红等“儿童急性呼吸道感染夏季和冬季病毒病原学分析” 中国儿童普通感冒规范诊治专家共识（2013年）中指出，病毒的病原学地位突出,其中以鼻病毒最常见(30%~ 50%),其次为冠状病毒(10% ~15%)、呼吸道合胞病毒( 5 % ) 、副流感病毒( 5 % ) 、腺病毒( < 5 % ) 和肠道病毒( <5%)等。对于新生儿和低龄儿童，呼吸道合胞病毒具有非常强的传染性和致病性，因此对于呼吸道合胞病毒的爆发和医院内感染需要特别的重视；另外由于腺病毒造成的呼吸道感染往往病情较重，所以对于腺病毒感染的快速病原体确认也是十分重要的。 一项2015 年WHO 在12 个国家开展的调查显示，64% 的大众受调查者认为抗菌药物可以用来治疗病毒及病毒感染所导致的流感和普通感冒。常识的缺乏，导致了患者和一些医生，滥用抗菌药物。WHO的统计数据表明，中国真正需要使用抗生素的病人不到20%, 抗生素的不合理使用会引起细菌的耐药性，耐药性往往会导致很多严重感染治疗无效，给患者健康乃至生命造成重大影响. WHO曾发表全球抗菌素耐药性报告称，如果不能迅速采取措施应对这一问题，世界将迈向“后抗生素时代”，呼吁各国加强在抗生素耐药方面的合作。 病原体的明确诊断对于指导有效合理使用抗生素发挥着至关重要的作用, 这是遏制抗生素耐药出现的关键. 抗击抗生素耐药性需要涵盖全方面的临床诊断方案: 微生物鉴定和药敏试验, 感染性疾病筛查和主动监测,疫情管理和监测,细菌以及病毒感染的病原确定和分型. 2016中国儿童流感指南中提出，在流感病人出现症状的48小时之内使用奥司他韦（达菲）可以明显提高治疗成功率、缩短病程。非典型病原体，如社区性获得

病原微生物的检验项目及结果解释教程文件

病原微生物的检验项目及结果解释

病原微生物的检验项目及结果解释 微生物检查包括：细菌、真菌、衣原体、支原体及病毒等。这对于查明致病原因和选择用药十分重要。但除细菌和真菌外，直接查找方法比较复杂。细菌培养，采集血、痰、咽试子、大便、小便、创面分泌物等标本进行培养，看有无致病菌生长，正常应为阴性或少量非致病菌；真菌检查，标本涂片或培养，检出真菌为不正常。 病原微生物的检验主要是检测与l临床患者致病性有关的病原性微生物，对感染性疾病进行快速、准确地诊断，密切结合临床提出及时有效的治疗方案，防止微生物产生耐药性和医院内感染的发生。 基础知识 1.什么是微生物?什么是病原微生物? 微生物是需借助光学显微镜或电-y：显微镜放大观察到的结构简单，个体微小的生物的总称。微生物的种类很多，医学微生物尤其是临床微生物主要有细菌、病毒、真菌、支原体、衣原体等。 微生物在自然界中广泛存在，与人类和自然界其他生物共生共存，绝大多数对人类和自然界是有益的，只有少部分可以引起人类和动植物发生疾病，这部分微生物才称为病原微生物，比如结核分枝杆菌可引起结核病，痢疾杆菌可以引起痢疾等。 2.什么是细菌?细菌分哪几种? 细菌是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体，是大自然物质循环的主要参与者。其体积微小，以微米作为测量单位，无色半透明，只有经过染色才能观察到细菌的轮廓及其结构。经革兰染色，可将细菌分为两大类，即革兰阳性菌和革兰阴性菌。细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成，有的细菌还有夹膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。根据形状则可分为三类，即：球菌、杆菌和螺旋菌(包括弧形菌)。 3.什么是病毒?病毒分哪几种? 病毒是结构最简单、体积最微小(纳米)的一类非细胞型微生物，介于生命和非生命之间的一种物质形式，其必须严格寄生在活细胞内，含有单一种核酸即脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的基因组和蛋白质外壳，没有细胞结构，对抗生素不敏感，但对于干扰素敏感。按传播途径病毒可分为呼吸道病毒、胃肠道病毒、经性传播感染的病毒和狂犬病毒等。按感染部位与症状特征则分为肝炎病毒、出血热病毒、疱疹病毒、侵犯神经系统的病毒和肿瘤病毒等。

食源性致病菌快速检测方法研究报告

食源性致病菌快速检测方法研究报告 发表时间：2011-05-13T14:13:40.207Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：高友中 [导读] 目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。 高友中（湖南省岳阳县疾病预防控制中心 414100） 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0106-02 【摘要】目的应用酶联免疫吸附实验（ELISA）快速检测奶类及肉类制品中沙门菌。方法样品经增菌后，用ELISA法及国标法对样品中的沙门菌进行初步检测，并比较ELISA法检测结果与国标法灵敏性、特异性、符合率。结果检测200份奶类制品和肉制品，经ELISA法检测阳性率为8.3%，国标法阳性率为6.7%。ELISA法敏感性、特异性分别为100%、97%，与国标法符合率达99.3%。结论 ELISA法可快速、方便的对食品中沙门菌的污染情况进行初步检测，灵敏度高、特异性好，与国标法符合率高。适用于食品中沙门菌的初步检测。 【关键词】奶制品肉制品沙门菌 ELISA 沙门菌为常见的引起食源性疾病爆发的病原菌，在我国微生物性食物中毒中一直位居首位，而受沙门菌污染的奶、肉制品为造成人类感染的主要来源，因此沙门菌一直为医疗卫生、食品卫生及商检部门重点检验对象之一[1]。本研究采用ELISA法检测奶、肉制品中沙门菌，并与国标法进行比较研究，现报道如下： 1 材料与方法 1.1实验材料 奶、肉制品分别来自本市8家不同超市，包括70份奶及奶制品样本，60份肉及肉制品样本。取样均采取随机抽样的方法进行。每份样品250ml或250g，经无菌包装后置冷链保存送实验室检测。 缓冲蛋白胨水，氯化镁孔雀绿增菌液，四硫酸钠煌绿增菌液，亚硒酸盐胱氨酸增菌液，亚硫酸铋琼脂，DHL琼脂，HE琼脂，WS琼脂，SS琼脂，三糖铁琼脂，蛋白陈水、靛基质试剂，尿素琼脂（pH7.2)，氰化钾（KCN）培养基，氨基酸脱梭酶试验培养基，糖发酵管，ONPG培养基，半固体琼脂，丙二酸钠培养基，沙门氏菌因子血清。均按国标相关规定进行。 ELISA相关试剂均购自试剂公司。 1.2实验方法 样品按国标法相关规定预先增菌。样品处理后于36°C培养4h，转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液中，42°C18-24h，另取10ml转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，36°C18-24h。 ELISA法简要步骤如下：特异性抗沙门菌单克隆抗体包被，加入待见样品检测。显色于酶标仪上读取OD值。 国标法简要步骤如下：经增菌后，划线接种于亚硫酸铋琼脂平板和EHL琼脂平板。36°C培养18-24h，观察菌落生长情况。挑选可疑菌落接种于三糖铁琼脂，鉴别反应结果。如出现异常结果，按国标相关规定选择补做甘露醇和山梨醇试验，ONPG等。 1.3数据分析 参考田素娟[1]等的方法进行。即利用检验通用的计算方法，并国标法比较实验的敏感性、特异性、符合率。 2 结果 2.1ELISA及国标法检测结果 用ELISA法同步检测份奶、肉制品的沙门菌污染情况，采用国标法进一步验证，结果见表1。 表1沙门菌污染情况检测 2.2ELISA法与国标法敏感性、特异性、符合率计算结果 表2ELISA法与国标法比较 3 讨论 3.1常规检测沙门菌方法 目前，沙门菌常用检测方法有：（1）酶快速反应检测技术。包括快速酶促反应显色培养基及自动化微生物分析仪两种方法。VITEK AMS自动微生物检测系统对细菌鉴定是基于细菌的微量生化反应，可鉴定405种细菌。（2）以免疫学为基础的检测技术。包括酶联免疫吸附实验（ELISA）；免疫磁分离技术，如王海明[2]等报道的使用抗沙门氏菌免疫磁珠经增菌后于VITEK全自动生化鉴定仪和荧光PCR分子检测确认；免疫胶体金技术等。（3）以核酸为基础的检测技术，如杨俊超[3]等报道的使用实时荧光定量PCR与常规PCR比较研究，其敏感性、特异性均较好；依赖PCR的DNA指纹图谱技术；随机引物扩增DNA多态性（RAPD）；基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增；多重PCR检测技术；NASBA；基因芯片技术等。 3.2本研究采用检测方法 本研究采用ELISA法快速检测奶及奶制品、肉及肉制品中沙门菌的污染情况。其敏感性、特异性较高，且与国标法符合率较高。一般24h 之内可以出检测结果。其不足之处在于：（1）不能定量检测沙门菌的含量，只能做定性分析，即是否存在沙门菌污染，但不能测得污染量的大小。后续研究考虑通过设置标准沙门菌对照（蛋白含量已知）的情况下，设立不同稀释度，然后比较样品各组OD值，用统计软件作出标准曲线，进而推算出沙门菌含量。（2）检测结果不太稳定，有可能出现假阳性结果。ELISA实验普遍存在抗体效价下降很快的通病，如

培养基适用性验证

培养基适用性 验证 方案起草人： 方案审核人： 方案批准人： XXXXX药业股份有限公司

目录 1. 验证目的 (2) 2. 参照标准 (2) 3. 验证项目 (2) 4. 验证小组人员及职责 (3) 5. 验证可接受的标准 (3) 6. 验证步骤 (3) 7. 菌液制备 (6) 8. 适用性检查 (6) 9. 控制菌检查 (7) 10. 操作方法 (8) 11.结论 (11)

1. 验证目的： 需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基及控制菌培养基应进行培养基的适用性检查。本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数及测定和控制菌适用性检查。 2. 参照标准：2015版中国药典微生物限度检查法。 3. 验证项目：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基的适用性检查和控制菌适用性检查。 4.验证小组人员及职责： 4.1验证小组人员: 4.2验证人员职责及要求 4.2.1按验证方案及相关文件实施验证。 4.2.2认真观察并做好验证原始记录。 4.2.3对实施验证的结果负责。 4.3验证中各部门的职责 4.3.1验证领导组职责 4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。 4.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。 4.3.1.3负责验证方案的批准工作。 4.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。 4.3.1.5负责验证报告的批准工作。 4.3.2验证工作小组职责 4.3.2.1负责验证方案的起草工作。 4.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。 4.3.2.3负责验证方案的实施。

4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。 4.3.2.5参与验证结果的评价工作。 4.3.3质量部职责 4.3.3.1负责验证方案的审核工作。 4.3.3.2负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。 4.3.3.3负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项 检验工作负责。 4.3.3.4负责验证资料和报告的审核工作。 4.3.3.5负责验证文件回收、归档管理工作。 5. 合格标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌 落形态大小与对照培养基上的菌落一致。 6. 试验材料： 6.1. 被验证产品：溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、肠道菌增菌液培养基、RV沙门菌增菌液培养基、麦康凯琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、麦康凯液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 6.2. 仪器设备： 6.2.1. LXD型压力蒸汽灭菌器 6.2.4.JMP-250霉菌培养箱(20～25℃) 6.2.5. SHP-250生化培养箱(30～35℃) 6.2.7 101-1电热鼓风干燥箱

普通手术室常用细菌学监测方法

空气培养是通过空气菌落测定实现的，空气菌落测定可作为一种环境清洁的指标。 1人员着装要求： 检测者需要洗手戴口罩和帽子 2空气培养目的 检测手术部空气在静态下是否达到空气卫生学标准。 3采样时间 每月监测一次，在消毒处理后关好门窗，在无人走动的情况下，静止10min 进行采样。 4采样方法 检测者需要洗手带口罩和帽子，根据采样原理采用平板暴露法：在消毒处理后，操作前进行，室内面积≤30m2对角线内、中、外处设3点，内外点布位距墙壁1m处，室内面积＞30m2设4角及中央5点，4角的布点部位距墙壁1m处。空气中细菌等微生物可随尘粒一起下降，在室内各采样点处放好营养琼脂平板，采样高度距地面0.8～1.5m，采样时，将平板盖打开搭在平皿边缘上，暴露5min，盖好平皿盖。 5注意事项 （1）布点位置要正确，严格按照房间面积、布点要求及采样方法进行操作。（2）采样后及时送检，48小时出结果。（可请护理服务中心送检，内线电话：542） （3）培养采样者应及时将结果取回，结果取回后如无异常应将检验报告单依次粘贴在A4纸上，并注明培养房间和培养日期做好完整记录，如有超标应及时通知护士长，并查找原因，复检。 6检测结果判断 空气培养标准值小于或等于200cfu/m3

1人员着装要求：检测者需要洗手戴口罩和帽子 2检测内容 （1）手术间的物体表面及可能有可能与患者接触的物体表面： 每月培养一次。包括治疗车、治疗台、无菌灯、输液架、手术间门把手、无菌器械台、麻醉机、吸引器瓶、麻醉床、手术间墙壁等。 （2）手卫生培养： 每月培养检测一次以同一台手术至少五人为一组，包括器械护士、手术医师，若一台手术人员不足五人，可两台手术合并5-6人做手培养。 （3）腔镜器械： 每月培养检测一次，培养项目3-5个，镜头、腔镜管道为每月必做项目，其余手术器械随机抽查 （4）无菌物品： 每月培养检测一次。包括一次性无菌物品及高压灭菌后的无菌物品。一次性无菌物品及高压灭菌后的无菌物品每月随机抽取至少3例，不得检出任何微生物。（5）植入性器械： 每月抽查一次骨科外来植入性器械包括钉子和钢板及专用器械。 2采样方法： （1）物体表面主要采用棉式子涂抹法。采用浸有含相应中和剂的无菌洗脱液的棉拭子，取出棉拭子，先在酒精灯外焰进行烧灼后，直接在物体表面按一定顺序滚动式涂抹，后将棉拭子入装有含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。（2）手部培养方法，被检测者须五指并拢，取出棉拭纸先在酒精灯外焰进行烧灼后以手掌到手指尖为平面S型滚动式涂抹，涂抹后将棉拭子入装有含相应中和剂的无菌洗脱液试管内，立即送检。 3注意事项： （1）培养不得检测出任何微生物。 （2）采样后及时送检，48小时出结果。 （3）结果出来后将检验报告单依次粘贴在A4纸上，并注明培养房间和培养日期做好完整记录。

PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/0c16626023.html, PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用 作者：庄璐 来源：《现代食品·上》2017年第05期 摘要：现阶段，我国正以飞快的速度发展，食品微生物检测也由传统的培养方法向分子 水平过渡。通过对聚合酶链式反应（PCR）技术的研究分析可知，可以利用这种先进的快速检测技术来检验食品中的食源性致病菌，本文归纳总结了几种不同的PCR技术，旨在提供一些关于食品微生物的快速监测技术。 关键词：PCR技术；食源性致病菌；检测；应用 Abstract：China is developing at a fast pace and the detection of food microorganisms is also moving from the traditional cultivation method to the molecular level. Based on the polymerase chain reaction （PCR） for certain research analysis， can be verified in food borne pathogens using rapid detection technology which is advanced， this paper summarizes several different PCR technology，aims to provide some food on microbial monitoring technology. Key words：PCR technology； Foodborne pathogenic bacteria； Detection； Application 中图分类号：R155.5 改革开放以来，我国现代科学技术以惊人的速度发展，人们的生活水平也在逐渐提高，最直接的结果就是人们越来越重视食品，有着越来越高的要求，但近年来，食品安全问题一直威胁着人们的生命健康，这一问题已经受到了人类的高度重视。2007年，在某些速冻食品中检 测出致病菌；在我国经常提到的地沟油事件层出不穷；让人们谈虎色变的三鹿奶粉事件等，每一件事情都在提醒着人们食品安全问题的重要性和严重性。其中，微生物检测是衡量食品卫生质量的重要指标之一，因此，研究食品微生物检测的快速检测技术具有十分重要的意义。 1 传统的食源性致病菌检测方法 1.1 增菌 致病菌在食品中有着较低的污染水平，所以要以增菌或增菌的步骤为前提来根据国家标准检测食品致病菌，前增菌的实质就是把处于濒死状态的致病菌放在无选择性的培养基中，使其恢复活力，而增菌与之不同，增菌是利用选择性培养基，目的是让微生物大量繁殖，这样就会抑制其他细菌，从而为下一步的分离培养奠定基础。 1.2 分离培养

培养基适用性检查方法的验证.

培养基适用性检查方法的验证 文件编号 制订 日期 审核 日期 批准 日期 云南云科药业有限公司A：验证方案 方案制订 制订日期 方案编号 方案审核 审核日期 方案批准 批准日期 云南云科药业有限公司

目录 1．验证项目名称 2．验证组织 3．概述 4．验证目的 5．参照标准 6．验证程序 7．验证报告、评价及批准 1．验证项目名称：培养基适用性检查方法的验证 2．验证组织： 姓名部门职务分工 3．概述： 通过验证以确认所采用的方法适合于培养基适用性检查。根据培养基及菌的特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件

进行培养基适应性检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 4．验证目的： 细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行培养基的适用性检查。验证的目的是确认营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基适合细菌、霉菌及酵母菌数测定。（确认所采用的方法适合于培养基适应性检查，为了保证检验结果的准确性，对现有的检验方法进行验证。） 5．参照标准： 2010年版《中国药典》二部附录ⅪJ 计数培养基的适用性检查。 6.验证程序： 6.1适用范围：适用于培养基适用性检查。 6.2被验证产品：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基。 6.3试验材料： 6.4试验菌株：

6.5合格标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。 6.6验证方法： 培养基在使用前应进行适用性的检查，通过对被检培养基上的菌落与对照培养基上的菌落比较，以确认所采用方法的可行 性。 6.6.1菌液的制备： 6.6.1.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述营养肉汤新鲜培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5～10-7约为50～100cfu/ml 的菌悬液备用。 6.6.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48小时。取上述改良马丁新鲜液体培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml的菌悬液备用。 6.6.1.3接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，于23～28℃培养5～7天，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu/ml的孢子悬液备用。 6.6.2菌液的计数：（每种菌液接种2个平皿）