蓝莓果酒专用酵母的分离_筛选及鉴定_伍鹤
DOI ：10．13995/j．cnki．11－1802/ts．201412012
蓝莓果酒专用酵母的分离、筛选及鉴定
伍鹤，李珂，赵琳，刘安然，王远亮
（湖南农业大学食科院食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙，410128）
摘
要
为筛选得到适合蓝莓果酒发酵的酵母菌株，对来自不用品种的蓝莓成熟果实、蓝莓叶及蓝莓果园的土
壤进行筛选，共分离得到122株酵母菌；采用镜检和杜氏管发酵法初筛，产酒精能力、耐性能力复筛，并选用葡萄酒酿酒酵母（K 酵母）对比，
最终确定BBF-17为最优菌株。采用18S rDNA 序列鉴定以及系统发育树分析，对选定酵母菌进行分子生物学鉴定，结果显示BBF-17与酿酒酵母（EU649672.1）最为接近，相似度达99%，该菌株鉴定为酿酒酵母。关键词
蓝莓果酒，酵母菌，筛选，鉴定，18S rDNA
第一作者：硕士研究生（王远亮教授为通讯作者，E-mail ：yuanlia-ngw@gmail．com ）。
收稿日期：2014－07－02，改回日期：2014－09－15
蓝莓，又名笃斯；杜鹃花科越桔属多年生灌木。果实中含有丰富的蛋白质、果糖、膳食纤维、维生素以及多酚、黄酮、花青素、SOD 、叶酸、单宁类物质，酸甜可口、具有独特的风味，对癌症、冠心病、中风［1］、神经和记忆衰退、老年痴呆［2］、泌尿系统疾病、近视等［3］慢性疾病有较强的预防和改善作用，是良好的食源性抗氧化剂。
目前蓝莓酒的酿造过程中，大多采用葡萄酒通用酵母，几乎没有适合蓝莓果酒发酵的专用酵母。由于不同水果成分差异大，这就在一定程度上造成了蓝莓果酒风味偏于平淡，无法突出蓝莓特有的口感和香气。
本实验从不同品种蓝莓叶、根部土壤以及果实自发酵醪液中分离，通过产酒精、耐受能力等试验，筛选出适合蓝莓果酒发酵的优良酵母；通过18S rDNA 序列分析及构建系统发育树，对筛选菌株进行鉴定，旨在推动蓝莓酒产业的工业化生产，也为构建特色型优良蓝莓酒酵母提供亲本和基因资源。
1
材料与方法
1.1
材料与试剂
样品的采集：从位于张家界的蓝莓基地中摘取成
熟的蓝莓（南方高丛、兔眼杰兔、兔眼灿烂、圆蓝）、蓝莓叶及相应蓝莓根部土壤样品。
对照菌株（K 酵母）：安琪葡萄酒活性酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；DNA 提取及PCＲ相关试剂，
美国Genview 公司；DNA Marker ，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；其他试剂为国产分析纯。
PDA 培养基：200g 土豆切碎，加水约1L ，煮沸20min ，4层纱布过滤，于滤液中加20g 葡萄糖，氯霉素0.1g ，加蒸馏水定容至1L ；固体培养基中加入1.5%的琼脂，121?下灭菌20min 。
蓝莓汁：蓝莓（圆蓝）清洗、破碎、酶解、过滤，总糖含量：150.4g /L ，
总酸（以酒石酸计）含量：12.6g /L 。设备与仪器：恒温培养箱，水浴锅、铁架台、滴定管、冷冻离心机、无菌操作台、PCＲ仪、电泳仪等。1.2实验方法1.2.1
酵母菌的初筛
将新鲜蓝莓果实打浆，置于28?恒温培养箱中自然发酵；当发酵醪液中产生大量气泡并有明显酒味时，即可分离酵母菌；约3 5d 。取上述蓝莓醪液用无菌水梯度稀释成10－1 10－7七个梯度，取最后3个梯度进行平板涂布分离，每个梯度3个平行；涂布量0.1mL 。
取蓝莓叶及土壤各2g ，用无菌水振荡稀释至10－2（于500mL 三角瓶），再稀释至10－6。用移液枪分别吸取10－3 10－6三个梯度的样液100μL 涂布PDA 平板，每个梯度3个平行。
所得样品于28?恒温培养48h 。长出菌落后，挑取具有典型酵母菌菌落特征的单菌落划线分离纯化6 8次，共得到酵母菌122株。经镜检为纯菌后，转接PDA 斜面于4?保存，每2个月活化1次，以保持其活性。1.2.2酵母菌的复筛
1.2.2.1
酵母菌产气性能比较
采用杜氏管发酵法［4］。将斜面菌种接种1环于PDA液体培养基中，28?下摇床活化12h；再将活化
2代的酵母以5%的量接种于10mL内置杜氏小管灭菌蓝莓汁中，28?静置发酵48h，记录产气时间及产气量。实验重复3次。
1.2.2.2酵母菌的产乙醇能力比较
蓝莓汁发酵法：将产气性能良好的菌株活化，以5%的量接种于200mL灭菌蓝莓汁中，28?发酵7d，采用酒精计法［5］测定其乙醇体积分数并感官评定。以K酵母对比，重复3次。
1.2.2.3酵母菌耐糖、耐酒精、耐酸、耐SO
2
性能比较采用杜氏管发酵法，将上述筛选合格的菌株活化后分别以5%的量接入到不同糖含量（200，250，300，350，400g/L）、不同乙醇体积分数（8%，10%，12%，14%，15%）、不同pH（4.0，2.98，2.03，1.48，0.98）、
不同SO
2
质量浓度（100，150，200，250，300mg/L）的10mL带杜氏小管的灭菌蓝莓汁中，28?下培养5d，观察杜氏小管的产气情况，比较各株酵母对糖、乙醇、
pH和SO
2
的耐受能力，进而确定适合蓝莓果酒酿造的酵母菌株。以K酵母对比，实验重复3次。
1.2.2.4酵母产香能力比较
将活化的酵母以5%的量转入新鲜蓝莓果汁中，28?下发酵10d。打开瓶盖，轻轻晃动，选择特征香味明显的菌株［6］。以K酵母对比，实验重复3次。1.2.3蓝莓果酒生产工艺流程
蓝莓→清洗、破碎→酶解→过滤→测糖、酸含量→调糖→主发酵→陈酿→巴氏灭菌→成品→取样分析、评价
1.2.4不同酵母发酵果酒品质比较
将活化的酵母以5%的量接入糖含量为210g/L 的蓝莓汁中，于28?发酵30d，发酵结束后测定酒精度、残糖、干浸出物、总酸等理化指标，并邀请6位专家进行感官评定。蓝莓汁、蓝莓酒理化指标的测定以及感官评价均按GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求执行。
1.2.5分子生物学鉴定
1.2.5.1DNA模板的制备
采用石英砂破壁法提取酵母总DNA［7］。
1.2.5.2DNA的PCＲ扩增及序列测定
根据酵母18S rDNA保守区域设计引物。上游
引物，D
2
Ｒ：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3'；ITS-5：5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'。采用50μL反应体系：10?PCＲ缓冲液（含25mmol/L Mg2+） 5.0μL，dNTPs（10μmol/L）1.0μL，引物（20μmol/L）各2μL，Taq聚合酶（2U/μL）1μL，DNA模板1μL，超纯水38μL。PCＲ循环参数：95?预变性4min，95?变性15s，51?退火30s，72?延伸75s，体系运行30个循环，最后72?延伸6min［8］。PCＲ产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。产物送北京鼎国昌盛生物技术有限公司测序。
1.2.5.3结果及数据分析
将测序获得的18S rDNA序列于美国国立生物技术信息中心（NCBI）利用Blast软件进行核酸比对分析。利用Clustal进行序列比对，MEGA4.1构建系统发育树并进行亲缘关系分析。
2结果与分析
2.1酵母菌初筛
从不同蓝莓的生长环境及果实中，经分离和纯化共得到酵母菌122株，其中蓝莓果实占52.5%，蓝莓叶占33.6%，土壤来源仅为13.9%。主要原因可能是样品采集时处在蓝莓成熟期，6月下旬当地温度较高，阳光比较充裕，蓝莓果实中的糖分含量比较高，利于酵母菌的生长和繁殖，易于筛选到耐受性高的菌种；土壤相对比较干燥，缺乏必要的营养成分，故酵母菌的数量相对较少。
2.2酵母菌复筛
2.2.1酵母菌产气性能比较
分离菌株的产气结果如表1所示。于28?下恒温静置发酵48h后，有12株酵母产气充满整个杜氏小管，并闻到淡淡的酒香味，说明这12株酵母生长、起酵能力较强，可能具有较高的发酵效率和发酵力。其他菌株因在48h产气无法充满杜氏小管，表明其生长和发酵能力有限，无法满足果酒发酵对酵母菌的要求。将上述筛选获得的菌株进行下一级筛选。
表1筛选菌种的杜氏小管产气实验
Table1Gas-producing capabilities of isolated yeast strains observed in Durham fermentation tubes
发酵时间/h产气情况菌株数
24
++
+++
++++
13
7
10
48
++
+++
++++
15
14
12注：“++”：产气量为杜氏管的1/2；“+++”：产气量为杜氏管的3/4；“++++”：气体充满整个杜氏管。
2.2.2酵母菌产乙醇能力比较
共有3株酵母产乙醇体积分数大于8%，编号分别为BBL-21，BBF-09，BBF-17，乙醇体积分数为8.1%、8.1%、8.4%；表现出了与K酵母相当的发酵能力（8.3%）。达到了果酒酵母对于乙醇发酵能力的要求，选用这3株酵母进行下一步筛选。
2.2.3酵母耐受性试验
2.2.
3.1酵母菌糖耐受性试验
由表2可知，所选酵母在糖含量为40%时，仍可以良好地生长，并且在12h时开始产气，24h内气体充满整个杜氏小管，表现出了和K酵母一样优秀的耐糖能力，完全达到果酒酵母的要求。
表2酵母菌糖耐受试验
Table2Gas-producing capabilities of isolated yeast strains at different sugar concentration levels
编号
糖含量/（g·L－1）200250300350400
BBL-21++++++++++++++++++++ BBF-09++++++++++++++++++++ BBF-17++++++++++++++++++++ K++++++++++++++++++++
注：“++++”：气体充满整个杜氏管。
2.2.
3.2酵母菌在不同体积分数乙醇的蓝莓汁中产气情况
由表3可以看出，3株目标菌对乙醇均有较好的耐受耐性；在乙醇体积分数低于10%时，均能在24h 内产气，起酵无明显延迟；BBF-09和BBF-17能耐受14%的乙醇，高于K酵母。一般发酵果酒的乙醇体积分数在6% 14%，所选菌株符合要求［10］。
表3酵母菌在不同体积分数乙醇中的产气情况
Table3Gas-producing capabilities of isolated yeast strains at different ethanol concentration levels
编号
乙醇体积分数/%
8%10%12%14%15%
K+++++++++－－
BBL-21+++++++++－－
BBF-09+++++++++++－
BBF-17+++++++++++－
注：“－”：不产气；“+”：开始产气；“++”：产气量为杜氏管的1/2；“+++”：产气量为杜氏管的3/4；“++++”：气体充满整个杜氏管。
2.2.
3.3酵母菌在不同pH蓝莓果汁中的产气情况
BBF-09和BBF-17的耐酸性试验结果见表4。2菌株在pH2.98时依然表现出很强的发酵能力，优于K酵母（起酵延迟24h）；BBF-17在pH2.03时依然能保持较强的活性，适宜蓝莓果汁高酸度的特点。
表4不同pH条件下酵母菌的产气情况Table4Gas-producing capabilities of isolated yeast
strains at different pH conditions
标号
pH
4．00 2.98 2.03 1.480.98 K++++++++－－－
BBF-09+++++++++－－
BBF-17++++++++++－－注：“－”：不产气；“+”：开始产气；“++”：产气量为杜氏管的1/2；“+++”：产气量为杜氏管的3/4；“++++”：气体充满整个杜氏管。
2.2.
3.4酵母菌在不同质量浓度SO
2
蓝莓果汁中的产气情况
由表5可知，所选菌株对SO
2
菌有较好的耐受能
力；SO
2
浓度达到250mg/L时，K酵母的产气速度明
显减慢，延迟约24h，但300mg/L的SO
2
对BBF-09和BBF-17的起酵速度无明显影响。国标对于果酒
中残留SO
2
的最大限量为250mg/L，在符合国家标准的要求下，筛选菌株能最大程度满足酿造要求。
表5酵母菌在不同质量浓度SO
2
蓝莓汁中产气情况Table5Gas-producing capabilities of isolated yeast
strains at different SO
2
concentration levels 编号
SO2质量浓度/（mg·L）
100150200250300 K++++++++++++++++++++ BBF-09++++++++++++++++++++ BBF-17++++++++++++++++++++注：“－”：不产气；“+”：开始产气；“++”：产气量为杜氏管的1/2；“+++”：产气量为杜氏管的3/4；“++++”：气体充满整个杜氏管。
2.2.4酵母菌产香能力比较
果酒酵母应具有较强的产芳香酯类能力，所以在其他标准相当的情况下，选择产酯能力较强的酵母，对上述3株酵母进行产香比较［10］，K酵母和BBF-09香味平淡，BBF-17具有明显的蓝莓特征香味，香气协调、清新，该菌株来源于蓝莓（兔眼杰兔）果实自发酵。
2.3不同酵母对蓝莓酒品质的影响
2.3.1不同酵母发酵蓝莓酒的理化指标
由表6可知，3种菌株发酵蓝莓酒理化指标差异不明显。与BBF-09以及对照K酵母相比，BBF-17发酵果酒中乙醇含量相对较高，残糖含量较低；总酸以
及干浸出物含量差异不大，表现出较高的糖降解率和产乙醇能力。
表6不同酵母发酵蓝莓酒的理化指标
Table 6
Physico-chemical indexes of bluebery wine fermented by different yeast strains
菌种乙醇体积分数/%残余总糖/（g ·L －1）总酸/（g ·L －1）干浸出物/（g ·L －1）BBF-1712.4?0.5 5.3?0.67.5?0.320.8?0.9BBF-0911.5?0.37.6?0.77.7?0.420.2?0.8K
11.3?0.4
7.7?0.6
7.7?0.4
20.2?0.8
2.3.2不同酵母发酵蓝莓酒的感官指标
由表7可知，目标菌株发酵的果酒在外观上并无显著差异，但在香气、口感以及果酒的典型性方面，BBF-17显著优于BBF-09及对照菌株，且所发酵果酒香味最为突出，风味最佳，综合实验结果，确定酵母BBF-17为最佳酿酒酵母，进行分子学鉴定。
表7
不同酵母发酵蓝莓酒感官指标Table 7
Sensory indexs of blueberry wine fermented
by different yeast strains
菌种色泽香气口感典型性BBF-17紫红透明浓郁的酒香和果香酒味醇厚、圆润、柔和典型BBF-09紫红透明酒香明显，果香味淡
爽口、酸味突出
一般
K
紫红透明
特征香味不突出酒味烈，有涩味不明显
2.4分子生物学鉴定
以石英砂破壁法提取酵母菌基因组DNA ，以
D 2Ｒ/ITS-5为引物扩增酵母18S rDNA
的ID 区，扩增的片段长度大约为1500bp （图1）。
图1BBF-17酵母模板PCＲ产物琼脂糖电泳图Fig.1
PCＲproducts by agarose electrophoresis
of yeast BBF-17
将得到的序列在NCBI 中进行同源序列检索，得到亲缘关系相近酵母的相关信息，以Clustal 进行多重序列比对，采用MEGA 软件构建系统发育树，发现BBF-17与酿酒酵母属Saccharomyces cerevisiae 具有最高的18S rＲNA
基因序列相似性（99%），结果如图2所示，故将BBF-17鉴定为酿酒酵母。
图2BBF-17酵母菌的18S rDNA 系统发育进化树
Fig.2
The phylogentic tree for 18S rDNA system of yeast BBF-17
3讨论
果酒研究的热点之一就是选育出适合特定水果
发酵的优良内生酵母，酵母来源一般包括成熟果实的果肉、果皮、自发酵果酒，以及果树叶和果园土壤等相
关环境。目前已有学者从桑葚［9］、石榴［11］、猕猴桃［12］、杨梅［13］等常见水果中筛选出适宜不同水果发
酵的特定酵母，并对相关发酵、生产工艺进行了优化，取得了较好成效。而在特定蓝莓酒酿造酵母筛选方面，则很少见诸报道。本文在借鉴前人研究的基础
上［14］，对蓝莓果酒酿造酵母的来源进行了一个比较
全面、细致的筛选，分离鉴定出能突出蓝莓果酒独特风味的优良酵母BBF-17。该酵母活力高，在糖度35?Bx、乙醇体积分数为14%、pH2.03、SO
2
300mg/L 的条件下仍具有良好的生长能力，在蓝莓果汁中起酵快、发酵能力强，所发酵蓝莓酒酒精度较高、残糖含量低，香气浓郁，风味佳，为良好的蓝莓酒酿造酵母。经18S rDNA测序及系统发育树分析，鉴定为酵母属酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但有关该酵母的生理生化及发酵工艺特性还有待进一步研究。
参考文献
［1］Cantín C M，Minas I S，Goulas V，et al.Sulfur dioxide fu-
migation alone or in combination with CO
2
-enriched atmos-phere extends the market life of highbush blueberry fruit
［J］．Postharvest Biology and Technology，2012，67：84－
91.
［2］Giongo L，Poncetta P，Loretti P，et al.Texture profiling of blueberries（Vaccinium spp.）during fruit development，
ripening and storage［J］．Postharvest Biology and Technol-
ogy，2013，76：34－39.
［3］Shi J，Pan Z，McHugh T H，et al.Drying and quality char-acteristics of fresh and sugar-infused blueberries dried with
infrared radiation heating［J］．LWT-Food Science and
Technology，2008，41（10）：1962－1972.
［4］刘贞，刘小翠，赵思明，等.发酵米浆中高发酵性能酵母
菌和乳酸菌的筛选和鉴定［J］．食品科学，2010，31（7）：
232－235.
［5］GB/T15038－2006.葡萄酒、果酒通用分析方法［S］．［6］陈文学，胡月英，刘四新，等.腰果梨果酒酵母的分离和筛选［J］．食品科学，2010，31（5）：147－149.
［7］Stirling D.DNA extraction from fungi，yeast，and bacteria ［M］．Totowa，NJ：Humana Press Inc，2003：53－54.［8］Ｒos-Chumillas M，Egea-Cortines M，Lopez-Gomez A，et al.Evaluation of a rapid DNA extraction method to detect
yeast cells by PCＲin orange juice［J］．Food Control，
2007，18（1）：33－39.
［9］赵祥杰，杨荣玲，肖更生，等.桑椹果酒专用酵母的筛选及鉴定［J］．中国食品学报，2008，8（1）：60－66.［10］Ｒainieri S，Pretorius I S.Selection and improvement of wine yeasts［J］．Annals of Microbiology，2000，50（1）：
15－32.
［11］常景玲，邓小莉，王斌，等.石榴果酒酵母的分离及发酵工艺［J］．中国农学通报，2010，26（20）：90－93.［12］周一琴，罗安伟，刘兴华，等.猕猴桃酒天然优良酵母的筛选［J］．中国酿造，2008，27（1）：63－65.［13］谢建华，庞杰，何佳滨，等.杨梅汁中酿酒酵母的分离，鉴定及生长特性的研究［J］．中国农学通报，
2011，27（14）：64－68.
［14］王英，周剑忠，朱佳娜，等.蓝莓自然发酵酒中优良酵母菌的筛选及鉴定［J］．中国食品学报，2013，13
（4）：202－206.
Separation，screening and identification of special yeast for blueberry wine WU He，LI Ke，ZHAO Lin，LIU An-ran，WANG Yuan-liang
（The Key Laboratory of Food Science and Biotechnology，College of Food Science and Technology，
Hunan Agricultural University，Changsha410128，China）
ABSTＲACT In order to obtain yeast suitable for the fermentation of blueberry wine，a total of122yeast strains were isolated from different blueberry fruits，leaves，and orchard soil.After screening with microscopy and duchenne tube fermentation，a yeast designated as BBF-17was found to show excellent tolerance and alcoholic yield compared with the others and K yeast.Based on18S rDNA sequences analysis and phylogenetic analysis，the results from mo-lecular biological identification showed that it was very similar to Saccharomyces cerevisiae（EU649672.1）with simi-larity of99%.So the strain was identified as Saccharomyces cerevisiae.
Key words blueberry wine，yeast，screening，identification，18S rDNA
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
生物化学实验五 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
实验五酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 一、目的要求 学习和掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法；了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 二、实验原理 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 三、器材与试剂 1〉材料 酵母粉。 2〉器材 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、量筒、吸管、洗耳球、漏斗、滴管、试管、试管架、烧杯、离心机、滤纸、试管夹。 3〉试剂 (1) 0.04mol/L氢氧化钠溶液。 (2)酸性乙醇溶液：将0.3ml浓盐酸加入30ml的乙醇中。 (3)95%乙醇。 (4)乙醚。 (5)
1.5mol/L硫酸溶液。 (6)浓氨水。 (7) 0.1mol/L硝酸银溶液。 (8)三氧化铁-浓盐酸溶液： 将2ml 10%三氧化铁溶液(用FeCl 3·6H 2O配制)加入到400ml浓盐酸中。 (9)苔黑酚乙醇溶液： 溶解6g苔黑酚于100ml 95%乙醇中。 (10)定磷试剂。 a.17%硫酸溶液： 将17ml浓硫酸(比重 1.84)缓缓加入到83ml水中。 b. 2.5%钼酸铵溶液：将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。 c.10%抗坏血酸： 将10g抗坏血酸溶于100ml水中，储于棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则失效。 临用时将上述3种溶液与水按比例混合：17%硫酸溶液︰ 2.5%钼酸铵溶液︰10%抗坏血酸︰水=1︰1︰1︰2(体积分数)。
四、实验步骤 1〉RNA提取 将10g酵母悬浮于90ml 0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至150ml 锥形瓶中。在沸水浴上加热30min后，冷却。(3000r/min)离心10分钟，将上清液缓缓倾入30ml酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，(3000r/min)离心5分钟。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次，每次10ml。乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至漏斗中过滤。沉淀即为粗RNA，可在空气中干燥。作鉴定或测定含量用。 2〉鉴定 取200mg提取的RNA，加入 1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 (1)嘌呤碱： 取水解液1ml加入过量浓氨水，然后加入约1mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 (2)核糖： 取一支试管加入水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2ml和苔黑酚乙醇溶液 0.2ml。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 (3)磷酸： 取一支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1ml。在沸水浴中加热10min，观察若溶液变成蓝色，说明有磷酸存在。 五、结果处理
果酒果醋的制作习题
果酒和果醋的制作同步练习 1.利用酵母菌醇酒时，从开始便持续向发酵罐内通往氧气，结果是（） A.酵母菌大量死亡，酒精减产 B.酵母菌数量不变，酒精产量不变 C.酵母菌数量增多，酒精减产 D.酵母菌数量增多，不产生酒精 2.单细胞绿藻的培养液和单细胞酵母菌的培养液，所含成分的最大的区别是（） A.前者必须含有有机成分 B.后者必须含有有机成分 C.前者必须通往氧气 D.后者必须通往氧气 3.将水果放在密封的地窖中，可以保存较长的时间。地窖影响水果代谢的原因是（） A.温度恒定，水果抵抗虫害的能力强 B.温度适宜，容易保持水分 C.黑暗无光，不易引起早熟 D.二氧化碳浓度增加，抑制呼吸作用 4.现有一瓶葡萄糖溶液，内有适量酵母菌，经测定瓶中放出的二氧化碳与氧气体积之 比为5：3，这是因为（） A.有1/4的在进行有氧呼吸 B.有1/2的在进行有氧呼吸 C.有1/3的酵母菌在进行无氧呼吸 D.有2/3的酵母菌在进行无氧呼吸 5.将酵母菌的培养液由富氧状态变为缺氧状态，下列过程加快的一项是（） A.葡萄糖的利用 B.二氧化碳的释放 C.丙酮酸的氧化 D.ATP的生成 6.酵母菌生长的最适温度是（） A.10℃左右 B.20℃左右 C.30℃左右 D.40℃左右 7.到了冬季，酵母菌进入休眠状态，存在形式是（） A.孢子 B.芽孢 C.受精卵 D.精子 8.醋酸菌的代谢类型是 A.自养需氧 B.自养厌氧 C.异养需氧 D.异养厌氧 9.当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇直接变为（） A.醋酸 B.乙醛 C.乙酸 D.乙烯 10.关于酵母菌的叙述，不正确的是（） A.酵母菌是单细胞真核生物 B.酵母菌的同化作用方式是自养型 C.酵母菌可以进行出芽生殖，也可以进行孢子生殖 D.酵母菌可以进行有氧呼吸，也可无氧呼吸 11.下列哪种条件下，醋酸菌将葡萄汁中的糖分分解成醋酸（） A．氧气、糖源充足 B．氧气充足、缺少糖源 C．缺少氧气、糖源充足 D．氧气、糖源都缺少 12.我们平时饮用的葡萄酒呈红色，其原因是（） A．酒精发酵前榨汁时榨出的红色葡萄皮中的色素 B．是红色葡萄球菌分泌的色素 C．在发酵的最后程序中，加入了红色的食用色素 D．随着酒精度数的提高，红色葡萄皮中的色素溶解在发酵液中
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定 刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1 （1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤） 摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。鉴定出包括短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。 关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树 文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from Chinese T raditional Sourdough LIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1 (1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory of Food Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK) Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and even pathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples. Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree 我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826） 作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品 114
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
果酒制作的实验报告
果酒制作的实验报告集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）
果酒制作的实验报告 一、实验材料：新鲜西瓜半个，新鲜的酵母，水果刀，榨汁机，矿泉水瓶，纱布 二、原理： 果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧型微生物。 ①在有氧的条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，反应式为： C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O；②在无氧条件下，酵母菌进行酒精发酵，反应式为：C6H12O6→2CO2+2C2H5OH。 温度是酵母菌生长和发酵的重要条件，20℃左右最适合酵母菌繁殖。酒精发酵时一般将温度控制在18~25℃。在缺氧，呈酸性的溶液中，酵母液能大量生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。 三、实验步骤： 1、清洗消毒实验用具，先用温水反复冲洗几次,再用体积分数为75%的酒精擦拭消毒，晾干待用； 2、将西瓜表面洗净，在消过毒的环境下将西瓜切成块； 3、将切好的西瓜放入榨汁机中，榨汁。 4、用纱布将西瓜汁过滤除去渣滓，装入事先清洗消毒过的矿泉水瓶，再加入适量酵母菌，密封瓶口。装入的西瓜汁不宜超过瓶子体积的2/3； 5、将瓶子放在温度适宜的地方进行发酵； 6、定期观察果酒的颜色，是否出现气泡等情况的变化，并记录下来；果酒的瓶每天定时排放气体，以免产生的气体过多将瓶涨破；
7、大约10天左右，即可品尝果酒，从色泽，酒味，果香味等各方面进行评价与讨论。 四、实验记录与结果 1、将西瓜汁静置一天后，发现矿泉水瓶膨胀，瓶内产生气泡。 2、放气时，大量气体逸出，带有果香味与酵母菌发酵的味道。 3、7天以后瓶内气体产量逐渐减少，放气频率下降。有酒味。 4、10天后，果酒基本酿好，有浓郁果味与酒味。 五、实验注意事项总结 1、榨汁机、发酵瓶、纱布等实验用具应清洗干净；每次排气时只需拧松瓶盖或出气口，不要完全揭开瓶盖或出气口。 2、应当将温度控制在18~25℃范围内。因为温度对酵母菌的繁殖有很大的影响。温度低于10℃，酵母菌发育很缓慢。随着温度的升高，繁殖速度加快，20℃时为最佳繁殖温度，此时酵母菌生殖速度快，生活力强。超过35℃，酵母菌生长受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，开始出现死亡。如果想要获得高酒精浓度的发酵液，减少酒精的消耗，必须控制好发酵温度。 3、在发酵过程中，要注意防止发酵液被对果酒有害的微生物污染，以至果酒变质。如充气和排气时不要完全拧松和拧紧排气口。
果酒和果醋发酵技术
果酒和果醋 一．选择题（共20小题） 1．果酒和果醋制作过程中，发酵条件的控制至关重要，相关措施正确的是（） A．葡萄汁要装满发酵瓶，造成无氧环境，有利于发酵 B．在葡萄酒发酵过程中，每隔12 h左右打开瓶盖一次，放出CO 2 C．果酒发酵过程温度控制在30℃，果醋发酵过程温度控制在20℃ D．在果醋发酵过程中，要适时通过充气口充气，有利于醋酸菌的代谢 2．下列属于发酵工程的过程依次是（） ①提取目的基②发酵过程③动物细胞融合④菌种的选育⑤固定化⑥灭菌⑦扩大培养⑧植物组织培养⑨培养基配制⑩分离提纯。 A．①⑦⑥⑤⑩ B．①④⑥⑦⑤⑩C．④⑥⑦⑤⑩ D．④⑨⑥⑦②⑩ 3．利用酵母菌发酵生产酒精时，投放的适宜原料和生产酒精阶段必须控制的条件是（） A．玉米和有氧 B．玉米和无氧 C．大豆粉和有氧D．大豆粉和无氧 4．如图表示工业上利用苹果制备果酒、果醋的流程图．下列叙述不正确的是（） A．过程①、②所需的最适温度不相同B．过程②需要在有氧气的条件下进行 C．若过程①人工接种酵母菌可以缩短苹果酒的酿制时间 D．整个发酵过程都必须在严格无菌条件下才能正常进行 5．下列关于果酒、果醋和腐乳制作的叙述中，正确的是（） A．一般含糖量较高的水果可用来制作果酒B．果醋发酵包括有氧发酵和无氧发酵 C．制作腐乳时，应防止毛霉以外的其它微生物生长D．都是利用微生物胞内酶催化获得最终产品6．有关果酒、果醋和腐乳制作的比较，错误的是（） A．主要菌种不一定是真核生物B．温度控制必须保证微生物繁殖最快 C．发酵过程会产生CO 并释放热量D．可通过色、香、味等对产品进行评价 2 7．某研究性学习小组以樱桃番茄为材料进行果酒、果醋发酵实验．下列相关叙述错误的是（）A．实验中不需接种酵母菌但需要人工接种醋酸菌B．先隔绝空气进行果酒发酵后供氧进行果醋发酵C．实验中可通过控制发酵温度防止杂菌污染D．在进行果醋发酵前，需要适当调节发酵液的pH等8．在酿酒和酿醋的过程中，下列叙述正确的是（） A．葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约的空间B．葡萄先除去枝梗，再冲洗多次 C．所用的发酵微生物，前者没有成形的细胞核，后者有成形的细胞核 D．制葡萄酒的过程中，要将温度控制在18?25°C，时间控制在10?12d 9．下列关于果酒、果醋和腐乳制作的叙述，正确的是（） A．参与发酵的微生物都是异养的真核生物B．发酵全过程都需要防止杂菌污染，以免降低产品品质C．发酵过程都需在适宜温度下进行，腐乳制作温度最高 D．产品中都需添香辛料和盐等佐料，以提高产品的口感
果酒酵母发酵及菌种保藏
果酒酵母发酵及菌种保藏 选取1-2 种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。 1. 实验目的和内容 1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。 3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。 4 ）学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。 2. 实验原理 果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。 可用以下反应式来说明： 果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。 果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。 微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态， 才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。代谢能力 低温、干燥和隔绝空气是使微生物 降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因 素而设计的。 保藏方法大致可分为以下几种： 1）传代培养保藏法
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
果酒制作原理完整版
果酒制作原理集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
果酒制作 制作原理： （1）用到的微生物是酒酵母，单细胞真核微生物，它的代谢类型是兼性厌氧型（有氧时进行繁殖，无氧时进行酒精发酵），主要以出芽方式繁殖。 ①有氧呼吸的反应式： C6H12O6+6O2+6H2O?→6CO2+12H2O+能量? ②无氧呼吸的反应式： C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量? （2）影响果酒发酵的主要环境条件有温度、氧气和pH。 ①酵母菌生长的最适温度是20℃；酒精发酵一般将温度控制在18-25℃。 ②酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性（PH值4.0~5.8）环境，橘子酒发酵时间14~18天，梨子酒20~25天。 ③发酵检测：CO2使Ca(OH)2溶液变浑浊，也可以使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄；酒精使酸性重铬酸钾溶液由橙色变成灰绿色；酵母菌的计数用碱性美蓝染色后显微镜计数法计数检验。 工艺流程： 原料选择→清洗→捣碎→榨汁→入缸→发酵→测定→配制→贮存→装瓶 制作方法： 1．原料：在果实充分成熟、含糖量最高时采收。也可利用残次果酿制苹果蒸馏酒。 2．清洗：用清水漂洗去杂质。
3．捣碎：用机械或手工捣碎，以利榨汁。 4．榨汁：用压榨机榨汁，也可用木榨或布袋代替。出汁率一般为56～60%。 5．入缸：用清水洗净缸的内壁，然后倒入苹果汁，上面留取20%左右的空隙，均匀装满。每100公斤果汁中添加8～10克焦亚硫酸钾（称双黄氧）以抑制对酵母菌有害的其他杂菌活动。 6．发酵:一般采用“自然发酵”，即利用附着苹果果皮表面的酵母菌进行发酵。发酵时间依果汁糖度、温度和酵母等情况而异，一般需要4～10天。室温高，液温达28～30℃时，发酵时间快，大约几小时后即听到蚕食桑叶似的沙沙声，果汁表面起泡沫，这时酵母菌已将糖变成酒精，同时释放二氧化碳。如果迟迟不出现这样现象，可能因果汁中酵母菌过少或空气不足，或温度偏低，应及时添加发酵旺盛的果汁，或转缸，或适当加温。 7．测定：发酵高峰过后，液温又逐渐下降，声音也沉寂，气泡少，甜味变淡，酒味增加，用糖分测定计测出糖度接近零度时，证明主发酵阶段基本结束。 8．配制：苹果果实糖度一般不超过15度，因此只能制9度以下果酒，而普通果酒只有在酒度达14～16度才容易保藏。所以现在大多在主发酵结束时立即加食用酒精，将酒度调至14～16度以上。 9．贮存：将果酒转入小口酒坛中，密闭贮藏。 10．装瓶：将贮藏后的酒液过滤后，装入经消毒的玻璃瓶中，在70℃热水中杀菌10～15分钟。
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。 实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 ?实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。 （二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。
果酒制作 原理
果酒制作 制作原理： （1）用到的微生物是酒酵母，单细胞真核微生物，它的代谢类型是兼性厌氧型（有氧时进行繁殖，无氧时进行酒精发酵），主要以出芽方式繁殖。 ①有氧呼吸的反应式： C6H12O6+6O2+6H2O → 6CO2+12H2O+能量 ②无氧呼吸的反应式： C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量 （2）影响果酒发酵的主要环境条件有温度、氧气和pH。 ①酵母菌生长的最适温度是20℃；酒精发酵一般将温度控制在 18-25 ℃。 ②酒精发酵过程中，要保持缺氧、酸性（PH值4.0~5.8）环境，橘子酒发酵时间14~18天，梨子酒20~25天。 ③发酵检测：CO2使Ca(OH)2溶液变浑浊，也可以使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄；酒精使酸性重铬酸钾溶液由橙色变成灰绿色；酵母菌的计数用碱性美蓝染色后显微镜计数法计数检验。 工艺流程： 原料选择→清洗→捣碎→榨汁→入缸→发酵→测定→配制→贮存→装瓶 制作方法： 1．原料：在果实充分成熟、含糖量最高时采收。也可利用残次果酿制苹果蒸馏酒。
2．清洗：用清水漂洗去杂质。 3．捣碎：用机械或手工捣碎，以利榨汁。 4．榨汁：用压榨机榨汁，也可用木榨或布袋代替。出汁率一般为56～60%。 5．入缸：用清水洗净缸的内壁，然后倒入苹果汁，上面留取20%左右的空隙，均匀装满。每100公斤果汁中添加8～10克焦亚硫酸钾（称双黄氧）以抑制对酵母菌有害的其他杂菌活动。 6．发酵:一般采用“自然发酵”，即利用附着苹果果皮表面的酵母菌进行发酵。发酵时间依果汁糖度、温度和酵母等情况而异，一般需要4～10天。室温高，液温达28～30℃时，发酵时间快，大约几小时后即听到蚕食桑叶似的沙沙声，果汁表面起泡沫，这时酵母菌已将糖变成酒精，同时释放二氧化碳。如果迟迟不出现这样现象，可能因果汁中酵母菌过少或空气不足，或温度偏低，应及时添加发酵旺盛的果汁，或转缸，或适当加温。 7．测定：发酵高峰过后，液温又逐渐下降，声音也沉寂，气泡少，甜味变淡，酒味增加，用糖分测定计测出糖度接近零度时，证明主发酵阶段基本结束。 8．配制：苹果果实糖度一般不超过15度，因此只能制9度以下果酒，而普通果酒只有在酒度达14～16度才容易保藏。所以现在大多在主发酵结束时立即加食用酒精，将酒度调至14～16度以上。
梨酒发酵
果酒酿造实验报告 学校：北方民族大学 学院：生物科学与工程学院 指导老师：倪志婧 班级： 10级生物技术2班 学号： 20103476 姓名：张林锁 时间： 2012-6-7
雪梨酒酿造 组长：郑高琼组员：马玉娟，陶昌荣，唐羽，徐飞，徐志清，张林锁，朱海军（实验组第六组） 摘要：以雪梨为原料，设计酿造酒精度为12度的果酒，通过添加50～70mg/L 的亚硫酸进行护色和调节酸度，以抑制杂菌的生长，并在调整好糖度后，加入0.3％—0.5％的活化了的酵母，在常温下发酵。结果表明，在实验室发酵6天后，可得到在转换成20℃时酒精度为7.1度的雪梨酒。 关键词：雪梨发酵 Snow pear wine brewing Abst ract：In snow pear as raw material, design for 12 degrees of alcohol brewing wine, by adding 50 to 70 mg/L to protect color and adjust the sulfite acidity, to curb the growth of bacteria noise, and well adjusted in sugar content, then add the 0.3%-0.5% of the active yeast, at normal temperature fermentation. The results show that, in laboratory fermentation six days later, can get in 20 ℃when converted into alcohol for 7.1 degree of snow pear wine. Key words： Snow pear fermentation 0 前言 梨是我国继苹果、柑橘之后的第三大水果, 我国的梨品种资源非常丰富[1]。梨果实饱满, 性寒凉, 含水量多, 含糖高, 其中主要是果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖, 还含多种有机酸, 故汁多爽口, 香甜宜人。随着梨栽种面积的进一步的扩大,产量大幅度的增加,人民生活水平的不断提高,传统的梨消费方式已经不能满足人们的要求,同时,梨酒越来越受到人们的关注。梨酒色泽明亮，口感清甜，具淡淡的梨香，同时营养丰富，但加工过程中易发生褐变，需添加护色剂。 1 材料与方法
实验三 果酒酵母的分离
北方民族大学 实验方案 果酒酵母的分离、纯化及选育 果酒酵母发酵 院(部)名称：生物科学与工程学院 学生姓名：胡菲菲 20092474 隆冬玲 20092499 马忠孝 20092526 张晶 20092475 张静艳 20092462 专业:生物工程 指导教师姓名:倪志婧
实验三果酒酵母的分离、纯化及选育 原始数据记录 1.筛出5株酵母菌 2.发酵力试验：采用CO2失重法 不同酵母菌株在发酵过程中CO2失重的动态变化 不同发酵时间（d）下三角瓶的重量/g 原重1d 2d 3d 4d 5d 6d CO2释放量 菌种 1 164.8 163.8 2 161.51 159.4 3 158.2 4 157.2 5 155.49 9.31 菌种 2 152.5 151.8 3 150.85 149.38 148.3 4 147.32 145.94 6.56 菌种 3 158. 4 156.73 154.78 152.99 152.1 151.24 150.04 8.36 菌种 4 155.1 153.97 152.04 150.34 149.42 148.66 147.7 7.4 菌种 5 156.1 155.22 152.8 6 151.02 149.95 149.28 148.15 7.95 从上表可以看出1号菌株在发酵终了时CO2释放量（g）最多，即1号菌株发酵速度最快，是发酵速度较高的酵母。 不同发酵时间（d）CO2释放量/g 1 2 3 4 5 6 菌种1 0.98 2.31 2.08 1.19 0.99 1.76 菌种2 0.67 0.98 1.47 1.04 1.02 1.38 菌种3 1.67 1.95 1.79 0.89 0.86 1.2 菌种4 1.13 1.93 1.7 0.92 0.76 0.96 菌种5 0.88 2.36 1.84 1.07 0.67 1.13