Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16
Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000
Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕
（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基
操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释
0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。
在37℃，5％的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。
在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。
适用细胞株范围不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen网站的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen网址
（https://www.wendangku.net/doc/0517210780.html,/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLi nes.dsp_searchRange）
适用的核酸类型和DNA大小有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染，这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛，无论是基因表达分析的DNA转染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是，最常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题，太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。
用量和价格好东西往往不便宜。可是在实验室中，价格往往是最具有杀伤力的。Lipofectamine 2000用的剂量大吗？价格如何？根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染，而1.5ml Lipofectamine 2000当前市场价格4667元，0.75ml 价格是2798元（可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了）。平均下来，再算上折扣，Lipofectamine 2000性价比还是挺高的。
注意事项 Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM 就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000。
对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就
可以了。
还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍就好啦。
二、今年的新产品：Lipofectamine 2000 CD 和 Optifect
作为一个新产品，Lipofectamine 2000 CD当然应该有区别于原来的Lipofectamine 2000。这个1ml就要卖到5000多块的新产品好在哪里？主要是由于不采用动物来源的材料，可以满足某些特殊要求，比如要求不含动物来源材料等。其他优缺点和Lipofectamine 2000差不多。以24孔板计算，一次2ul,1ml 足够500次转染，但价格不便宜，要5000多元。
Optifect 主要是为在较低铺板密度条件下转染而设计的，比如细胞增埴相关基因和细胞周期相关基因的表达和研究往往要求较长的表达周期，细胞表面蛋白的表达和研究、还有部分高通量筛选等等也要求在较低铺板密度条件下转染，由于Lipofectamine 2000要求转染时90－95％汇片而不太适合，Optifect就是一个选择。Optifect最佳的铺板密度是30％-70%，其他的操作和注意事项也和Lipofectamine 2000相近。同样可以直接加入细胞培养物中，转染前后都不需要更换血清，同样不要加抗生素，等等。1ml价格是3616，用量相对高一些，24孔板一次需要3－4ul，6孔板就要用到15－24ul/次，每次算下来就比前面的贵了。
三、闻道有先后，术业有专攻，Invitrogen的其他几个当家花旦
LIPOFECTAMINE PLUS：是老版LIPOFECTAMINE的改良版。加入PLUS试剂后会导致在广泛条件下的高活性，不需要进行细节优化就可以进行高活性转染了。实验步骤同样很简单，细胞铺板密度以转染当天汇合度至70%到90%为宜。
DMRIE-C 转染悬浮细胞效率最高，如Jurkat细胞以及其他淋巴细胞来源的细胞系。也可以用来转染摇瓶中使用CD CHO培养基培养的悬浮CHO细胞，易于放大。另外建议用DMRIE-C将RNA转染入贴壁细胞。它比使用LIPOFECTIN转染RNA至BHK-21细胞的表达水平高。
CELLFECTIN 转染昆虫细胞的首选，特别是于昆虫基因表达中生产杆状病毒的
Sf9和Sf21细胞以及果蝇细胞。
LIPOFECTIN 已经成功用于人类和非人类内皮细胞的瞬时转染。除了质粒DNA转染外，使用LIPOFECTIN也可以将RNA，寡聚核苷酸，酵母人工染色体和蛋白转入多种细胞系。
四、阳离子转染试剂的一些注意事项（Invitrogen提供）
有血清时的转染：血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素：抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
细胞维护和培养的演变：可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，不要使细胞保持融合超过24小时。大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
细胞铺板密度：用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。在三种不同密度进行细胞铺板的比较表明铺板密度最高的，CAT活性也最高,试剂的量也相应增加。这些结果说明，对于转染相同量的DNA所需的最佳阳离子脂质体试剂的量会因细胞密度而异。
启动子的选择：获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。同其他启动子，如SV40和RSV相比，在BHK-21中其活性最高。这三种病毒启动子在T细胞来源
的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。转染后在培养基中加入PHA-L和PMA 可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
DNA量：高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。
瞬时和稳定表达：DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到。仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。瞬时表达分析检测非重组质粒DNA上基因的表达。因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心。为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。在一小部分转染的细胞中，加入的DNA通过重组整合到基因组上。包含整合DNA的细胞很少，必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需的时间更长。但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。
瞬时转染和转染效率的监测：基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT），绿色荧光蛋白（GFP），荧光素酶（Lux或Luc）以及b- 半乳糖苷酶（b-gal）。可以使用简单的非同位素方法检测b-gal的表达以测定转染效率和活性。pCMV-SPORT- bgal质粒包含CMV启动子调控下的LacZ基因，转染入真核细胞内后可以直接表达bgal。结合简单的检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。
稳定转染细胞系的筛选：连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。氨基糖苷磷酸转移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对GENETCIN选择性抗生素（G418 Sulfate）的抗性。抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS试剂得到的NIH 3T3细胞GENETICIN抗生素抗性克隆的数目比单独使用LIPOFECTAMINE增加了大约3倍。要进行稳定的表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力。生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到GENETICIN抗生素的影响。转染后，在开始筛选前等待48-72小时，使细胞表达足够量的抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护。转染后48-72小时倒掉培养基，加入含有GENETICIN抗生素的培养基，抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞。因为许多因子影响到筛选所需的GENETICIN抗生素的最佳
浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度。筛选可能需要较长时间，因为在致死剂量的GENETICIN 抗生素存在条件下，细胞会分裂1-2次。在维持培养细胞时使用较低剂量的抗生素，一般是筛选剂量的一半。筛选后的细胞一般是离散的克隆，根据实验目的不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。
蛋白表达和培养基的选择：哺乳动物细胞系合成可溶的，翻译后修饰的蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白。常用的细胞系包括CHO，293和COS-7。Invitrogen提供克隆的293-F，293-H，COS-7和CHO-S细胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培养基低得多）。无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。在部分情况下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），对于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞，可以使用其培养基进行转染。其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成分。在这些情况下，有必要在诸如D-MEM或OPTI-MEMⅠ等培养基中进行培养和转染.
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转染FAQs：
针对同种阳离子脂质体的疑难解答
Q1: 转染效率低
A1::1)没有使用优化的阳离子脂质体试剂。解决建议:选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。参见附录A或网站（https://www.wendangku.net/doc/0517210780.html,）上“Transfection Collection”中的参考文献列表。
2)没有使用优化条件。解决建议: 优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。参见第7章优化步骤。参见网站（https://www.wendangku.net/doc/0517210780.html,在Tech-online分子生物学部分）上的细胞特异性的转染步骤。
3)DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。解决建议: 在复合体形成时不要使用血清。OPTI-MEM I培养基和DMEM是用于复合体形成的较好的培养基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合物。注意：不要将OPTI-MEM I培养基用于LIPOFECTAMINE PLUS试剂或昆虫细胞。对于Sf9和Sf21细胞，Sf-900Ⅱ SFM会得到最佳结果。
4)存在抑制剂。解决建议: 不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。
5)不恰当的细胞密度。解决建议: 细胞密度应该在转染时融合度为70%-90%。
6)转染DNA的启动子-增强子没有被宿主细胞识别。解决建议: 确保转染DNA的启动子-增强子同目的细胞类型兼容。
7)阳离子脂质体试剂冻结。解决建议:不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。
8)转染分析的问题。解决建议: 转染分析中加入阳性对照。
9)质粒纯化的问题。解决建议: 请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55℃的水浴上保温5分钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。
Q2:细胞死亡率高。
A2:1)DNA量太高。解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。在剂量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调／优化方法。
2)阳离子脂质体试剂量太高。解决建议: 作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入DNA，因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调／优化方法。
3)在转染过程中使用抗菌素。解决建议:在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。
4)细胞太少。解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。
5)在无血清条件下细胞活性降低。解决建议:使用OPTI-MEMⅠ培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用5%到10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。
6)阳离子脂质体试剂氧化了。解决建议:不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。
7)对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。解决建议: 在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。
Q3:阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。注意：在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。A3:1)存在过剩的EDTA。解决建议:使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度<0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。2)DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。解决建议: 确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量（参见表5）。
Q4: 转染重复性不好。
A4:1) 转染时的融合度波动。解决建议:在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。
2)在培养中细胞发生变化。解决建议: 如果可能，使用来源于经选择转染效率较
高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。
针对不同阳离子脂质体的疑难解答
CELLFECTIN试剂或DMRIE-C试剂
Q:试剂溶液混浊。 A:这是正常的。确保在转染吸取液体前混合试剂（颠倒5到10次）。
LIPOFECTIN试剂
Q1:未稀释的试剂即混浊。 A1:不要使用。可能已冰冻或在低于4℃保存。
Q2:试剂稀释后混浊。 A2:这是正常的。未稀释的LIPOFECTIN试剂是澄清的。当稀释于OPTI-MEMⅠ时会变混浊。
Q3:转染效率低。A3: 在加入DNA前将LIPOFECTIN试剂在OPTI-MEMⅠ（或其他无血清培养基）中温育30分钟。
LIPOFECTAMINE试剂
Q:荧光背景。
A:在免疫细胞化学转染后会检测到荧光背景。LIPOFECTAMINE试剂本身没有荧光。
LIPOFECTAMINE PLUS
Q1:转染效率低
A1:1)试剂的加入顺序不对。将DNA和PLUS试剂在稀释培养基中混合，然后将混合液同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合。
2):在复合前稀释的DNA或PLUS没有充分混合。确保在混合前每孔都混合好。在进行预复合的稀释培养基中加入DNA和PLUS试剂的顺序不影响转染活性。3)没有使用LIPOFECTAMINE试剂。确保在加入到细胞前将DNA-PLUS试剂复合物同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合并温育。
LIPOFECTAMINE 2000
Q1:转染效率低。
A1:1)对于在OPTI-MEMⅠ中制备的稀释液，确保稀释的LIPOFECTAMINE 2000在30分钟内同稀释的DNA混合。2)如果使用D-MEM做为稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合3)细胞密度对于转染太低。在转染时细胞融合度应为90%。
Q2:复合物溶液混浊。 A2:这是正常的。
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤
LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： （在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟 （在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。
5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
FuGENE 转染流程
FuGENE HD真核细胞转染流程 FuGENE HD Transfection Reagent Quick Protocol.pdf FuGENE HD Transfection Reagent.pdf 1.细胞和质粒的准备 ①将约5-10×105A549细胞接种于6孔细胞板中，用含10%小牛血清的F-12k 培养过夜，约60%~80%铺满时用于转染。 注：一般荧光试验细胞稀一点为宜；WB试验细胞密一点为宜 ②转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取，抽提后测定其浓度 和纯度，浓度在0.1μg/μL以上且纯度在1.8±0.5 (OD260/OD280)的质粒用于转染，质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。（注：质粒浓度测定未必可行，需同时进行酶切和PCR鉴定方可。） ③按照转染剂量，计算质粒使用浓度 2.转染流程 注：由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性，必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。 ①将培养板中的上清弃去，用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后，每孔加入 800ul 无抗无血清F12K。 ②取出FuGENE HD转染试剂，使其温度上升到室温。 ③计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量，最终液体总量为100 ul。 准备好无菌指形管，按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K，加入2ug 质粒，振荡器混匀；随后加入6ul FuGENE HD转染试剂，立即震荡混匀（转染试剂加入时不能沾到管壁上！） ④室温静置7-12分钟后，将质粒：转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中， 吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
lipo2000转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection
lipo2000转染操作步骤
Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
细胞转染操作方法及各方法比较
细胞转染操作方法 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。 三、第二次细胞传代 1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.
Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22
Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
细胞转染技术原理及应用
细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
细胞转染操作步骤
RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix
加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参
Invitrogen Lipofectamine2000
Lipofectamine? 2000 前言 Lipofectamine? 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth? RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。 影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素 在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括： ·转染效率 ·目的基因转录效率 ·蛋白质稳定性 ·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率 ·所选择哺乳动物细胞系的生长特征 当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（https://www.wendangku.net/doc/0517210780.html,）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。 转染的一般性指导 使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导： 1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine? 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth? RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。 2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。 3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。 4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM? I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine? 2000和Stea lth? RNA或者siRNA寡聚物。 5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?荧光寡聚物(BLOCK-iT?Fluorescent Oligo)(目录号2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT?荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT?荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。
细胞转染的步骤
【试剂与仪器】 1 ．小牛血清。 2 ．双抗溶液（链霉素100μg+ 青霉素100 单位）。 3 ．DMEM 培养基。 4 ．转染试剂（LIPOFECTAMINE 2000 ）。 5 ．细胞培养基（DMEM+10%NCS ）。 6 ．PBS 。 7 ．无血清培养基。 8 ．胰酶（Trypsin ）。 9 ．培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机，15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜和CCD 。 【操作步骤】 1 ．转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90% 。细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2. 对于每孔细胞，使用50μl 无血清DMEM 培养基稀释0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制备。 3. 对于每孔细胞，使用50μl DMEM 培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 试剂。LIPOFECTAMINE 2000 稀释后，在5 分钟内同稀释的DNA 混合。保温时间过长会降低活性。 4. 混合稀释的DNA （由第2 步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000 （由第3 步）。在室温保温20 分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6 小时稳定。 5. 直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml 无血清培养基。 6. 在37℃，5 ％的CO 2 中保温24-48 小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5 小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7. 在细胞中加入复合物24-72 小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。
各种转染试剂中文说明
FuGENE6（Roche）转染步骤: 转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。 将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。 1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总 体积到100ul。 2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。 3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。 4.室温孵育20分钟。 5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液 洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。 6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。 7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）： 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。 细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释 4.0ugDNA，轻轻混匀。 3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如 OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。 Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。 NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。 4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。室温放 置20分钟。 5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入 2ml无血清配养基。 6.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分
两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分精品论文 两种转染试剂转染 C2C12 细胞效率比较分 析 韦伟，赵元元，张维娅，赵书红，李新云 5 ,农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室～华中农业大学～武汉 430070, 摘 要:C2C12 细胞是鼠的骨骼肌成肌细胞～常用于体外研究肌细胞成肌分化～研 究表明 C2C12 细 胞的转染效率较低～为了提高 C2C12 细胞的转染效率～建立理想的转染条件 ～本研究对 比分析了 FuGENE HD 和 Lipofectamine 2000 两种常用转染试剂的转染效 率。研究结果表明 10 FuGENE HD 转染寡核苷酸的效率比 Lipofectamine 2000 高～而转染 质粒的效率比 Lipofectamine 2000 低。另外我们还发现培养基中的血清会降低细胞的转染 效率。本研究结 果为提高 C2C12 细胞的转染效率提供了新的信息。 关键词:转染效率,寡核苷酸,质粒,C2C12 细胞 中图分类号:Q-33 15 Compare analysis of the transfection efficiency of two transfection regents in C2C12 Cells
Wei Wei, Zhao Yuanyuan, Zhang Weiya, Zhao Shuhong, Li Xinyun (Key Lab of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of Ministry of Education, 20 Huazhong Agricultural University, WuHan 430070) Abstract: C2C12 cells are the myoblast of mice, which are used as the model for investigating the differentiation of myoblast in vitro. The transfection efficiency of the C2C12 cells was not good in many studies. In order to improve the transfection efficiency of C2C12 cells and contribute an ideal condition of transfection. The transfection efficiency of two transfection reagents, FuGENE 25 HD and Lipofectamine 2000, was analyzed in this study. According the results, the transfection efficiency of FuGENE HD was higher than that of Lipofectamine 2000 when oligo nucleic acids was transfected, but it was lower than Lipofectamine 2000 when plasmid was transfected in the C2C12 cells. Also, we found that serum in cultured medium could inhibit the transfection efficiency. These results offered useful information for improving the transfection efficiency of 30 C2C12 cells. Key words: transfection efficiency; oligo nucleic acids; plasmid; C2C12 cells 0 引言 简转染是指将外源遗传物质转入到真核细胞内的过程。转染对现代分子生物学研究意义
lipo2000转染操作步骤(一类特选)
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤 Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
各种转染方法比较
各种转染方法比较 转染方法原理主要应 用 特点主要的厂家及产品 DEAE－葡聚糖法带正电的DEAE-葡聚糖与核酸 带负电的磷酸骨架相互作用形成 的复合物被细胞内吞 瞬时转 染 相对简便、重复比磷酸钙好,但对细 胞有一定的毒副作用,转染时需除血 清且一般只用于BSC-1,CV-1,COS 细胞系 Sigma-Aldrich(DEAE-Dextran Transfection Kit) DNA复合物吸附细胞膜稳定转 染,染瞬 转染 不适用于原代细胞（所需的DNA浓 度较高）,操作简便但重复性差,有些 细胞不适用 细胞建议用CSCL梯度离心，转染 是拷贝数较多 GIBCO BRL，Promega 阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的 磷酸基团形成复合物，然后脂质 体上剩余的电核与细胞膜上的唾 液酸残基的负电核结合；另一种 解释是通过细胞是内吞作用而被 进入细胞。(若DNA浓度过高， 中和脂质体表面电核，而降低了 与细胞的结合能力) 稳定转 染,瞬时 转染,所 有细胞 使用方法简单，可携带大片段DNA， 通用于各种类型的裸露DNA或 RNA，能转染各种类型的细胞，没 有免疫原性。虽在体外基因转染中 有很高的效率，但在体内，能被血 清清除，并在肺组织内累积，诱发 强烈的抗炎反应，导致高水平的毒 性，这在很大程度上限制了其应用 Invitrogen（Lipofectamine 2000，Lipofectamine， Lipofectin，Lipofectamine Plus，Cellfectin） Roche（Dosper，DOTAP，FuGENE 6） CPG Biotech Co（GeneLimo Plus，GeneLimo Super） Promega（Transfast，Tfx， Transfectam）
稳定细胞转染流程(刘文)
H e p G 2 DMEM配制： NaHCO3 3.7g HEPES 4.766g DMEM粉1包 水1000 ml 用HEPES调整PH值到7.3，加入双抗（青霉素，链霉素，每L培养液各10万单位），无菌过滤，4度保存。 0.25%胰酶的配制： 1、称胰酶粉末0.25 g , 加100 μl高压灭菌的1×PBS 。 2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。 0.02% EDTA的配制： 1、称EDTA粉末0.02 g , 加100 μl高压灭菌的1×PBS 。 2、使用小过滤器无菌过滤灭菌，4度保存。 复苏细胞
1、准备好操纵台，吸管，5 ml玻璃离心管，40度干净温水，（用烧杯装干净蒸馏水于水中温热）。 2、于液氮冻存罐中取出细胞，立即置于温水中，并不停地摇动，让其速融。 3、5 ml玻璃离心管中加入4ml的完全培养液，再加入溶解的细胞液。 4、1000rpm，5min 。弃上清，加入2 ml培养液，吹散细胞。 5、分装于两瓶中，然后每瓶补充培养液至5 ml。培养箱中培养；每日观察细胞生长情况。传代（附壁细胞） 1、超净台消毒，试管消毒，注意切忌污染。 2、胎牛血清（FBS），培养液（DMEM：对附壁细胞）胎牛血清10 ml加入DMEM/1640（1：10）。 3、消化： A、细胞培养瓶加入0.02% EDTA 约1 ml，可以轻轻晃动让EDTA没过所有的细胞，作用20S后吸出。 B、加入0.25%胰酶约1 ml，轻轻晃动让胰酶没过所有的细胞。作用约3 min（时间的长短依情况而定，使细胞变成单个即可）。 C、吸去胰酶，加入4ml完全培养液，吹打细胞培养瓶壁，让细胞脱落，并吹打成单个细胞悬液。 4、分成两瓶，每瓶补充培养液至5 ml。 5、CO2孵箱，37度培养。 细胞冻存： 1、把细胞消化成细胞悬液，计数，离心（5 ml玻璃离心管），1000rpm，5min 。