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Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择

Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择
Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择

Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择

2016-04-25 Bruce Lee

生产高效液相色谱柱的厂家有很多,如Waters,Agilent,Phenomenex,Shimadzu,Thermo等,每家供应商又生产多个系列,导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。

目前实验室以及公司,企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。Waters主要有Symmetry,Sunfire,XTerra,XBridge,XSelect,CORTECS以及Atlantis系列等,其详细分类以及键合相如下。

Figure 1 Waters Symmetry column family

Figure 2 Waters Sunfire column family

Symmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶(B型)作为固定相基质,摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用,此外由于金属离子含量特别低,在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时,可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少,因此其最大特点在于批次之间的重现性。两个系列均采用封端技术,Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%;SymmetryC8与C18载碳量均为12%,因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别,而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱,对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力,当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um,其设计用途为制备;Symmetry300 C18(孔径300埃,载碳量8.5%)与Symmetry300 C4(孔径300埃,载碳量2.8%)则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离,分析而设计。Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱,由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在,增加了硅胶表面的水分子浓度,改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离,分析条件,而不会

出现孔隙内去湿现象,对于分析碱性等大极性分析物而言,减少其保留能力,改善峰形,具有很高的方法重现性。此外,Sunfire Silica 色谱柱则是纯粹的高纯硅胶柱,作正相使用。

Sunfire以及Symmetry系列色谱柱是Waters比较早期一些的色谱柱,均使用高纯度硅胶作为固定相基质,对其表面键合之后,再进行封端处理;相较与HPT 第一代颗粒杂化技术而言,对于极性化合物特别是碱性化合物的分析能力就显得比较弱一些。此外,其pH允许范围为2-8,相比采用HPT技术的Xterra系列色谱柱(pH允许范围1-12),对于pH的耐受性比较差一些。

Figure 3 Waters XTerra column family

Xterra系列色谱柱,采用第一代颗粒杂化技术(HPT),使用超纯四乙氧基硅氧烷与甲基三乙氧基硅氧烷作为起始物料合成甲基聚乙氧基硅烷,使得高纯度硅胶的每三个硅羟基就有一个被甲氧基化,再次交联与封端处理后,其表面硅羟基量减少了30%左右,且在合成杂化颗粒的同时完成封端,具有很高的批次重现性。因此,对于pH的耐受性得到了极大的提高,可耐受pH1-12。C18与RP18载碳量分别为15.5%与15%,RP8与Phenyl载碳量为13.5%与12%,粒径可选3 um,5 um以及10 um(制备用)。C18,RP18,RP8载碳量与高纯硅胶基质Symmetry以及Sunfire保持一致,但对于极性化合物的分离,分析而言,明显提高其峰形对称性与分析方法重现性。Phenyl色谱柱的加入,则是对C18以及C8烃基配体的一个显著补充,可提供不同于C18以及C8的选择性,特别适合含有苯环、萘等苯共轭结构的分析物,在疏水与氢键作用之外,还能与分析物起到pi-pi相互作用,对一些难分离样品(特别是医药)可实现高效,快速分离,分析。其聚合物特性,质地与硅胶相比略软,具有耐压能力略弱,柱效相应略低

的缺点。

Figure 4a Waters XBridge column family

Figure 4b Waters XBridge column family

Figure 4c Waters XBridge-XP column family

XBridge色谱柱家族是Waters液相色谱柱的当家花旦,采用最新一代颗粒杂化技术(BEH),使用超纯四乙氧基硅氧烷与双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷作为起始物料合成聚乙氧基硅烷。与第一代杂化颗粒技术(HPT)相比,机械强度得到很大提高,Si之间额外的二乙氧基链接桥,使得该类型色谱柱的耐受低pH能力得到进一步提升(pH 1-12)。

其中,最常用的是三键键合的XBridge C18,C8,Phenyl柱,均采用封端处理,载碳量有所增加,分别为18%,13%,15%;单键键合TMS封端处理的Shield RP18,载碳量17%,粒径范围覆盖分析到制备。酰胺柱的加入,有益于对极性化合物的分离,可明显改善峰形,而不用使用离液序离子或者离子对试剂。Peptide C18 130埃,300埃以及C4 300埃色谱柱用于对多肽以及蛋白质类生物制品进行分离与分析。Oligo C18用于对单糖,寡糖样品进行分析。

BEH技术XBridge XP系列色谱柱,与XBridge相比,差别在于粒径为2.5 um,可轻松实现HPLC与UPLC之间方法的有效转换。

Figure 5a Waters XSelect column family

Figure 5b Waters XSelect-XP column family

XSelect CSH色谱柱与XBridge色谱柱相比,区别在于前者固定相表面带有低密度的电荷,可增强对于带电化合物的保留能力,提高对化合物的载样量以及提

供对称的峰形。其中五氟苯基柱在提供不同于C18,Phenyl柱的选择能力的同时,增大极性化合物的保留。HSS型色谱柱,采用聚合物杂化颗粒,使用超纯四乙氧基硅氧烷单体进行聚合,得到纯度极高的合成硅胶。

其中HSS T3,HSS SB,HSS PFP,HSS CN色谱柱,为极性化合物的分离提供了多样化选择,其中T3采用低密度封端技术,后三种则不采用封端处理。XSelect XP色谱柱,与XSelect相比,差别在于粒径为2.5 um,实现HPLC与UPLC之间方法的有效转换。

Figure 6 Waters CORTECS column family

CORTECS色谱柱固定相使用实心球技术,相比其他类型色谱柱具有快速分离,背压较低,柱内扩散较低的特点,也具有载碳量不足,载样量低的缺点。实际使用量远不如其他类型的液相色谱柱。

Figure 7 Waters Atlantis column family

Atlantis色谱柱固定相使用高纯度硅胶作为固定相基质,对硅羟基进行特殊封端处理(裸露硅羟基适量但不完全封端)。选择性C18链采用低密度键合,T3采用三键键合的方式,对低pH的耐受性得到增强,dC18色谱柱采用双键键合方式。其最大特点是在RP模式下,完全100%兼容纯水相作为流动相,特别适合于增大极性分析物的保留时间。此外,Hilic Slica色谱柱为亲水硅胶色谱柱,同样兼容100%水相,其使用方法与分离原理与经典RP色谱具有一定的区别。选择合适的液相色谱柱是分析方法开发成功与否的关键,实际应用过程中可根据待分析样品的极性与非极性大小,复杂程度,待分析样品中各种组分的结构相似程度,分析方法开发的目的,选择合适的色谱柱。

Reference

Waters column mannual

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Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择

Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择 2016-04-25 Bruce Lee 生产高效液相色谱柱的厂家有很多,如Waters,Agilent,Phenomenex,Shimadzu,Thermo等,每家供应商又生产多个系列,导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。 目前实验室以及公司,企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。Waters主要有Symmetry,Sunfire,XTerra,XBridge,XSelect,CORTECS以及Atlantis系列等,其详细分类以及键合相如下。 Figure 1 Waters Symmetry column family Figure 2 Waters Sunfire column family Symmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶(B型)作为固定相基质,摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用,此外由于金属离子含量特别低,在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时,可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少,因此其最大特点在于批次之间的重现性。两个系列均采用封端技术,Sunfire C8与C18表面载碳量分别为12%和16%;SymmetryC8与C18载碳量均为12%,因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别,而Sunfire C18色谱柱则相比Symmetry C18色谱柱,对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力,当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。Symmetry C8 Prep与C18 Prep色谱柱的填料粒径为7 um,其设计用途为制备;Symmetry300 C18(孔径300埃,载碳量8.5%)与Symmetry300 C4(孔径300埃,载碳量2.8%)则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离,分析而设计。Symmetry Shield RP 18内嵌极性官能团色谱柱,由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在,增加了硅胶表面的水分子浓度,改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离,分析条件,而不会

常见液相色谱柱性能比较

常见液相色谱柱性能比较 一、高性能色谱柱特点:柱效高,价格高,通用性好,使用寿命长,pH范围宽 1、Waters公司Xbridge 2005年waters公司推出,杂化颗粒柱。 优点:pH 1-12,在高pH状态下,没有能与此色谱柱匹敌的,目前市场的宽pH色谱柱在高pH的状态下(9-12)普遍寿命很短,如Gemini,资生堂公司Capcell,YMCPro-C18,包括waters 的第一代杂化柱Xterra都是寿命不长,Zorbax Extend更是不堪。柱效与一流的硅胶柱相当,甚至有过之无不及,杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问题在于柱效,Xterra和常见的PSDVB的色谱柱都有不错的pH范围,但是柱效低的问题无法解决,这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。在如此宽的pH范围,最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法 (pH1-3,pH9-12),这样能得到更稳定更容易重现的方法,对酸性,中性,尤其是碱性化合物都能得到理想的峰形。 注:Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料,只是颗粒度是1.7um,所以不再重复。缺点:价格高,平均每支¥7000多的,不是大多数中国客户可以接受的。 2、MerckChromolith整体化色谱柱 Merck公司2001年推出。 优点:高流速、低压力,可以快速分析样品,因为压力低,所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题,低压力是因为硅胶棒的大量中孔的存在,中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵,在处理比较脏的样品的时候会优势很大(如中药),实际的寿命也因此延长。这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快,特别适合之前分析时间超长的实验条件,目前很好的例子就是人参的指纹图谱,因为成分复杂,之前出峰要2个小时,现在用整体化色谱柱30min 就可以分析完了(已有报导),且不影响柱效,类似于UPLC,但不像UPLC那么容易堵。 缺点:规格单一,单价比较高,单价¥7000左右,所以通过串联获得更高柱效的方式显得比较奢侈。 3、Phenomenex公司Gemini ,采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-12。 优点:因为聚合物涂层抑制了碱性溶液水解硅胶,所以可以承受一定的碱性条件,由于是硅胶球颗粒,所以柱效不错,比Xterra或者PSDVB这类色谱柱柱效好。单价比较低,¥3000以内。 缺点:聚合物涂层稳定性比较差,所以当涂层损失时,色谱柱会很坏被碱性溶液溶解,这也是其寿命远不及Xbridge的原因。另外涂层损失也会影响结果重现性。 4、资生堂Capcell ,采用硅胶球聚合物包被技术。pH范围1-10。 类似于Gemini同样的技术,只是参数指标比phenomenex低调。 单价偏高,¥5000以内。 5、Agilent ZorbaxExtend,采用双配位键和相技术。pH2-10 优点:不详 缺点:在使用高pH时,基本上都会介绍Extend,但是实测数据说明该款色谱柱的耐高pH 能力较差。 二、高纯硅胶柱特点:柱效高,峰形好,适用广泛,价格合适,为各色谱柱公司目前主流色谱柱 1、Merck的Purosphere STAR ,为Merck公司1999年推出,pH 1.5-10.5,通用性好,柱效高;缺点:市场推广较差,知名度比较低, 2、Phenomenex的Luna ,Phenomenex公司的主打色谱柱,pH1.5-10,通用性好,在进口色谱柱市场上占有一定份额;缺点:装填相对松散,柱头填料容易塌陷

waters色谱柱-XTerra色谱柱

基于第一代杂化颗粒技术的XTerra?系列高效液相色谱柱, 可以让色谱工作者在药物发现,方法开发和纯化分离领域使用高pH值流动相。 ?XTerra颗粒能耐受二甲基亚砜(DMSO)溶剂,可延长高通量药物发现研究中色谱柱的寿命。?宽pH 范围使得方法开发研究人员在所需的pH值条件下操作,以获得最佳选择性。 ?高载荷量使得分离纯化的科学家在高pH值条件下,在纯化碱性化合物时,一次进样量增加六十倍。 XTerra 色谱柱特性 键合相类型颗粒状态孔径(s) (μm)碳载量 (?)端基(%)是否端基封尾 XTerra MS C18 球形 2.5, 3.5, 5, 10 μm 125 15.5 是 XTerra MS C8 球形 2.5, 3.5, 5, 10 μm 125 12 是 XTerra RP18 球形 3.5, 5, 10 μm 125 15 是 XTerra RP8 球形 3.5, 5, 10 μm 125 13.5 是 XTerra Phenyl 球形 3.5, 5 μm 125 12 是 [ 杂化颗粒技术] 药物发现 方法开发分离和纯化 XTerra?色谱柱将硅胶和聚合物的最优特性与革命性的杂化颗粒专利*技术相结合,在合成中,使用甲基取代了部分硅羟基。疏水性Si-C基团分布在颗粒骨架结构中,最后获得耐用的杂化(无机/有机)颗粒,可在如下条件操作: ?高速 ?高温 ?高pH值. 经过键合和封端处理后,填料表面的残留硅羟基减少了33%,因此XTerra色谱柱分析碱性化合物时可得到尖锐对称的色谱峰,从而获得更好的分离。 *美国专利号6,686,035 B2 不同键合相的XTerra色谱柱对分离选择性的影响

Waters HPLC色谱柱介绍

如何选择理想的 HPLC分析柱 HPLC分析柱
?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ?2011
?2011 Waters Corporation
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如何看待色谱柱?
色谱柱是液相色谱工作的最重要又最常使用的工具
对工具了解越多,越有可能尽早选对合适的工具,使工作开展的更顺 利
工欲善其事,必先利其器!
?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ?2011
?2011 Waters Corporation
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沃特世价值所在: 技术能力+品质保障+专业服务
Better traceability & control of the entire process
Waters
?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ?2011
? Manufactures under cGMP, ISO 9001 and ISO 13485 guidelines ? Registered with FDA as a medical device manufacturer
?2011 Waters Corporation 3

概要
如何认识色谱柱? 如何认识色谱柱? 沃特世色谱柱: 沃特世色谱柱:为色谱工作者的任务而设计 XBridge Atlantis SunFire XSelect UPLC—HPLC方法转换 HPLC—OBD 制备柱无优放大
?2009 Waters Corporation | COMPANY CONFIDENTIAL ?2011
?2011 Waters Corporation
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Waters Styragel柱子的维护与使用手册-2

Waters Styragel 柱子的维护与使用手册 声明:禁止在未经允许下修改本资料,并且不应理解为是Millipore公司的承诺。对本资料中出现的错误M公司不承担任何责任。这本手册在出版期间是完整和准确的。M公司不负责由于本手册的使用带来的任何损失。 1993年 Millipore公司 美国出版 版权所有 本手册或其中部分理论在没有经过出版者的允许禁止复制。 M,Styragel,Fluoropore和Millex是M公司的注册商标, Waters是M公司的注册商标。 1、介绍 本手册介绍的是Waters Styragel HR、HT和HMW系列凝胶渗透色谱柱的使用和维护。请仔细阅读本手册,遵循本手册的建议将会延长柱子的寿命并加强色谱图的重现性。本手册描述了Waters Styragel色谱柱的以下三类:Styragel HR;Styragel HT;Styragel HMW。Waters Styragel柱子的填料为高性能、多孔、高交联度的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物颗粒。他们的不同性能使你能够选择最优的柱子来满足实验应用。 Waters Styragel HR:可用于低分子量、低聚物和添加剂的高分辨分析。该柱装填5μm颗粒,能够提供此种分析类形所需的高塔板数。 Styragel HT:可用于分析中等分子量范围聚合物的分析。他们是分子量分析中用途最多的。该柱装填10μm颗粒,在较宽的温度范围和溶剂范围内均有可靠的性能。 Styragel HMW:专门用来分析超高分子量聚合物。装填有20μm颗粒和10μmHMW玻璃原料的该柱子能够有效防止由于剪切而对超高分子量聚合物造成的破坏,这种剪切往往出现在聚合物与小颗粒之间。 2、安装色谱柱组 本章概述:准备GPC/HPLC系统;安装色谱柱;维修破坏的压紧螺丝;平衡色谱柱。 准备GPC/HPLC系统 系统 2.1 准备 2.1 在将色谱柱接到GPC/HPLC系统流路前,应该先准备系统:

HILIC色谱柱简介

HILIC色谱柱简介: 1. HILIC的概念 亲水色谱(HILIC)是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。它通过采用强极性固定性,并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱(ESI-MS)的灵敏度。2. HILIC的分离机制 HILIC的分离机理在目前还存在着争议,主要包括以下三个方面:(1)分配机理(2)离子交换(3)偶极-偶极相互作用。更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应,很难将其区分开来。。。。。” HILIC方法开发经验大披露: 1. HILIC色谱柱的以waters 公司的HILIC色谱柱为例,分为HPLC和UPLC两种类型,又分为Atlantis,Xbridge,Acquity三个品牌。填料类型分为BEH,无封尾和Amide填料三种。 2. HILIC色谱柱的应用范 普通反向色谱难以保留的物质。 3.HILIC的对化合物的保留原理: 亲水性吸附,离子交换和氢键作用。 应用小TIPS: 1.HILIC柱如何平衡? HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。 2.HILIC柱如何保存? HILIC柱使用90%的乙腈水溶液保存。 前言: 1. 一直使用Waters 的HILIC较多,感觉质量还行,但是要小心waters 的HILIC是分两种类型的填料的BEH HILIC和HILIC。 很多waters 的销售都不清楚之一点。但是大家一定要注意,这两款的区别是很大的,保留的效果是不同的。 2. 费罗门公司的HILIC柱,感觉是小家碧玉型的,保留能力不是太强,但是清秀文雅,峰型很好看。 3. HILIC的流动相推荐使用乙腈。 4. 推荐使用乙酸铵,这也以后再说。 5.不能使用100% 的乙腈,推荐使用到95%就行了。 不能使用60%一下的乙腈。 所以梯度范围小。但是足够用了。 因为100%的乙腈可能对HILIC的中亲水的部分不利于键合相的伸展开。使得保留性能下降。

色谱柱的维护和使用指南

ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱的维护和使用指南 感谢您选择Waters公司的ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱,它是专门为了配合Waters的ACQUITY UPLC色谱系统设计的。它采用超纯试剂在满足GMP要求并获得ISO9001认证的条件下生产。ACQUITY UPLC TM BEH的每批填料都会用酸性、碱性和中性化合物的色谱分离进行检验,并且填料的指标控制非常严苛,以保证色谱柱卓越的重现性。每一根ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱都是单独检测,色谱柱的性能图谱和填料的批次检验证书一起存储在eCord TM芯片上。 请注意: 我们不建议将ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱用于普通的HPLC仪器。 内容: 第一节开始 A/ 色谱柱的连接 B/ 色谱柱安装 C/ 色谱柱平衡 D/ eCord TM安装 E/ 新色谱柱柱效测试 第二节色谱柱的使用 A/ 样品的准备 B/ pH范围 C/ 溶剂 D/ 压力 E/ 温度 第三节 色谱柱的清洗、再生和保存 A/ 清洗和再生 B/ 保存 第四节 eCord TM智能芯片技术介绍 A/ 简介 B/ 安装 C/ 生产信息 D/ 色谱柱使用信息 其它补充信息 A/ 延长ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱使用寿命的小秘诀 B/ ACQUITY UPLC BEH色谱柱的建议流速和压力 C/ 开始使用ACQUITY UPLC TM BEH HILIC色谱柱 第一节开始 每一根ACQUITY UPLC TM BEH色谱柱的eCord TM智能芯片上都有针对填料的分析报告和针对色谱柱的性能报告:分析报告是针对填料的批次测试报告,其中包括填料的批号、非键合颗粒以及键合颗粒的分析、测试图谱和测试的色谱条件;性能测试报告是针对每根色谱柱的测试报告,包括以下信息:填料批号、色谱柱序列号、塔板数、拖尾因子、容量因子以及测试的色谱条件。用户应该储存这些信息用于将来的参考。

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