植物基因的图位克隆

?综述与专论?植物基因的图位克隆①

Map-based Cloning for Plants Gene

王泽立1 戴景瑞2 王　斌3

WA N G Z e-li1　D A I J ing-rui2　WA N G Bin3

1山东农业大学,泰安271018;2中国农业大学,北京100094;3中国科学院遗传所,北京100101

1　Shandong Agricultural University,Tai-an271018;2　China Agricultural University,Beijing100094;3　Institute of G enetics of Chinese Academy of Science,Beijing100101,China

摘　要:　图位克隆是分离基因的有效方法,本文概述了植物基因图位克隆的研究进展,主要包括图位克隆的一般策略、相关技术、发展前景和其它基因组领域研究于其带来的有益借鉴。

关键词:　分离群体;分子标记;基因;图位克隆

Abstract:　Map-based cloning has already become a valuable method for gene isolation.This paper summarized the pro2 gresses of the map based cloning and described the strategies in which should be adopted to clone a gene in plant.And,the main steps for map based cloning are discussed also.

K ey word:　Segregate population;molecular marker;gene;map-based cloning

中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编码:1002-5464(2000)04-021-07

随着作物遗传水平的不断提高和对生物新技术的渴求,研究者对诸如育种材料的遗传多样性、亲本选择指标、后裔评价方法等提出了更高的要求。因此从表现型选择到基因型鉴别,特别是对有益基因定位、克隆、转移和累加,是人们为获取高产、优质、多抗新品种(系)而应该关注的研究工作。然而无论对于控制质量性状的单(寡)基因还是与大多数农艺性状有关的微效多基因来说,对其进行克隆都需要建立和发展相关的技术和方法。现代遗传学的发展为建立基因克隆新技术提供了理论指导。从遗传学的观点来看,克隆基因的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行;反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。由于绝大多数控制重要农艺性状的基因产物及调控机制尚不清楚,走正向遗传学之路困难较多,而反向遗传学途径则显示出较好的前景。

循反向遗传学途径克隆基因有三种主要方法可资利用,分别是转座子示踪法、随机突变体筛选法和图位克隆法。其中,转座子受其种类、活性、数量的制约,随机突变体筛选法则随机性较大且不能控制失活基因的种类和数量,也限制了其使用。比较而言,图位克隆法随着相关配套技术的日渐成熟,数十个与农业生产密切相关的作物基因已被成功的克隆[1,2,3,4,17,18,19](表1)。本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍,以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所助益。

1　图位克隆的一般策略

图位克隆(Map-based cloning)又称定位克隆(cloning),1986年首先由剑桥大学的Alan coulson提出[5],用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根

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①作者简介:王泽立,1957年生,男,博士,教授。主要研究方向:玉米遗传育种。

收稿日期:2000-01-20

据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F、DH、BC、RI等。二是开展以下几项工作:1)首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;2)用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;

3)构建含有大插入片段的基因组文库(BAC库或YAC);4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;6)通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;8)通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。下面将对其中几个关键环节予以叙述。

表1　迄今已发表的用图位克隆法克隆到的植物基因

基因植物突变表型基因同源序列文献

AB13拟南芥脱落酸不敏感玉米转录子G irandat,et al.1992 FID3拟南芥降低亚油酸饱和度细菌去饱和酸酶Arondel,et al.1992

Bent,et al.1994 AXR1拟南芥生长素抗性泛素N端活性酶Leyser,et al.1993 ETR1拟南芥乙烯抗性双因子调节子Chang,et al.1993 ABI1拟南芥脱落酸不敏感钙调蛋白磷酸化酶Leung,et al.1994 DET1拟南芥黄化损伤反应新核蛋白Pepper,et al.1994 RPS2拟南芥抗病新型富含亮氨酸的蛋白酶Mindrinos,et al.1994 RPM1拟南芥抗病激酶Grant.1995

RSW1拟南芥纤维素合成酶细胞色素P450家系Arioli,et al.1998

Z LL拟南芥调节中茎分生细胞胚胎发育蛋白Motuschak,et al.1998 PRT1拟南芥抑制胞间蛋白降解控制植物N端代谢Potuschak,et al.1998 Tornadol拟南芥短化Cnops,et al.1996

Cf-2番茄抗软腐病亮氨酸重复蛋白Dixon,et al.1996

Pto番茄抗霜霉病丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶Martin,et al.1993 CHLO-番茄铁吸收香素合成酶Ling HQ,et al.1997 Rpg1,Rpg4大麦抗虫未知K ilian,et al.1997 Mlo大麦抗黄矮病膜定位蛋白及络蛋白激酶Bilschges,et al.1997 Rarl大麦抗黄矮病蛋白激酶Lahage,et al.1997 Xa21水稻抗白叶枯病受体激酶S ong,et al.1995

Grant1995

Xal水稻抗白叶枯病NBS-L RR Y oshimura et al.,1998 I2C水稻抗枯萎病蛋白激酶Cri N,et al.1997

Pi-b水稻抗稻瘟病蛋白激酶Monna et al.,1997

2　图位克隆的技术环节

2.1　构建遗传作图群体

用于作图群体的类型可有多种。一般说来,在这类群体中,异花授粉植物分子标记的检出率较自花授粉植物的高。但是对于基因的图位克隆而言,培育特殊的遗传群体是筛选与目标基因紧密连锁的分子标记的关键环节。这些遗传材料应该满足这样的条件:即除了目标基因所在座位的局部区域外,基因组DNA序列的其余部分都是相同的,在这样的材料间找到的多态性标记才可能与目标基因紧密连锁。

目标基因的近等基因系(N ILs)是符合条件的一类群体。近等基因系是指几乎仅在目标性状上存在差异的两种基因型个体,这可通过连续回交的途径获得。由于N ILs的遗传组成特点,一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记就极有可能位于目标基因的两翼附近。Martin等(1993)就是用RAPD技术分析番茄Pto基因的近等基因系而获

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得了与该基因表现共分离的分子标记,以该分子标记为探针筛选基因组文库而实现了染色体登陆。目前我们利用AFL P技术分析玉米CMS-S型雄性不育的恢复基因及近等基因系,已获得与目标基因紧密连锁的分子标记并以其用作分离Rf3基因的探针。

一般说来,当标记为显性遗传时,欲获得最大遗传信息量的F2群体,须借助于进一步的子代测验,以分辨F2中的杂合体。为此,Michelmore等(1991)发明了分离群体分组分析法(bulked segregant anal2 ysis,BSA)以筛选目标基因所在局部区域的分子标记。其原理是将目标基因的F2(或BC)代分离体的各个体仅以目标基因所控制的性状按双亲的表型分为两群,每一群中的各个体DNA等量混合,形成两个DNA混合池(如抗病和感病、不育和可育)。由于分组时仅对目标性状进行选择,因此两个DNA 混合池之间理论上主要在目标基因所在局部区域的差异,这非常类似于N ILs,故也称作近等基因池法。

研究表明,近等基因系法,分离群体分组分析法再结合AFL P等强有力的分子标记技术使人们能够在短时间内从数量众多的分子标记中筛选出与目标基因紧密连锁的标记。更为有意义的是,这种策略在尚未构建遗传图谱的物种中也是可行的[19]。2.2　筛选与目标基因连锁的分子标记

实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上,分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因,对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止,已有几十种技术可用于分子标记的筛选(见表2)。这些技术有别于最初的形态标记、细胞学标记和生化标记,一般表现出稳定、可靠的特点,有的使用成本也相对较低,特别适用于筛选与目标基因紧密连锁的标记,尤其是与目标基因共分离的标记。因此能够加快克隆基因的进程,研究者可依据不同的研究目标、对象、目的、条件等,选择使用这些技术。

值得提及的是随着分子标记技术的发展,一些植物的遗传图谱构建和比较基因组的研究也有了长足的进步,它们相得益彰,互为促进,为基因的图位克隆提供了有益的借鉴。

表2　主要的分子标记技术

1)Classical,Southern hybridization based marker techniques 以传统的Southern杂交为基础的标记技术

RFL P:Restriction Fragment Length Polymorphism限制性内切酶酶切片段长度多态性标记

SSCP-RFL P:Single Strand Conformation Polymorphism-RFL P单链构象多态性RFL P

D GGE-RFL P:Denaturing gradient gel electrophoresis-RFL P变性梯度凝胶电泳-RFL P

2)PCR-based marker techniques以PCR为基础的分子标记技术

RAPD:Randomly Amplified Polymorphic DNA随机扩增多态性DNA

STS:Sequence Tagged Site测定序列标签位点

EST:Expressed Sequence Tag表达序列标签

SCAR:Sequence Characterized Amplified Region测序的扩增区段

RP-PCR:Random Primer-PCR随机引物PCR

AP-PCR:Arbitrary Primer-PCR任意引物PCR

OP-PCR:Oligo Primer-PCR寡核苷酸引物PCR

SSCP-PCR:Single Strand Conformation Polymorphism-PCR单链构象多态性PCR

SODA:Small Oligo DNA Analysis小寡核苷酸DNA分析

DAF:DNA Amplification Fingerprinting DNA扩增产物指纹分析

CAPS:Cleaved Amplified Polymorphic Sequences酶解扩增多态顺序

AFL P:Amplified Fragment Length Polymorphism扩增的限制性内切酶片段长度多态性

SNP:Single Nucleotide Polymorphisim单核苷酸多态性

SAP:Specific Amplicon Polymorphism特定扩增的多态性

3)Repeat sequence based marker system以重复顺序为基础的标记

Satellite:卫星DNA(重复单位为几百～几千碱基对)

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MS:Microsatellite:微卫星DNA(重复单位为2～5碱基对) SSL P:Simple Sequcuce Length Polymorphism简单顺序长度多态性

Minisatellite:小卫星DNA(重复单位为大于5个碱基对) SSR:Simple Sequence Repeat简单重复顺序即微卫星DNA标记

SSRP:Simple Sequence Repeat Polymorphism简单重复顺序多态性即微卫星DNA标记SRS:Short Repeat Sequence短重复顺序

TRS:Tandem Repeat Sequence串珠式重复顺序

4)mRNA based marker techniques以mRNA为基础的分子标记技术

DD:Differential Display差异显示

RT-PCR:Revert Transcription PCR逆转录PCR

DDRT-PCR:Differential Display Reverse Transcription PCR差异显示逆转录PCR

AFL P-based mRNA fingerprinting基于AFL P的mRNA指纹分析

2.2.1　借助连锁图谱筛选分子标记

当基因图位克隆策略刚刚提出的时候,植物分子连锁图谱的构建尚处于萌芽阶段,当时找到一个与目标基因连锁的分子标记通常要花费数月甚至数年的时间。在过去的十年里,这种状况有了显著改善,由于可以很方便的建立和维持建图所必需的较大的分离群体,因而植物分子连锁图构建工作的发展速度超过了动物的同类研究。现在业已建图的植物已多达几十种,其中包括了所有重要的农作物,水稻,玉米,蕃茄,小麦,马铃薯,拟南芥等重要经济作物和模式植物的遗传图谱已相当精细,含有数百甚至数千个标记[6]。高密度分子连锁图的绘制为筛选与目的基因紧密连锁的分子标记提供了良好的开端。比如,蕃茄的遗传图谱含有1000个分子标记,其基因组大小约为1000×106bp(即1000×1000kbp),因此对任何基因,都可以找到与之相距在1000kbp之内的分子标记。

2.2.2　借助比较基因组共享分子标记

比较基因组研究主要是利用相同的DNA分子标记(主要是cDNA标记和基因克隆)在相关植物种之间进行遗传或物理作图,比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点,揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同(共线性)或相似性(同线性),并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。已有的研究表明,存在生殖隔离的不同植物物种之间在标记探针的同源性,拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。如番茄,马铃薯和辣椒;水稻、小麦和玉米;小麦、黑麦和大麦;高粱和玉米;拟南芥和芸薹属;以及大麦和水稻。更为有趣的是,Moore等(1995)同时对水稻、小麦、玉米、谷子、甘蔗及高粱等6种主要禾本科物种的基因组进行了比较作图研究,结果表明其中基因组最小的水稻居于中枢的位置,即这些禾本科植物基因组的保守性可归结到水稻基因组的19个连锁区段上。由这19个区段可实现对所研究的全部禾谷类作物染色体的重建,并可构成一个禾谷类作物祖先种的染色体骨架。通过这一研究,人们对禾谷类作物的进化演变历程有了更深入的认识。植物比较基因组十年的研究成果表明,在更广的范围上,包括禾本科、十字花科、豆科植物及一些树木的基因组在基因组成和基因排列顺序上都存在很大程度的一致性[7]。而在包括小麦、玉米和水稻等重要农作物的禾本科作物上,基因组成和排列顺序的一致性非常完好,人们可以在模式植物水稻上用图位克隆技术克隆相关物种的大多数重要基因。此外,比较基因组研究还给人们一个重要的启示,那就是模式植物上遗传作图的成果可推而广之,这对那些遗传作图工作相对滞后的植物尤其重要。比较基因组作图使我们建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加。从而大大提高获取离目标基因很近的分子标记的可能性[8]。

2.3　局部区域的精细定位、作图

一旦把目标基因定位在某染色体的特定区域后,接下来就要对其进行精细的作图及筛选与目标基因紧密连锁的分子标记。目前的作图类型分为两类,分别是遗传图谱和物理图谱。

2.3.1　遗传图谱的构建

染色体的交换与重组是遗传图谱构建的理论基

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础,通过作图群体的分析,如果一个基因与两侧最近的分子标记距离均在2cM以上,就需要作精细的遗传图谱。因为即使是在小基因组水稻中,平均1cM 也相当于250kb左右的物理距离,如果在着丝粒附近就可能相当于1000kb左右,需要进行若干步的染色体步行,非常费时费力,因此,精细的遗传图谱对图位克隆显得非常重要,而增加遗传图谱上的分子标记数目是精细作图的基础。在一个已知区域内增

,第一种方法是整合已有的遗传图谱。如将生理、生化、分子标记图在同一区域内整合在一起,就会提高分子标记的密度。另一种方法是寻找新的分子标记。在植物上,精细作图的发展速度超过了动物的同类研究,这主要是因为在植物上可很方便地建立和维持较大的分离群体,并建立了几种不同的检测标记间连锁关系的统计软件。现在,业已建图的植物已多达几十种,其中包括了所有重要的农作物(Tanksley,1995),如玉米、番茄、水稻、小麦、大麦、燕麦、大豆、高粱、油菜、莴苣、马铃薯等。尤其值得一提的是,过去被公认为难以开展遗传作图的木本植物,如今也涌现出了许多密度可观的分子标记连锁图,如苹果和松树等。由于许多科学家的共同努力和连年的工作积累,已有越来越多生物的遗传图谱趋于饱和,这就为生物的物理图谱的构建奠定了基础。

2.3.2　物理图谱的构建

由于分子标记与目标基因之间的实际距离是按碱基数(bp)来计算的,它会因不同染色体区域基因重组值不同而造成与遗传距离的差别,所以物理图谱是真正意义上的基因图谱。物理图谱的种类很多,从简单的染色体分带图到精细的碱基全序列都是物理图谱。最为常用的物理图谱有限制酶切图谱、跨叠克隆群和DNA序列图谱等。限制酶切图谱是用几种限制性内切酶消化DNA,通过电泳检查限制性片段长度的办法确定它们的排列顺序;对于较大的基因组,可以利用稀有切点限制性内切酶和脉冲电脉。制作跨叠克隆群则需具有一定容量的大片段基因组文库。比较各个克隆的插入片段,将它们排列成与原来在染色体中的顺序一样的连续克隆群。即跨叠克隆群(也叫重叠克隆群)。

跨叠克隆群的制作方法有三种[16,17,18]:1)菌落杂交法。其基本原理是利用基因组某一区域特有的或与所需分离的目标基因紧密连锁的DNA分子标记为探针筛选大片段基因组文库,可以分别得到一系列的阳性克隆,这些克隆之间有部分片段是重叠的,根据其重叠部分可以把它们有序地呈线状排列成跨叠群(contig)。在两个跨叠群之间会出现空隙,需要通过染色体步行来填补。该技术从分离大片段阳性克隆群的左、右末端入手,以它们为探针再次筛选基因组文库,获得新的克隆即为沿着染色体向前走了一步,重复这一过程,就能一步一步地将空隙填满,将两个克隆群整合在一起,这一方法能利用各种分子标记扫描文库,准确得到携带分子标记的阳性克隆,是构建跨叠克隆群的首选策略。2)PCR法。即以PCR技术为基础发展了一系列技术,包括STS、RAPD、AFL P和Alu-PCR等已被广泛应用于跨叠克隆群的构建。STS策略是利用已知核苷酸序列,从两端合成两个与其配对的引物,利用PCR进行扩增,理论上讲具有相同扩增带型的克隆,也可以说共享一个或数个STS位标的克隆肯定是跨叠的。这个方法具有简便、快速、精确度高等优点,是人类基因组计划所采用的主要策略之一。另一重要的基于PCR的策略是Alu-PCR技术,该技术利用人类基因组的Alu重复序列,合成一对特异性引物,进行PCR扩增,然后以PCR产物为探针,从文库中筛选出阳性克隆。这一方法简便,但有时会出现一些误差,当与限制性内切酶物理图谱结合使用时,就可以比较精确地排列出阳性克隆的重叠顺序。3)DNA 指纹-锚标法。其原理是:首先对随机克隆的DNA 选定一个6碱基识别位点的限制性内切酶消化,然后用放射性同位素进行末端标记,经标记后DNA片段用另一个4个碱基识别位点的限制性内切酶消化,用序列分析胶分离这些片段,然后经放射性自显影检测。这些指纹图谱数据经计算机处理后,根据片段的相似性,构建跨叠克隆群。

荧光原位杂交技术(Fiber-FISH)是最近几年新发展的方法[10],它使FISH技术的分辨力接近其理论值1Kb(相当于～0.14μm的DNA纤丝),即光学显微镜的识别范围内。Fiber-FISH适宜于基因组的数量作图。而且由于可以在荧光显微镜下同时观察几种探针的位置和顺序,将有效地排除染色体

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步行过程中经常遇到的复重序列带来的困难。这些物理图谱的构建,无疑给图位克隆感兴趣的基因奠定了坚实的基础。

2.4　构建高质量的基因组文库

高质量的大片段基因组文库是基因图位克隆的另一关键。图位克隆的基因组文库主要是柯斯质粒文库或人工染色体文库。虽说图位克隆在理论上适用于任何物种,主要还是用于真核生物。真核生物一般都有内含子,一个基因往往长达几个到几十个Kb,只有容纳大片段插入子的克隆载体,才能携带完整的基因。柯斯质粒从λ噬菌体改造而来。由于采用质粒的复制子,柯斯质粒克服了包装的限制,插入片段可达40～50Kb。虽然如此,柯斯质粒还是不敷应用,就又发展了人工染色体技术。人工染色体在细胞周期中可以正常复制,配对和分离。作为载体,人工染色体的插入片段可达2Mb左右,能够覆盖完整的真核基因。最早发展的人工染色体是YAC。1983年,Murray等首次构建了总长度为55Kb的YAC。1987年,Burke等得到了能够克隆大片段DNA的YAC载体,证明YAC可以构建高等生物的完整基因组文库。YAC具有比较大的容纳能力,但不太稳定,嵌合体比例也较高,而且难与酵母自身的染色体分开[19]。后来陆续发展了P1、BAC、PAC等几种以细菌为寄主的载体系统。值得提及的是进展一直缓慢的哺乳动物人工染色体(MAC)和人类人工染色体(HAC)也已取得突破性进展。

2.5　染色体步行、登陆

找到与目标基因紧密连锁的分子标记(最好分布在基因两侧)和鉴定出分子标记所在的大片段克隆以后,接着是以该克隆为起点进行染色体步行,逐渐靠近目标基因,以该克隆的末端作为探针筛选基因组文库,鉴定和分离出邻近的基因组片段的克隆,再将这个克隆的远端末端作为探针重新筛选基因组文库。继续这一过程,直到获得具有目标基因两侧分子标记的大片段克隆或跨叠群[10]。如果目标基因所在区域已经完成分子作图,就有一套现成的顺序排列的大片段克隆可以利用。当遗传连锁图谱指出基因所在的特定区域时,即可取回需要的克隆,获得目标基因。

染色体步行的主要困难在于,当必须经过一个无法克隆的片段时(如对寄主无害),步行的过程会被打断;当克隆的一端是重复序列时,步行的方向会步入歧途。为了克服这些困难,发展了染色体登陆、跳步和连接等方法。染色体登陆是找出与目标基因的物理距离小于基因组文库插入片段的平均距离还小的分子标记,通过筛选文库直接获得含有目标基因的克隆,完全避开染色体步行的过程[6]。染色体跳步—连接是使用一个识别位点很少的酶和一个识别位点很多的酶构建跳步文库和连接文库[12]。跳步文库的插入片段是大片段克隆末端经过双酶切的部分,由同样的文库进行克隆。连接文库的插入片段是由切点较少的酶产生的,具有切点较少的那个酶的识别位点。在染色体步行的过程中,交替应用两个文库进行跳步和连接,最终逼近目标基因。

2.6　鉴定目标基因

在与目标基因紧密连锁的分子标记及大插入片段基因组文库都具备的情况下,就可以该分子标记为探针通过菌落杂交,蓝、白斑挑选的方式筛选基因组文库而获得可能含有目标基因的阳性克隆。这些阳性克隆中可能含有多个侯选基因,从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库[13],并查询生物数据信息库,待找出侯选基因后,把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因:(1)精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离;(2)检查cDNA时空表达特点是否与表型一致;(3)测定cDNA序列,查询数据库,以了解该基因的功能;(4)筛选突变体文库,找出DNA序列上的变化及与功能的关系;(5)进行功能互补实验,通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。3　现状和前景

生命科学研究已进入基因组时代。图位克隆是最为通用的基因识别途径,至少在理论上适用于一切基因。基因组研究提供的高精度遗传图谱、大尺度物理图谱、大片段基因组文库和基因组全序列,为图位克隆的广泛应用铺平了道路。现在,图位克隆已经成为分离基因的常规方法[14]尤其令人鼓舞的是,DNA芯片和微列阵的发明为图位克隆的应用展

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示了巨大的潜力和光明的前景。DNA芯片或微列阵[15]与SN P和cDNA相结合在基因的定位、筛选和鉴定方面具有无比的优越性[20],相信能大大提高图位克隆的效率。

90年代以来,我国先后组织实施了水稻基因组计划和人类基因组计划。我国科学家紧跟世界新技术的发展,积极开展图位克隆研究,在分离、利用水稻和人类的重要基因方面取得了突破性进展。1995年,中国科学院遗传研究所的宋文源等与美国加州大学戴维斯分校的科学家合作,成功地采用图位克隆方法获得了水稻的白叶枯病抗性基因Xa21。目前我国从队伍建设到基因技术(包括基因克隆)的引进和发展等方面都有相当的基础。考虑到起步较晚和作图、测序的巨大费用,我国的各种动植物基因组研究也只能采取在八五期间就确定先拿基因的策略[21]。至于拿到基因后的不同植物有效转化系统的建立则另当别论了。鉴于各种植物的抗病虫基因和与品质改良有关的基因对于我国的高技术产业、卫生保健、农业生产和权益保护等具有特别重要的意义,毫无疑问,图位克隆对于分离这些基因必将发挥重要的作用。

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