用AFLP技术和16S rDNA PCRRFLP分析毛苜蓿根瘤菌的遗传多样性
!联合国教科文组织的短期进修基金资助作者简介：冯瑞华（!"#$%），女，陕西临潼人，中国农业科学院土壤肥料研究所助理研究员，硕士，!""&年赴美国农业部农业研究中心研修，主要从事农业微生物学的研究用+,-.技术和!#/012+.34’4,-.分析
毛苜蓿根瘤菌的遗传多样性!
冯瑞华
（中国农业科学院土壤肥料研究所
北京!(((*!
）摘
要：采用选择性扩增片断长度多态性（简称+,-.）12+指纹技术对采自我国云南省与西
藏交界的高山地区的野生型豆科植物毛苜蓿根际土样分离的$"!株毛苜蓿（!"#$%&’("#’")*(+,-$$
）根瘤菌进行遗传多样性的研究。从+,-.图谱中，揭示出毛苜蓿根瘤菌有较显著的遗传多样性，从$"!株中选择出"(个代表株用计算机进行树状图的分析。结果表明，所分析的菌株在&"5的相似性水平上聚类成)个群。对这"(个代表株进行多聚酶链反应（.34）扩增的!#/012+的6种限制性内切酶长度多态（简称!#/012+.34’4,-.）分析，得出$个不同的!#/012+.34’4,-.类型的菌株。分别选出这$个类型的代表菌株与各种根瘤菌的参比菌株进行!#/012+.34’4,-.分析，再进行树状图的分析，初步得出了它们在根瘤菌系统分类中的地位。分析结果表明：毛苜蓿根瘤菌与根瘤菌属中的.-$/(0$122(3’(4"35"的相似性很高。
关键词：+,-.，!#/012+.34’4,-.，毛苜蓿根瘤菌中图分类号：7")"
文献标识码：+
文章编号：(((!%#$("（$(((）(6%())"%68
紫苜蓿（!"#$%&’(5&,$6&）是世界上最多产的，营养丰富的并且分布广泛的牧草豆科作物之一，在我国分布也非常广泛。它的共生体根瘤菌（.-$/(0$122"4$4(,$）
被重新定名为苜蓿中华根瘤菌（7$3(+-$/(0$122"4$4(,$）［!］。苜蓿属（!"#$%&’
(）在世界上有#(多个不同的品种，我国有几十种，并且有几种独特的野生品种，毛苜蓿（!"#$%&’("#’"*(+,-$$）就是其中的一种有开发潜力的新的牧草作物，它的一些优良的遗传特性有可能用于改良紫苜蓿。因此，在发掘新的牧草植物资源的同时，对它的共生体根瘤菌资源进行研究具有重要的意义。
近几年基于.34的多种12+指纹图谱新技术已广泛应用于根瘤菌遗传多样性的分
析中［$!6］，而+,-.是最近$!)年发展起来的一种新的12+指纹图谱技术［8］，随后也发展起来成为又一应用于细菌分类的新技术［#］。本研究将这一新技术应用到根瘤菌的
分类研究。采用这一新技术及!#/012+.34’4,-.分析，对$"!株毛苜蓿根瘤菌进行遗传多样性研究，探讨这一野生型牧草豆科植物其共生体的基因组的多样性背景以及与其他的根瘤菌种的遗传关系，进而确定它的分类系统发育地位，为将来应用这一新的牧草植物奠定基础。
6(卷6期$(((年*月
微生物学报
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!材料和方法
!"!菌株及其培养
从我国云南省与西藏交界的海拔!"""!!#""$的高山地区的%个地区的!种土壤的野生型豆科植物毛苜蓿根际土样中分离的毛苜蓿根瘤菌&’(株（毛苜蓿作寄主捕捉），各种的参比根瘤菌株(#株。由于实验菌株量大，
不在这里详细列出，只列代表株及参比菌株（见表(）。实验菌株经纯化及原寄主回接确认，所有菌株均用)*+培养基培养［,］
。
表!供试菌株一览表
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所采用的引物均由美国宾夕法尼亚洲的G ?.*8:?9，F 9)，H *99/合成。用于I G J 扩增反应的$4%聚合酶为美国I *8-/9K 3<*8公司的2<>3/A 2C
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所有的I G J 扩增反应均在I *8-/9K 3<*8L 5=*30M ’热循环仪上进行。
!")&*+,分析
本实验采用简化的%N H I 程序。基因组的酶切、连接和扩增按文献［M ］所述的方法进行，不同的是%N H I 中第二个扩增反应的引物(’端为含有(个选择性核苷酸。由于实验菌株多，而采用一组引物中的一种（%G %），I G J 产物在水平电泳槽（,!’< !"-!-./$%&,0121*+,分析 !"-"!I G J 扩增：用引物@$!和8$!［&］ 进行!+#8$4%片断的扩增。I G J 以应的总体积为M ’! H ，分别含有,"!’9C 的纯基因组$4%，!’<<53／H!+#8$4%I G J 缓冲液（Q ’<<53／HR G H ，!P A 8/659S T !’’，!’<<53／HA 8/:>U&7’），!7Q <<53／HL C G 3,，,’<<53／H （每种）=%A I ，=G A I ，=A A I （%<*8:12 L 的引物@$!和8$!，+70"的A 2C $4%聚合酶。反应为(Q 个循环，每一循环的程序为&0V 变性! !"-"#限制性片断多态性分析：!+#8$4%I G J 扩增产物分别用9:%#;*+#，9,&# 和;’3<# （%<*8:12 !"3&*+,和!-./$%&,0121*+,结果分析 凝胶电泳结果在紫外光线下拍摄为正片或负片，将图片进行扫描存于计算机中。用$4%I 85:)29公司（美国）的I 85:)58*软件，计数片断长度（位置）。对应每个酶切电泳图谱照片，凡是电泳图谱上不同菌株间迁移速率相同的带（片断长度一样）被认为是同一性状，相应与每个菌株，在此位置上有扩增带的编码为“!”，无扩增带的编码为“’”，转换成计! 0(0期冯瑞华等：用%N H I 技术和!+#8$4%I G J S J N H I 分析毛苜蓿根瘤菌的遗传多样性 !结果和讨论 !"#$%&’分析本实验用!"#$分析了%&’株毛苜蓿根瘤菌，其$()产物琼脂糖凝胶电泳出现&’个带谱，其分子量大小范围在*+,!-./01（限于篇幅未给出其23!指纹图谱）。从!"#$图谱中， 揭示出大多数毛苜蓿根瘤菌株间基因组存在着较显著的多样性。根据!"#$的电泳指纹图谱，选择出作为%&’株毛苜蓿根瘤菌的代表株&-个用计算机进行分析，绘制出树状图（见图’）。从图’中看出，所分析的&-株菌株在4&5的相似性水平上分为/个群。群’由’,个菌株组成，在6’5的相似性水平上分为%个亚群；群%由7&个 菌株组成，在&-5的相似性水平上分为’’个亚群；群/由7个菌株组成，在6,5的相似性水平上分为%个亚群。同时可以看出各群与亚群的菌株间基因组的遗传多样性分布与菌株的地理来源和土壤类型之间没有一定的联系。 !(!#)*+,-$’./0/%&’分析 用引物82’和92’对%&’株毛苜蓿根瘤菌中的&-个代表株进行’7:923!扩增，其扩增产物用’5琼脂糖凝胶电泳检查，均产生约’+,01的23!带（以"23!／!"#)#;$%&’$作分子量标记），该结果表明毛苜蓿根瘤菌与其它根瘤菌的’7:923!的分子量是相同的。扩增产物分别用*种限制性内切酶（()##，$*+#，(,-#，$%&.#）酶切，&-个代表株得到%种不同的’7:923!$()<)"#$图谱（图略）。分别选出这两种类型菌株的代表株与’6株根瘤菌的参比菌株一起进行’7:923!$()<)"#$分析。结果是酶切图谱有’&类型，分别用字母=—>标识 （见表’）。从酶切图谱类型可以看出，一种类型的毛苜蓿根瘤菌的)"#$图谱与根瘤菌属的/*%0#)%122#&3 #45&,5［’-］相同，而与其他根瘤菌的代表菌株之间差异明显。 为了更直观地反映毛苜蓿根瘤菌’7:923!$()<)"#$与各根瘤菌的参比菌株之间的相似性水平，将酶切图谱用计算机进行分析，获得聚类图（见图%）。如图所示，毛苜蓿根瘤菌与根瘤菌属的各参比菌株在6&5的相似性水平上聚类成一群，而不是聚类在中华根瘤菌属群里。它的一种)"#$类型的代表株*?%和%/?’/与/62#&3#45&,5聚类在一起，而另一种)"#$类型的代表株4?7和’*?,独立成一个分支，在&,5的相似性水平上与另一种类型的代表株聚类成亚群。 毛苜蓿是苜蓿属中的一种有开发潜力的野生品种，对它的共生体根瘤菌的研究未见有报道。本文就是采用!"#$23!指纹分析这一新技术对%&’株毛苜蓿根瘤菌进行了遗传多样性的研究。研究结果表明，毛苜蓿根瘤菌有着明显的遗传多样性。!"#$是一 种高分辨力和重复性好的23!指纹图谱技术［,］， 可应用于种和种下水平以及菌株之间的分类鉴定。通常是将$()产物用,5的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，但用在细菌类的原核生物的分类、鉴定及多样性研究中，操作起来就显得复杂和费时。而本文所采 用了简化的!"#$方法［6，’ ’］，该法具有较快速、简单和经济的优点，适合于根瘤菌的遗传多样性研究。 由于’7:923!$()<)"#$分析能够快速鉴定大量菌株在种、 属水平上的遗传关系，% */微生物学报 *-卷 分析毛苜蓿根瘤菌的遗传多样性 卷 ［!"］#$%&’()*+,，&’-’%’.，&$/0,，!"#$%&’"()* +",#-"!./0$，!112，!"：!3!445［!!］67$89’:;’(<，:9$(;’=>$%<’$*，?$#@’(A ’=+’5122 $3’4/.0’5/-.06/0$，!112，#!（B ）：!!2"!!!2C 5$%&%’()*(+%,-(’./0,1(2/3(4/0!"#$%&’("#’")(*+,$$ 3.40564&*,0564&45.-(-! 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分子标记技术的种类-标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性； ②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速； ⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原 分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显 DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响； 分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术 分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝 西北农林科技大学 2009级硕博连读研究生学位论文开题报告 黄牛、水牛和牦牛Y染色体分子遗传多样性与起源研究Y-chromosome Molecular Genetic Diversity and Origins in Cattle, Buffalo and Yak 学院：动物科技学院 学科、专业：动物遗传育种与繁殖 研究方向：动物遗传学 研究生：XX 指导教师：雷初朝教授 黄牛、水牛和牦牛Y染色体分子遗传多样性与起源研究 一、选题的目的与意义 黄牛、水牛和牦牛是我国3个重要的牛种，具有对周围环境的高度适应性、耐粗放管理、抗病力强、繁殖力高、肉质好等特点。这些地方牛种本身就是一座天然的基因库，正是进行杂种优势利用和进一步培育高产品种的良好原始材料。在当今世界畜禽品种资源日趋匮乏，品种逐步单一化的情况下，对我国这些牛种遗传资源的保护将对今后的育种工作产生很大的影响，起到难以估量的作用[1]。 中国黄牛的起源进化与遗传多样性一直是国内外动物遗传学家感兴趣的课题之一。一般认为，中国黄牛是多元起源的，并主要受普通牛和瘤牛的影响，但究竟起源于哪几个牛种，观点不一[2, 3]。在黄牛遗传多样性方面，自二十世纪八十年代以来，众多研究者分析了中国地方黄牛的核型，发现不同黄牛品种的Y 染色体形态具有明显的多态性，普通牛为中着丝粒或亚中着丝粒，瘤牛为近端着丝粒[4-6]。常振华等发现中国黄牛Y染色体主要属于Y2（普通牛）和Y3（瘤牛）单倍群[7]，但事实上黄牛的每种Y染色体单倍群下都可细分为多种单倍型，而中国黄牛由哪些Y染色体单倍型组成，有无优势单倍型以及单倍型的品种分布有无地理特点，与国外黄牛品种有何不同，这些问题都亟待阐明，以期为黄牛品种资源保护和杂交育种工作提供参考依据。 中国也拥有丰富的水牛资源。水牛的驯化时间，地点尚无定论，国内一些学者在形态学和考古学方面进行了一些研究，给中国水牛的驯化历史提供了一些参考[8, 9]，但仅靠形态学和考古学的研究是远远不够的，还需要分子遗传学的更多证据。目前国内外对水牛的起源研究主要是在线粒体DNA的母系起源方面，认为水牛有两个母系起源（A支系和B支系）[10-12]，近年来，也有中国学者对水牛的常染色体微卫星多态性进行了研究，其结果都表明中国水牛的遗传多样度丰富，倾向于支持中国水牛的本土起源假说[13, 14]。对Y染色体遗传多样性的研究，将提供更多的分子遗传学信息，会有助于评估水牛的遗传资源状况，也有助于阐明中国水牛的驯化历史。 牦牛主要分布于我国的青藏高原，俗称“万能种”，通常皆为兼用，如乳、肉、毛、皮、役力，是经济价值极高的珍贵畜种[1]。家牦牛是在青藏高原驯化的，藏族自古以来生息于西藏，是驯化牦牛之主，因此牦牛的驯化始终与藏族文化的发展休戚相关，是当地人民不可分离的生产和生活资料[15]。从牦牛生活的特定气候地带的适应性和生态地理、生理特征的表现看，牦牛是地球之巅特有的高寒环境中生存的一个宝贵的特化种，牦牛的驯化与繁衍有着与其他牛种极其不同的种类特点，牦牛对高寒山区的气候和贫瘠的草地所具有的特殊的适应性也是世界 中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析 任勤1，曹联飞2，赵红霞3,，王瑞生1，程尚1，罗文华1,曹兰1，姬聪慧*1 （1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.浙江省农业科学院，浙江杭州 310021；3. 广东 省生物资源应用研究所，广东广州 510260） 摘要：对中国具代表性的东方蜜蜂遗传资源中7个种群的线粒体DNA tRNA leu～ CO Ⅱ基因进行扩增和测序,并进行遗传多样性比较及亲缘关系分析。结果表明，共发现43个单倍型，其中10个单倍型在GenBank数据库对比确认属于新发现单倍型；7个群体中，阿坝中蜂、滇南中蜂和海南中蜂遗传多样性水平较高，长白山中蜂遗传多样性水平较低，其他群体遗传多样性居中；不同种群间遗传距离变化较大，其中海南中蜂与滇南中蜂、阿坝中蜂间的遗传距离最大，长白山中蜂与云贵中蜂、北方中蜂、华南中蜂间的遗传距离最小；聚类分析显示7个种群可聚为4个类群。 关键词：东方蜜蜂；遗传多样性；线粒体DNA 中图分类号：文献标志码：A Analysis of genetic diversity of Apis cerana populations in China REN Qin1, CAO Lianfei2,ZHAO Hongxia3,WANG Ruisheng1,CHENG Shang1,LUO Wenhua1,CAO Lan1, JI Conghui*1 （1.Chong Qing Academy of Animal Science，Chongqing 402460，China；2.Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Zhejiang 310021，China; 3.Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong 510260, China） Abstract:The mitochondrial DNA tRNA leu～CO II genes in 7 populations of Apis cerana Fabricius in China were amplified and sequenced, and their genetic diversity and phylogenetic relationships were analyzed. The results showed that a total of 43 haplotypes were identified, of which 10 haplotypes were identified new haplotypes in the GenBank database, Among 7 populations, Aba bee, Hainan bee and Yunnan bee have higher level of genetic diversity, Changbai Mountain bee has lower level of genetic diversity, other populationswere intermediate; The genetic distances between different populations varied greatly, of which Hainan bee andhave maximum genetic distance with Yunnan bee and Aba bee, The genetic distances between Changbai mountain bee and Yunnan bee, Middle China bee, Northern bee and Southern bee were small.; Cluster analysis showed that the 7 populations could be clustered into 4 taxa. Key words:Apis cerana Fabricius; genetic diversity; mitochondrial DNA 收稿日期： 基金项目:国家蜂产业技术体系基金项目（CARS-45SYZ15）;重庆市畜牧科学院基金项目(16421). 作者简介：任勤(1979-), 男, 宁夏固原人，助理研究员, 硕士研究生，主要从事蜜蜂方面的研究。 通信作者：姬聪慧(1980-)，女，河南平顶山人，助理研究员，硕士研究生。 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开，通过Southern印迹法，将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交，最后通过放射性自显影显示杂交带，即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时，酶切要彻底，注意内切酶的选择，对于亲缘关系很近的物种，可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛，其具有以下优点：①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，理论上可覆盖整个基因组，能提供丰富的遗传信息；②标记不受组织、环境和发育阶段的影响；③呈共显性，即杂交时等位DNA片段均呈现带，能区分纯合基因型和杂合基因型，F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3]，提供标记座位完全的遗传信息；④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠，重复性好。其缺点是：①操作繁琐，费时；②酶切后的DNA质量要求高；③使用放射性同位素进行分子杂交，有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD) 20世纪80年代，基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年，Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法，即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物，以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物的数量和大小发生改变，表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比，RAPD方便易行，DNA用量少，设备要求简单，不需DNA探针，设计引物也不需要预先进行序列分析，不依赖于种属特异性和基因组的结构；合成一套引物可以用于不同生物基因组分析，用一个引物就可扩增出许多片段，并且不需使用同位素，安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低，易产生错配，故实验的稳定性和重复性差，且为显性标记，不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感，这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制，即设计更长的引物。1993年，Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region，SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序，设计一对互补于原来 NTSYS-PC使用说明 1 数据的录入方法： 1.1 利用Ntedit直接录入数据 0、1二元数据中的数据缺失记为2。其中列标可以写为样品编号，在No.rows 栏中写入0、1数据总数，No.cols 栏中写入样品总数。文件另存为*.nts格式。 1.2 从excel表中直接读入数据 Excel表中输入数据格式如下图。A1必须为1，B1为0、1数据总数，C1为样品总数。 打开Ntedit程序，选择从Excel表输入，结果见上图。文件另存为*.Nts格式 1.3 Ntsys-pc可以直接运行*.phy格式的文件（由phylip和phytool产生） 1.4 DNA序列数据Ntsys-PC也可以分析，但好像用的人较少。建议大家使用phylip或者其他的软件。DNA序列数据在Excel 中输入格式如下： 1.5 其他数据的Excel输入如下： 2 聚类分析 Ntsys-pc2.02界面如下： 以下以图中数据为例介绍聚类过程： 2.1 首先用similarity程序组中的SimQual计算形似系数矩阵。Coefficient通常选用SM 或DICE，结果输出到另一文件 2.2 以上步的结果作为input file利用Clustering程序组中的SHAN或者Njoin进行计算，聚类分法选用UPGMA，ties选用FIND，Maximum no. tied trees至少大于样品数。 Njoin程序组界面如下，rooting method可以选用Outgroup，但需输入外元。 2.3 将SHAN或NJoin方法得到的tree file文件输入到Graphics程序组中的tree plot程序中计算 SPAGeDi1.3 a program for S patial P attern A nalysis of Ge netic Di versity by Olivier J. H ARDY and Xavier V EKEMANS with the contribution of Reed A. C ARTWRIGHT Copyright (c) 2002-2009 Olivier Hardy and Xavier Vekemans User’s manual Address for correspondence: Service Eco-éthologie Evolutive, CP160/12 Université Libre de Bruxelles 50 Av. F. Roosevelt B-1050 Brussels, Belgium e-mail: ohardy@ulb.ac.be Last update: 22 March 2009 Contents 1. Note about SPAGeDi 1.3 and installation 2. What is SPAGeDi ? 2.1. Purpose 2.2. How to use SPAGeDi – short overview 2.3. Data treated by SPAGeDi 2.4. Three ways to specify populations 2.5. Statistics computed 3. Creating a data file 3.1. Structure of the data file 3.2. How to code genotypes? 3.3. Example of data file 3.4. Note about distance intervals 3.5. Note about spatial groups 3.6. Note about microsatellite allele sizes 3.7. Using a matrix to define pairwise spatial distances 3.8. Defining genetic distances between alleles 3.9. Defining reference allele frequencies for relatedness coefficients 3.10. Present data size limitations 4. Running the program 4.1. Launching the program 4.2. Specifying the data / results files 4.3. Selecting the appropriate options 4.4. Information displayed during computations 5. Interpreting the results file 5.1. Basic information 5.2. Allele frequency analysis 5.3. Type of analyses 5.4. Distance intervals 5.5. Computed statistics 5.6. Permutation tests 5.7. Matrices of pairwise coefficients/distances 6. Technical notes 6.1. Statistics for individual level analyses 6.2. Statistics for population level analyses 6.3. Inference of gene dispersal distances 6.4. Estimating the actual variance of pairwise coefficients for marker based heritability and Q ST estimates 6.5. Testing phylogeographic patterns 7. References 8. Bug reports 微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性，使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点，并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外，本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状，并进一步提出其发展前景。 关键词：微卫星DNA；微卫星DNA标记；遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一，而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中，重复序列占有很大比重（＞50%）。按照重复序列在染色体上的分布方式，分为散布重复和串联重复（VNTR）两种类型。散布重复序列的拷贝数很多，在重复单位之间彼此常有序列的变化，难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中，卫星序列的重复单元大，一般分布在染色体的异染色质区，采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难；小卫星序列主要存在于染色体近端粒处，通常以15~75个核苷酸为核心序列，长度从几十到几千个碱基不等；微卫星序列一般较短，属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列（SSRs）或简单串联重复序列多态性（STRP）。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段（1-5个碱基）组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的，它极其丰富，分布在整个基因组中[1] 。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG（这里N 代表G、C或T）的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现，并且 通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2] 。（AT）n和（ATT）n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列，它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区，而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中，约29kb中有20bp的微卫星序列[4]，例如鹰嘴豆中（TAA）n、（GA）n和（CA）n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5]；而动物中，约每6kb中就有20bp的微卫星重复序列。另外，研究还发现植物中最丰富的微卫星是（A）n，其次是（AT）n，再次是（GA）n。 Weber[6]将微卫星分为3类：完全重复（无间隔）、不完全重复（有非重复单位的碱基间隔）和复合重复（2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现）。这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其他未知的过程来改变它们的长度，从而导致微卫星在数量上的差异[7]。微卫星的突变率高：每代每个配子的每个位点有2.5×10-5~1×10-2突变，因此造成了它们的多态性。但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。Davierwala等对水稻及其近缘种利用（GATA）n和（AC）n微卫星两侧的序列合成的引物进行PCR扩增，再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。测序分析的结果表明，不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。 尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚，但许多研究已经证明，重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记，是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。微卫星序列的重复单位小，而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性，因此得到了广泛的应用。微卫星通常是复等位的，代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫 分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长 细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方 法和电泳技术有一定难度 分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。 (1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定，重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类： 第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记； 第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。 几种主要的ＤＮＡ分子标记 分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。分子标记技术的种类
分子标记技术综述
DNA分子标记技术及其应用
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记技术
遗传多样性与起源研究
中国主要东方蜜蜂种群的遗传多样性分析
分子标记技术的种类Word版
ntsys-pc遗传多样性分析软件使用说明
遗传多样性空间格局分析软件spagedi简介
SSR分子标记简介
分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术简介