石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能及机理研究

JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.34No.42015

Studies on the Anti-Aging Effect of Ellagic Acid from

Pomegranate and Its Mechanism of Action

XING Xiaoping 1，YANG Xiaoxiao 1，2

，LU Jie 2，CAO Yuhua 2

（1.School of Chemical and Biotechnology,Yancheng Institute of Technology,Yancheng 224051,China ；2.School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China ）

Abstract ：The anti-aging effects and mechanisms of ellagic acid from pomegranate have been

studied.Firstly,free radical scavenging activity of ellagic acid was determined according to the elimination of DPPH ·OH and ·O 2-radicals by spectrophotometry as well as the elastase inhibition activity.Secondly,the mechanism of interaction between ellagic acid and elastase was investigated with fluorescence spectra.An 88.26%inhibition rate could be reached when the ellagic acid-elastase complex was formed if the concentration of ellagic acid was 4.57mg mL-1.The fluorescence quenching of elastase when interacted with ellagic acid was regarded as a static quenching when the concentration of ellagic acid was lower than 4.0×10-5mol L -1.The dynamic quenching increased when raised the ellagic acid concentration.Ellagic acid,a natural free radical scavenger and inhibitor,has great potential in the cosmetics industry as an anti-aging ingredient.Keywords ：ellagic acid ，anti-aging ，spectroscopy

摘要：利用光谱法研究了石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能和机理。首先，通过分光光度法考察了

鞣花酸对DPPH ·、·OH 和·O 2-等3种自由基的清除率和弹性蛋白酶抑制率，结果证明了鞣花酸抗衰老能力强。其次，以弹性蛋白酶为研究对象，利用光谱法探讨了鞣花酸对弹性蛋白酶的作用机理。结果表明，鞣花酸与弹性蛋白酶发生作用并形成络合物，当鞣花酸的质量浓度为4.57mg/mL 时，鞣花酸对弹性蛋白酶的抑制率高达88.26%。当鞣花酸浓度低于4.0×10-5mol/L 时，其荧光猝灭机理主要是静态猝灭，鞣花酸浓度较高时动态猝灭所占比例增加。因此，鞣花酸可以作为天然自由基清除剂与弹性蛋白酶抑制剂应用于抗衰老化妆品中。关键词：鞣花酸；抗衰老；光谱法中图分类号：S665.4文献标志码：A 文章编号：1673—1689（2015）04—0436—07

石榴皮中鞣花酸的抗衰老性能及机理研究

邢晓平1，杨笑笑1，2

，卢婕2，曹玉华2

（1.盐城工学院化学与生物工程学院，江苏盐城224051；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）

收稿日期：2014-05-21

作者简介：邢晓平（1975—），女，江苏滨海人，理学博士，副教授，主要从事天然产物研究。E-mail ：xingxiaoping@https://www.wendangku.net/doc/0f18238398.html,

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2015年第34卷第4期食品与生物技术学报

石榴（Punica granatum L ）是石榴科石榴属植物落叶灌木或小乔木，在陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自、新疆叶城等地均有广泛的种植。石榴皮是石榴的干燥果皮，含有丰富的鞣质类化合物，包括鞣花酸、安石榴苷、安石榴林，石榴亭A 、石榴亭B 等[1]。鞣花酸（Ellagic acid ，EA ）是石榴皮鞣质类化合物中最具代表性的单体，现有的药理研究显示鞣花酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗突变和抗致癌等活性[2-5]，还具有凝血、降压、镇静等作用[6]。

氧化是皮肤衰老的最大威胁之一，D.Harman 率先提出了自由基衰老学说，他认为机体衰老是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。一般情况下，机体内的自由基的产生与消失是动态平衡的，但是年龄增大、饮食不健康、劳累过度、精神压力大等因素都能让肌肤自由基泛滥，过剩的自由基会在皮肤细胞组织中累积并与细胞膜内含量丰富的脂类物质发生氧化作用，造成生物细胞膜的损伤，从而产生面色黯淡无光泽、缺水干燥等氧化现象。因此，过剩的自由基是造成皮肤衰老的重要因素。

弹性蛋白酶（Elastase ）是一种分解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，主要通过动物胰脏和微生物发酵获得[7]，是除了DPPH ·、·OH 和·O 2-等自由基外，对人体皮肤等产生重要影响的生物活性酶。弹性蛋白酶会使皮肤真皮中支撑皮肤结构的弹性蛋白被过度的降解，从而使皮肤产生皱纹、松弛无弹性等衰老症状。鞣花酸作为天然弹性蛋白酶抑制剂，可以有效地抑制弹性蛋白酶的活性，从而起到增强皮肤弹性，减少皱纹及色素沉着，延缓皮肤衰老等作用。

作者通过分光光度法研究了鞣花酸对DPPH ·、·OH 和·O 2-等3种自由基的清除作用，并以弹性蛋白酶为研究对象，利用荧光光谱探讨了鞣花酸对弹性蛋白酶的抑制作用及机理，为鞣花酸在抗衰老化妆品中的应用提供参考。

1.1材料与仪器

石榴产地云南蒙自，购自无锡市家乐福超市；二苯代苦味酰基自由基：分析纯，SIGMA-ALDRICH 公司产品；刚果红-弹性蛋白：SIGMA-ALDRICH 公司产品；猪胰弹性蛋白酶：上海迈坤化工有限公司产

品；磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠、邻二氮菲、硫

酸亚铁、双氧水、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、邻苯三酚、维生素C 、硼酸、十水合四硼酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

HH-S2数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂产品；TU-1901紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司产品；Cary Eclipse 荧光光度计：澳大利亚瓦里安有限公司产品；SHZ-82水浴恒温振荡器：金坛市医疗仪器厂产品。1.2实验方法

1.2.1石榴皮中鞣花酸的提取参考本课题组的前期报道[8]，鞣花酸按照以下方法进行提取。将市售的新鲜石榴，手工剥皮去籽，用清水洗净，将石榴皮置于40℃恒温鼓风干燥箱中烘干，烘干后用粉碎机将其粉碎，所得石榴皮粉末置于干燥皿中备用。准确称取石榴皮粉末10g 置于烧杯中，按料液质量体积比1g ∶15mL 加入pH 3.0的体积分数60%的乙醇溶液，超声提取3次，每次40min ，减压过滤，合并所有滤液，浓缩，真空干燥得石榴皮粗提物。将制得的粗提物悬浮于水中，用50mL 石油醚萃取5次除去脂溶性物质后，下层水相再以50mL 乙酸乙酯萃取5次，合并上层萃取液并减压浓缩、真空干燥，得乙酸乙酯萃取物。称取0.2g 乙酸乙酯萃取物置于圆底烧瓶中，加入1.0mol/L H 2SO 4溶液50mL ，充分混匀，于100℃磁力加热搅拌器中水解6h ，将所得反应液过滤，滤饼经超纯水水洗至滤液为中性，真空干燥得水解后的水不溶物即鞣花酸，保存于4℃冰箱中备用。

1.2.2鞣花酸对DPPH 自由基的清除作用用甲醇分别配制浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL 的石榴皮粗提物溶液及鞣花酸溶液。以甲醇配制浓度为0.04mg/mL DPPH 溶液。移取1mL 样品溶液及3mL DPPH 溶液于具塞试管中，充分混匀后，室温下避光静置30min 后于517nm 下测定吸光度值A 1。以1mL 甲醇代替样品溶液作空白测定吸光度A 0，以3mL 甲醇代替DPPH 溶液测定样品溶液的吸光度A 2，以维生素C 为对照品。按照下式计算DPPH 自由基的清除率：

DPPH 自由基的清除率=（1-（A 1-A 2）

A 0

）×100%

（1）

1.2.3鞣花酸对羟基自由基的清除作用用甲醇配

制浓度为0.05~0.5mg/mL 的石榴皮粗提物及鞣花酸

材料与方法

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