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幽门螺杆菌耐药的分子机理研究进展

作者:喻海忠,许国莹,陈巧林,陈建国,苏兆亮

【关键词】幽门螺杆菌;抗生素类;抗药性

幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)与胃、十二指肠疾病密切相关,是消化性溃疡、慢性活动性胃炎、十二指肠球部溃疡重要致病因素,也是胃癌演变的始动因子,与胃淋巴瘤的发生、发展有一定的关系[1]。HP清除直接关系到上述疾病的转归。但随着抗生素的广泛应用,其耐药率逐年上升。因此,探讨HP的耐药分子机理,对指导临床合理用药,有效控制HP相关疾病的传播有着十分重要的意义。

1 HP耐药性的产生

治疗HP感染的药物有咪唑类如甲硝唑,大环内酯类如克拉霉素,β-内酰胺类如阿莫西林、喹诺酮类、四环素与硝基呋喃类等。关于HP耐药的起源,现代微生物学认为有两种可能性:①自发突变学说,即耐药性的产生是由于菌株的自发突变。根据达尔文的进化论,随着抗生素的应用,抗生素敏感的细菌逐渐减少而耐药菌逐渐增多;②耐药遗传信息的传递产生了新的耐药株。染色体DNA 或质粒基因上有控制耐药性的遗传信息,HP耐药基因在细菌DNA重组时进入敏感菌株,从而使耐药菌株增加。

2 HP耐药的分子机理

细菌对抗生素的耐药可能与菌种的特性有关,也可能通过菌株的变异或者基因的转移获得,后者主要涉及到:①细菌产生灭活酶或钝化酶;②药物作用的靶位改变;③细胞膜的渗透性改变;④细菌对药物的外排和生物被膜的形成。HP对不同抗生素的耐药主要与以下机理有关:

2.1 HP对甲硝唑的耐药甲硝唑是一种具有抑菌活性的药物前体,由于其氧化还原电势较低,易被硝基还原酶还原为亚硝基衍生物、羟氨衍生物,还原产物具有细胞毒性,使细菌DNA降解、断裂甚至导致细菌死亡。因其杀菌活性不受胃内低pH的影响,在胃腔内浓度高,具有较强的抗HP活性,因此常用于HP感染的一线治疗。但是近年来,随着甲硝唑的广泛使用,HP对甲硝唑的耐药率逐年上升。在发达国家HP对甲硝唑的耐药率为20%~30%,而发展中国家高达60%~80%[2,3]。HP对甲硝唑耐药主要与rdxA基因突变导致该基因的失活有关,rdxA是编码氧不敏感的烟酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸硝基还原酶基因。但Kwon,Marais[4,5]研究证实frxA、fdxA、fldA、fdxB、oorDABC 和porCDAB等基因也参与了HP对甲硝唑的耐药,并证实frxA、fdxB 和rdxA 基因的失活不会对HP产生致死效应,而fdxA、fldA、oorDABC 和porCDAB基因的失活却会导致HP的死亡,这可能与这些基因编码的蛋白为HP的存活提供了一个微需氧环境有关。同时也发现单一fdxB基因突变导致HP对甲硝唑的低水平耐药甚至不导致耐药,但当rdxA 基因与fdxB联合突变时将导致高水平耐药,而frxA或rdxA 基因的突变均会产生中等水平耐药,但当两者同时突变时则产生高水平耐药。国内李耿等[6]研究也表明HP对甲硝唑耐药不仅与rdxA有关,同时与frxA、fdxB基因突变有关。

2.2 HP对克拉霉素的耐药克拉霉素又名6-甲氧红霉素(甲红霉素),属于新一代大环内酯类药物。HP对克拉霉素的耐药率地区差异明显,各国为1%~13%不等。Glupczynski等[7]发现,儿童对克拉霉素的耐药率比成人高,这可能与儿童免疫力较成人低,而克拉霉素经常用于儿童呼吸道感染的治疗有关。HP对克拉霉素的耐药主要为23 SrRNA可变区基因的突变导致核糖体变构,克拉霉素结合位点随之发生改变,进而使HP与克拉霉素的亲合力减弱,不能阻止细菌的蛋白质合成,从而产生耐药性。但23 SrDNA的突变位点和突变形式却具有地区差异[8,9]。如中国东北地区,突变

以G2224A,C2245T和T2289C为主,北京地区突变主要为A2143G[10],上海地区突变在2144位。但总的来说,A2143G的突变最为常见且稳定,占突变的45.12%~82.11%,其它的突变形式有

G2141A、A2142G、A2142C、A2142T、A2143C、G2115A,甚至在染色体的其它区段也发生突变。Fontana[11]等用PCR检测了12株耐克拉霉素菌株均未发现23 SrRNA基因上的2142位点和2143位点突变,却发现有7株耐药菌在23 SrRNA的恒定区发生了T2717C的突变,引起低水平耐药(MIC=1μg/ml)。

2.3 HP对β-内酰胺类药物的耐药常用于抗HP 的β-内酰胺类药物为阿莫西林。β-内酰胺类药物是通过与细菌内膜靶蛋白青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins,PBPs)结合,使转肽酶失活,破坏细菌细胞膜的完整性,使细菌死亡。HP对阿莫西林的耐药率相对较低。以往研究认为,细菌对β-内酰胺类药物的耐药机理是:产生β-内酰胺酶、产生新的PBPs、药物作用PBPs的位点改变、细菌的渗透性降低以及自溶酶减少等。但是HP耐药菌株尚未检测到β-内酰胺酶,故推测HP对阿莫西林的耐药可能与其它机理有关。目前,已发现3种高分子量PBPs(PBP1、PBP2、PBP3)和6种低分子量PBPs,其中PBP1A上转肽酶结构域的4个氨基酸突变引起HP对阿莫西林低水平耐药(MIC<8μg/ml)[12],PBP1A羧基端编码青霉素结合位点的10个氨基酸突变和细胞膜通透性改变,引起HP对阿莫西林中、高度耐药(MIC≥8μg/ml)[13,14]。Dore[15]研究也发现PBPs2D缺失是HP对阿莫西林耐药的原因。也有报道[12],在阿莫西林耐药菌株的保守片段有4个PBP1的突变(S414R,Y484C,T541I和P600T)和1个PBP2突变(T498I),其中PBP2单独突变不能引起耐药,而PBP1单独突变能引起耐药,而两者一同突变并不能增强其耐药性。还有学者[14]认为多点突变可以导致耐药菌株的产生,Okamoto T[14]发现在两株突变菌株PBP1中的ORF(开放阅读框)都有4个氨基酸残基被替代和一个氨基酸残基的插入。

2.4 HP对喹诺酮类药物的耐药喹诺酮类药物容易产生耐药,较少用于HP根除治疗。其耐药主要与DNA旋转酶(GYR)的改变和拓扑异构酶Ⅳ有关。DNA旋转酶由gyrA基因编码的2个A亚单位和gyrB基因编码的2个B亚单位组成的四聚体。此酶的主要功能是松解超螺旋DNA,使之能复制。对大肠埃希菌的研究发现,细菌对喹诺酮类的高度耐药由gyrA的突变引起,而低度耐药由gyrB 突变引起。在对HP耐药菌株中也发现,gyrA基因有4个位点发生突变(Asn87→Lys、Ala88→Val、Asp91→Gly、Asn或Tyr取代、Ala97→Val取代),同时把耐药菌株的gyrA片段导入敏感菌株中从而使敏感菌株获得耐药性。因此,推论gyrA基因的突变是HP对喹诺酮类药物耐药的分子基础。

2.5 HP对利福霉素类药物的耐药利福霉素类药物常用于抗结核病治疗,较少用于HP的治疗,该类抗生素对细菌的作用靶位是依赖DNA的RNA聚合酶,此酶由rpoB基因编码。Heep[16]经过一系列体外筛选获得了HP ATCC43504耐药株,对rpoB基因克隆、测序进行突变分析,发现所有耐药突变均包含密码子524-545和密码子586在内的基因簇区域。并发现利福平耐药株与野生型rpoB

基因相同,只是在扩增54-916碱基对时,有一个密码子的改变,即V149→F。从耐药株扩增的rpoB 基因片段导入到敏感株中,在选择培养基上长出了耐利福平的HP。从而推论,HP对利福霉素的耐药与rpoB可能有一定的关系。但确切的机理有待进一步研究证实。

2.6 HP对四环素的耐药四环素因其价廉有效而用于HP感染治疗,但近年来发现该药易引起二重感染,且其耐药率也呈上升趋势,现较少用于临床。四环素主要作用于细菌核蛋白体,阻止mRNA核蛋白体复合物A位与氨基酰tRNA的结合,从而抑制始动复合物的形成及肽链的延伸,并阻止核蛋白体与终止密码结合,抑制已合成的肽链或蛋白质释放。16 SrRNA的突变是HP对四环素耐药的主要原因,其中最常见的突变为16 SrRNA AGA(965~967)→TTC的突变。Nonaka等[17]证明16 SrRNA 965-967位,单个、两个或者三个碱基的突变都会导致HP对四环素的耐药,Wu JY等[18]也证明54%耐药菌株是单一位点突变(如CGA、GGA、TGA、AGC、AGT),这可能是由于这些碱基的改

变,影响了16 SrRNA的结构所致。Lawson等[19]在1006株分离菌株中发现18株对四环素敏感性降低,其中有3株耐药(MIC≥4mg/L);敏感性降低的18株中有10株检测到16 SrRNA突变:一株存在A926T和A928C的双重突变,一株A926C突变,一株A928C突变,另外七株为A926G突变。

3 结语

目前,虽然对HP的耐药性有所研究并取得了一定的进展,但仍存在着许多问题,如耐药机理的不确定性;抗生素的使用剂量、用药史、年龄、性别等在HP对抗生素耐药中的确切作用仍不清楚。因此,加强临床菌株的耐药性研究,深入探讨HP耐药机理与特性,为指导临床合理用药以及抗生素的开发提供了新的思路。

【参考文献】

[1]Williamson JS.Helicobacter pylori:current chemotherapy and new targets for drug design [J].Curr Pharm Des,2001,7(5):355-392.

[2]Gorgoulis V,Rassidakis G,Karameris A,et al.Expression of p53 protein in laryngeal squamous cell carcinoma and dysplasia:possible correlation with human papillomavirus infection and clinicopathological findings [J].Virchows Arch,1994,425(5):481-489.

[3]叶嗣颖,田拥军,刘南植,等.幽门螺杆菌耐甲硝唑基因分型与序列分析[J].中华微生物学和免疫学杂志,2002,22(4):447-450.

[4]Kwon DH,EI-Zaatari FA,Kato M,et al.Analysis of rdxA and involvement of additional genes encoding NAD(P)H flavin oxidoreductase (FrxA)and ferredoxin-like protein (FdxB)in metronidazole resistance of Helicobacter pylori [J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(8):2133-2142.

[5]Marais A,Bilardi C,Cantet F,et al.Characterization of the genes rdxA and frxA involved in metronidazole resistance in Helicobacter pylori [J].Res Microbiol,2003,154(2):137-144.

[6]李耿,田拥军,叶嗣颖,等.幽门螺杆菌对甲硝唑耐药性及多重相关基因DNA和氨基酸序列分析[J].华中科技大学学报:医学版,2005,34(2):138-140、144.

[7]Glupczynski Y,Megraud F,Lopez-Brea M,et al.European multicentre survey of in vitro antimicrobial resistance in Helicobacter pylori [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2001,20(11):820-823.

[8]Hao Q,Li Y,Zhang ZJ,et al.New mutation points in 23S rRNA gene associated with Helicobacter pylori resistance to clarithromycin in northeast China [J].World J Gastroenterol,2004,10(7):1075-1077.

[9]Burucoa C,Landron C,Gamier M,et al.T2182C mutation is not associated with clarithromycin resistance in Helicobacter pylori [J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):868-870.

[10]郑小丽,胡伏莲,王蔚虹,等.北京地区幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药情况及耐药机制[J].中华医学杂志,2001,81(23):1413-1415.

[11]Fontana C,Favaro M,Minelli S,et al.New site of modification of 23S rRNA associated with

clarithromycin resistance of Helicobacter pylori clinical isolates [J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(12):3765-3769.

[12]Paul R,Postius S,Melchers K,et al.Mutations of the Helicobacter pylori genes rdxA and pbp1 cause resistance against metronidazole and amoxicillin [J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(3):962-965.

[13]Kwon DH,Dore MP,Kim JJ,et al.High-level beta-lactam resistance associated with acquired multidrug resistance in Helicobacter pylori [J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(7):2169-2178.

[14]Okamoto T,Yoshiyama H,Nakazawa T,et al.A change in PBP1 is involved in amoxicillin resistance of clinical isolates of Helicobacter pylori [J].J Antimicrob Chemother,2002,50(6):849-856.

[15]Dore MP,Graham DY,Sepulveda AR.Different penicillin-binding protein profiles in amoxicillin-resistant Helicobacter pylori [J].Helicobacter,1999,4(3):154-161.

[16]Heep M,Rieger U,Beck D,et al.Mutations in the beginning of the rpoB gene can induce resistance to rifamycins in both Helicobacter pylori and Mycobacterium tuberculosis [J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(4):1075-1077.

[17]Nonaka L,Connell SR,Taylor DE.16S rRNA Mutations That Confer Tetracycline Resistance in Helicobacter pylori Decrease Drug Binding in Escherichia coli Ribosomes [J].J Becteriol,2005,187(11):3708-3712.

[18]Wu JY,Kim JJ,Redddy R,et al.Tetracycline-Resistant Clinical Helicobacter pylori Isolates with and without Mutations in 16S rRNA-Encoding Genes [J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(2):578-583.

[19]Lawson AJ,Elviss NC,Owen RJ.Real-time PCR detection and frequency of 16S rDNA mutations associated with resistance and reduced susceptibility to tetracycline in Helicobacter pylori from England and Wales [J].J Antimicrob Chemother,2005,56(2):282-286.