白刺抗氧化活性提取物的闪提-大孔树脂纯化工艺

一基金项目:复旦大学企业横向课题(Ｎｏ.ＦＤＵ２０１４１１１０)

一作者简介:卢燕?女?博士研究生?副教授?研究方向:中草药活性成分与新产品开发?Ｅ－ｍａｉｌ:ｌｕｙａｎ＠ｆｕｄａｎ.ｅｄｕ.ｃｎ

一通信作者:季崇敏?女?博士研究生?研究方向:青海白刺资源开发与利用?Ｔｅｌ:１３７９５２８１６９３?Ｅ－ｍａｉｌ:ｊｃｍｚｂ＠１２６.ｃｏｍ

白刺抗氧化活性提取物的闪提－大孔树脂纯化工艺

卢燕１?余小磊１?赵萱１?季崇敏２

(１.复旦大学药学院生药学教研室?上海２０１２０３?２.青海博智生物科技有限公司?青海西宁８１００００)摘要:目的一建立白刺干果抗氧化提取物的提取和纯化工艺?方法一以１?１－二苯基－２－三硝基苯肼(ＤＰＰＨ)法测定的半抑制浓度(ＩＣ５０)值为指标?评价不同醇浓度二不同提取方法所得浸膏及大孔树脂柱不同洗脱流分的抗氧化活性?结果一以７０％乙醇为溶剂?采用闪式提取所得浸膏抗氧化活性强二得率高?经ＡＢ－８型大孔树脂纯化?

西伯利亚白刺(ＮｉｔｒａｒｉａｓｉｂｉｒｉｃａＰａｌｌ.)以４０％乙醇洗脱流分活性最强(半抑制浓度:０.０５ｍｇ ｍＬ－１)?唐古特白刺(Ｎｉ￣ｔｒａｒｉａｔａｎｇｕｔｏｒｕｍＢｏｂｒ.)以２０％乙醇洗脱流分活性最强(半抑制浓度:０.１０ｍｇ ｍＬ－１)?结论一通过该工艺制备的白刺抗氧化提取物水溶性好?清除１?１－二苯基－２－三硝基苯肼的能力与维生素Ｃ相近?是一种很有开发前景的天然抗氧化剂?

关键词:白刺?抗氧化?闪式提取?大孔树脂

中图分类号:Ｒ２８４.２一文献标识码:Ａ一文章编号:２０９５－５３７５(２０１７)０１－０００９－００３ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０１７.０１.００３

ＡＮｉｔｒａｒｉａａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｂｌｉｔｚｋｒｉｅｇｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ＬＵＹａｎ１?ＹＵＸｉａｏｌｅｉ１?ＺＨＡＯＸｕａｎ１?ＪＩＣｈｏｎｇｍｉｎ２

(１.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ?ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ?ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ?Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３?Ｃｈｉｎａ?

２.ＱｉｎｇｈａｉＢｏｚｈｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.?Ｌｔｄ.?Ｘｉｎｉｎｇ８１００００?Ｃｈｉｎａ)

Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ一ＴｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｏｆＮｉｔｒａｒｉａｓｉｂｉｒｉｃａＰａｌｌ.ａｎｄＮｉｔｒａｒｉａｔａｎｇｕｔｏｒｕｍ

Ｂｏｂｒ.ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅｅｘｔｒａｃｔｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ一ＴｈｅＮｉｔｒａｒｉａｆｒｕｉｔｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｗｉｔｈｅｔｈａｎｏｌｂｙｄｉｆ￣ｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓ?ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｂｌｉｔｚｋｒｉｅｇｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?ｒｅｆｌｕｘｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｍｉｃｒｏｗａｖｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ.ＴｈｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＡＢ－８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｃｏｌｕｍｎ.ＤＰＰＨａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｐａ￣ｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅ.Ｒｅｓｕｌｔｓ一

Ｂｌｉｔｚｋｒｉｅｇｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇ７０％ｅｔｈａｎｏｌｌｅｄｔｏｈｉｇｈｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ

ａｎｄｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ.ＡＢ－８ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎｃｏｌｕｍｎｗａｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｏｆｕｒｔｈｅｒｐｕｒｉｆｙｔｈｅｅｘｔｒａｃｔ.ＴｈｅｍｏｓｔｐｏｔｅｎｔｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆＮｉｔｒａｒｉａｔａｎｇｕｔｏｒｕｍＢｏｂｒ.(ＩＣ５０:０.１０ｍｇ ｍＬ－１)ａｎｄＮｉｔｒａｒｉａｓｉｂｉｒｉｃａＰａｌｌ.(ＩＣ５０:０.０５ｍｇ ｍＬ－１)ｗｅｒｅｅｌｕｔｅｄｂｙ２０％ａｎｄ４０％ｅｔｈａｎｏｌ?ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ一ＴｈｅＮｉｔｒａｒｉａｅｘｔｒａｃｔｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｅｒｅｇｏｏｄｎａｔｕｒａｌａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｗｉｔｈｇｏｏｄｗａｔｅｒ

ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙａｎｄｐｏｔｅｎｔａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙ.

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｎｉｔｒａｒｉａ?Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ?Ｂｌｉｔｚｋｒｉｅｇｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ?Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｒｅｓｉｎ

一

一白刺是蒺藜科(Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ)白刺属

(Ｎｉｔｒａｒｉａ)的多种落叶小灌木的统称?主要品种有西伯利亚白刺(ＮｉｔｒａｒｉａｓｉｂｉｒｉｃａＰａｌｌ.)和唐古特白刺(ＮｉｔｒａｒｉａｔａｎｇｕｔｏｒｕｍＢｏｂｒ.)等?在我国主要生长在

内蒙古二青海二新疆二甘肃等地的荒漠或者半荒漠地区?不仅有防风固沙的作用?而且其药用价值和食用价值也很高?果实味甘二酸?性温?有健脾胃二滋补强

壮二调经活血二催乳之功效?常用于治疗脾胃虚弱二消化不良二神经衰弱二高血压头晕二感冒二乳汁不下等症[１]?现代研究发现?白刺富含黄酮和花色苷类成分[２－３]?西伯利亚白刺的乙醚提取物[４]及唐古特白刺的乙酸乙酯部位[５]或８０％乙醇提取物[６]都有明显的抗氧化活性?越来越多的研究显示抗氧化是预防衰老的重要步骤?常见的癌症二动脉硬化二糖尿病二

白内障二心血管病二老年痴呆二关节炎等多种老化相关疾病都被认为与自由基有关?本研究直接以抗氧化活性为导向?优化并建立从白刺干果中富集抗氧化组分的提取和纯化工艺?为白刺在防治老化相关疾病方面的药品和保健品开发应用提供高效的天然抗氧化剂原料?

１一仪器与试药

１.１一仪器一ＡＢ１３５－Ｓ型电子天平(梅特勒－托利多仪器公司)?ＹＰ６００１Ｎ型电子天平(上海精科仪器有限公司)?ＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＫ３型酶标仪(Ｔｈｅｒｍｏ公司)?ＵＳ１０３００ＡＨ超声波清洗器(北京优晟联合科技有限公司)?ＪＨＢＥ－５０Ｔ型闪式提取器(河南智晶生物科技股份有限公司)?ＤＩＹ－２００Ｃ型中药粉碎机(上海比朗仪器有限公司)?Ｎ－１１００型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)?

１.２一试药一１?１－二苯基－２－三硝基苯肼(ＤＰＰＨ?Ｓｉｇｍａ公司)?维生素Ｅ(ＶＥ?α－生育酚?Ｓｉｇｍａ公司)?水溶性维生素Ｃ(ＶＣ?Ｌ－抗坏血酸?Ｓｉｇｍａ公司)?６批白刺样品的收集信息见表３?经复旦大学药学院生药学教研室卢燕副教授鉴定?分别为唐古特白刺(ＮｉｔｒａｒｉａｔａｎｇｕｔｏｒｕｍＢｏｂｒ.)或西伯利亚白刺(ＮｉｔｒａｒｉａｓｉｂｉｒｉｃａＰａｌｌ.)的干燥果实?

２一方法与结果

２.１一抗氧化活性测定方法(ＤＰＰＨ法)[７]２.１.１一ＤＰＰＨ无水乙醇溶液的配制一精密称取４ｍｇ的ＤＰＰＨ粉末?置于５０ｍＬ的容量瓶中?再加入无水乙醇至刻度?配制成质量浓度为８０μｇ ｍＬ－１的溶液?摇匀?４?冷藏避光?备用?

２.１.２一待测样品及对照物溶液的配制一精密称取适量待测样品及对照品?用水或无水乙醇溶解并稀释配成５个不同浓度的溶液?４?冷藏避光?备用?ＶＣ为水溶性样品的对照物?ＶＥ为脂溶性样品的对照物?２.１.３一抗氧化测定方法一将不同浓度待测样品及对照品溶液?各取１００μＬ加入８０μｇ ｍＬ－１的ＤＰＰＨ无水乙醇溶液１００μＬ?加盖?振摇?避光放置３０ｍｉｎ后于５１７ｎｍ下测定吸光度值?１００μＬ样品溶液和１００μＬＤＰＰＨ无水乙醇溶液的混合液?作为测定组?１００μＬ样品溶液和１００μＬ无水乙醇的混合液?作为空白组?１００μＬ样品溶剂和１００μＬＤＰＰＨ溶液的混合液?作为对照组?按下式计算ＤＰＰＨ清除率:

ＤＰＰＨ清除率(％)＝{１－(Ａｓａｍｐｌｅ－Ａｂｌａｎｋ)/Ａｃｏｎｔｒｏｌ}?１００％

Ａｓａｍｐｌｅ:样品溶液(１００μＬ)＋ＤＰＰＨ溶液的混合液的吸光度值(１００μＬ)

Ａｂｌａｎｋ:样品溶液(１００μＬ)＋无水乙醇的混合液的吸光度值(１００μＬ)

Ａｃｏｎｔｒｏｌ:样品溶剂(１００μＬ)＋ＤＰＰＨ溶液的混合液的吸光度值(１００μＬ)

以ＤＰＰＨ清除率(％)Ｙ对样品溶液质量浓度Ｘ?绘制清除率曲线?得到清除率与浓度的线性方程?再计算求得半抑制浓度(ＩＣ５０)?

２.２一醇提工艺优化

２.２.１一乙醇浓度确定一称取５份１５ｇ左右的５号样品(ＱＨ２０１４)果实粗粉?置于三角烧瓶中?分别加入不同浓度的乙醇(３０％二５０％二７０％和９５％)和水作为提取溶剂?料液比为１?３０(ｇ ｍＬ－１)?浸泡１ｈ?超声提取６０ｍｉｎ?取出?过滤?将所得滤液旋干?得到白刺果实不同提取物的浸膏?分别称取适量的上述５个浸膏?溶于水中?采用ＤＰＰＨ法测定其抗氧化活性?计算求得ＩＣ５０?结果见表１?

表１一白刺果实不同醇及水提取物的抗氧化活性结果(ｎ＝３)

样品ＩＣ５０/ｍｇ ｍＬ－１

水提取物２.４１

３０％醇提取物２.２５

５０％醇提取物１.５７

７０％醇提取物１.６７

９５％醇提取物５.３２

ＶＣ０.０２

ＶＥ０.０４

一一５０％醇提取物和７０％醇提取物的抗氧化活性比较好?但因７０％醇提取的浸膏得率(４４.２％)较高于５０％醇提物(３８.７％)?而且经高效液相色谱(ＨＰＬＣ)检测两者成分无明显差异?所以确定７０％乙醇作为白刺活性部位制备工艺的提取溶剂?

２.２.２一提取方法确定一称取４份５ｇ左右的５号样品(ＱＨ２０１４)果实药材粗粉?置于三角烧瓶中?加入７０％乙醇?料液比为１?３０(ｇ ｍＬ－１)?浸泡１ｈ?分别采用闪式提取(５次?每次１ｍｉｎ)二超声提取１ｈ二加热回流１ｈ二微波提取３０ｍｉｎ?不同提取工艺所得浸膏的提取率及抗氧化活性见表２?不同工艺所得浸膏抗氧化活性相近?闪提工艺因其较高的浸膏得率和常温二简便快速的操作而具有明显的优势?因此最终确定采用闪提工艺提取?

表２一不同提取方法比较(ｎ＝３)

提取工艺白刺果实重量/ｇ浸膏得率/％ＩＣ５０/ｍｇ ｍＬ－１闪提５.０３５３.７１.６３

超声５.０３４８.７１.５７

回流５.０３４３.１１.７８

微波５.００５３.０１.６５

ＶＣ:０.０１

２.２.３一液料比确定一分别称取４份５ｇ左右的５号样品粗粉?按不同料液比加７０％乙醇?浸泡１ｈ?闪式提取(５次?每次１ｍｉｎ)?比较浸膏得率?结果?１?１０二１?２０二１?３０二１?４０不同料液比(ｇ ｍＬ－１)所得浸膏得率分别为:４６.４％二５０.４％二５５.６％二５３.６％?２.２.４一不同产地二品种白刺样品的提取与活性比较一按上述优化的提取工艺?分别称取不同产地白刺干果约３０ｇ?按料液比１?３０(ｇ ｍＬ－１)加７０％乙醇?浸泡１ｈ?闪式提取５次?每次１ｍｉｎ?过滤?将滤液浓缩?干燥?得到７０％醇提浸膏?分别测定抗氧化活性?结果见表３?新疆产西伯利亚白刺提取物活性最强?青海产西伯利亚白刺浸膏得率最大?但陈旧样品活性明显降低?３批唐古特白刺样品中以内蒙古产白刺提取物活性较强?

表３一不同产地白刺提取物的抗氧化活性(ｎ＝３)

编号产地批号品种浸膏得率/％ＩＣ５０/ｍｇ ｍＬ－１１甘肃ＭＱ２０１５唐古特白刺３３.３５０.６２

２甘肃ＨＸ２０１５唐古特白刺３３.７８０.６８

３内蒙古ＮＭ２０１５唐古特白刺３２.１７０.５４

４青海ＱＨ２０１５西伯利亚白刺５２.５５０.８５

５青海ＱＨ２０１４西伯利亚白刺５０.２０１.６０

６新疆ＸＪ２０１５西伯利亚白刺３７.９７０.２６

ＶＣ:０.０１２.３一大孔树脂纯化工艺一分别称取表３中新疆(ＸＪ２０１５)二青海(ＱＨ２０１５)和内蒙古(ＮＭ２０１５)白刺浸膏约７ｇ?用适量水溶解后上大孔树脂柱(ＡＢ－８型?７００ｇ)?吸附１２ｈ?依次用水二２０％二４０％和８０％乙醇洗脱至流出液近无色(约１０~１２倍柱体积)?收集不同浓度的洗脱液?减压浓缩至无醇味后冷冻干燥?分别测定抗氧化活性?结果见表４?新疆和青海产西伯利亚白刺经大孔树脂纯化后?相应各流分活性相近?且以４０％乙醇洗脱流分活性最强?２０％洗脱流分活性稍弱?都较原７０％醇提物大大增强?内蒙古产唐古特白刺以２０％乙醇洗脱流分活性最强?４０％流分与原７０％醇提物活性相近?

表４一大孔树脂柱不同流分抗氧化活性ＩＣ５０值(ｍｇ ｍＬ－１?ｎ＝３)样品ＸＪ２０１５ＱＨ２０１５ＮＭ２０１５２０％流分０.０７０.０７０.１０

４０％流分０.０５０.０５０.４９

８０％流分０.１８０.１９０.７１

ＶＣ０.０２０.０２０.０２

ＶＥ０.０２０.０２０.０２

３　讨论

通过优化?确立白刺干果抗氧化活性组分的富集工艺为:白刺干果按料液比１?３０(ｇ ｍＬ－１)加７０％乙醇?浸泡１ｈ?闪式提取５次?每次１ｍｉｎ?过滤?将滤液浓缩至适当体积?上大孔树脂柱(ＡＢ－８型)吸附１２ｈ?先以水洗脱至流出液近无色?再以

２０％乙醇(唐古特白刺)或４０％乙醇(西伯利亚白刺)洗脱至流出液近无色?收集乙醇洗脱流分?浓缩至干?即得?

闪式提取器基于组织破碎原理?将物料快速破碎至适当粒度?同时伴有高速搅拌二超强振动二负压渗滤等作用实现提取目的?最大限度保留植物有效成分不会受热破坏?提取效率远远高于传统方法?最大工作量可达到５０Ｌ/次?适用于中草药研究及生产的不同需要[８－１０]?白刺果实粒径小二易破碎?采用闪式提取可不预先粉碎直接投料?进一步提高效率?唐古特白刺和西伯利亚白刺是我国白刺属植物分布较广的两个主要品种?但抗氧化活性有所不同?经ＨＰＬＣ初步分析?两者７０％醇提物或经大孔树脂纯化后的最强活性流分在成分上都有明显差异?在今后的研究中应阐明两者的主要抗氧化活性成分异同?并依此建立两种活性提取物的质量标准?指导两种白刺的有效开发利用?

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