微生物方法学验证范本

编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查

方法学验证方案

起草人：年月日

审核人：年月日

年月日

年月日

批准人：年月日

目录

1.验证立项表

2.验证内容

2.1验证目的

2.2验证范围

2.3 验证要求

2.4 验证方法

2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物

2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容

2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容

2.4.4铜绿假单胞菌验证内容

3. 验证报告

验证立项表（REC）

立项题目

立项部门申请人

申请日期要求完成日期

验证类别负责部门

参与部门及人员

验证原因

质量部审核意见审核人：日期：

验证领导小组

审批人：日期：审批意见

备注

XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案

编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典

规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌

1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。

2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准

3.1验证小组成员

姓名职务职责

组长负责验证方案、报告的批准

项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施

验证小组成员负责验证试验及填写记录

3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。

3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.验证方法

4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物

4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制；

0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。

4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。

4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。

4.1.5验证用微生物名称及编号

菌珠名称传代次数

大肠埃希菌MCC(B)44102

金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003

枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501

白色念珠菌霉CMCC(F)98001

4.1.6菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

4.1.7供试品溶液的制备称取XXXX软膏10g，置灭菌三角瓶中，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，45℃下使之全部溶化，摇匀，作为1：10的供试品溶液。

4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容

4.2.1试验组：分别取1:10供试品溶液0.2ml注入两个平皿，接种50-100个挑战微生物，每株试验菌平两行制备两个平皿（分别注入以上四种菌悬液），向平皿内倒冷却至45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml：并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2. 2菌液组：不加供试液，直接将试验菌株接种于2个平皿中，其余操作步骤同样品试验组操作。

4.2.3供试品对照组：取1:10供试品溶液0.2ml分别注入两个平皿，向平皿内倒冷却到45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml,并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2.4上述操作，应做三次平行试验，分别计算各次试验的菌的回收率。

试验组的菌回收率=[(试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数]×100%。

4.2.5培养：营养琼脂培养基平皿倒置于30-35℃下培养48h，玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基倒置于23-27℃下培养72h。

4.2.6观察和计数：对每个平皿逐日检查计数，结果以培养终至的计数为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的两个平皿计数进行平均，取平均值。观察微生物的菌落形态并做革兰氏染色，以确认生长菌与接入的微生物相同。

4.2.7验证用微生物的稀释度和接种量

菌珠名称浓度（CFU）/ml 稀释度接种量

大肠埃希菌约50-100cfu 10-6 0.1ml

金黄色葡萄球菌约50-100cfu 10-60.1ml

枯草芽孢杆菌约50-100cfu 10-50.3ml

白色念珠菌霉约50-100cfu 10-40.1ml

4.2.8试验结果

4.2.8.1品名：批号：

（供试品注入量:每皿注入0.2ml）

菌珠名称

试验组菌液组供试品对照组试验组菌

回收率% 碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：检验人：4.2.8.2品名：批号：

（供试品注入量:每皿注入0.2ml）

菌珠名称

试验组菌液组供试品对照组试验组菌

回收率% 碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：检验人：4.2.8.3品名：批号：

（供试品注入量:每皿注入0.2ml）

菌珠名称

试验组菌液组供试品对照组试验组菌

回收率% 碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均碟1 碟2 平均

大肠埃希菌金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：检验人：

4.3铜绿假单胞菌验证内容

4.3.1供试品组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（铜绿假单胞菌）进行检查，结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌。

4.3.2试验组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入铜绿假单胞菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.3.3阴性对照菌组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入大肠埃希菌菌液1ml, 35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。

4.3.4阳性对照菌组取铜绿假单胞菌对照菌液1ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.3.5验证结果

4.3.

5.1品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

4.3.

5.2品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

4.3.

5.3品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

4.4金黄色葡萄球菌验证内容

4.4.1供试品组供试品组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（金黄色葡萄球菌）进行检查，结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌。

4.4.2试验组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入金黄色葡萄球菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

4.4.3阴性对照组取1：10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入大肠埃希菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。

4.4.4阳性对照菌组取金黄色葡萄球菌对照菌液1ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

4.4.5检验结果

4.4.

5.1品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

4.4.

5.2品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

4.4.

5.3品名：批号：

试验组阴性对照组供试品组阳性对照菌组甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：检验人：

验证报告（REC）

验证项目名称

验证实施日期年月日至年月日验证类别

验证依据《中华人民共和国药典》2005版

负责部门参与人员签字

参与部门参与人员签字

验证结果

与评价

结论项目负责人签名：年月日备注

复核人：批准人：年月日

微生物限度方法学验证

WOIRD格式 微生物限度检测方法学验证方案&D.|[0w#j!Q+{/w 7^#E:k'p(t9J!T 3W#O&W!d8S*\7k!y$k!C1A |*Q4X*I)[5@8g %_8H0}!X:c5V4s :w%J'K)}0Q-W :H1f9N$[4V7L7} 文件编号：P-AMV002-1101 "r%|2C7e-IY#s%f 1v8U8D4M(n(q*a6o3e2f0z/_ 9`'j5[+y9c&C)D!O*O \%X:d,r0C(o3D "A2c,\6C'j+^ (L1L-n3{/J;K 执行前批准签字页2N+}8E8x%C!M1b2~1o'} 方案起草姓名公司/岗位签字日期 :c"s'R:u"l1q#l'o)}8h (@.}&N#s;[2E)H&U!R 1G5Q-h5N)|+I2p 方案审核姓名公司/岗位签字日期 +N:w0{4j"`"} -x4r(Z#P;a3Z/|0U 1\2P&v6j*`2h 方案批准姓名公司/岗位签字日期$p1h:X#G"u.} )B;d.V7R!@7t5v&D 9a0l!i,W4p4o6f+Z4V 7s*X3F8A7B3q"`1g 6T9y;U,k+k9b 目录 ,t,n2w&_4mT 1.目的4 2.范围4,V*l"_%Q5f,K#k 3.责任者及职责43^X*Q$x(E3g:B)E

4.验证简介4 5．验证过程7 6．结果判断76c9[/O1U&R 7．结论和建议7%{)x.{$f%I 8．异常情况报告7*E.Q.`;?!k#q 9．再验证7 10．附件8/O0@.@8O!`:c5c1n!k 1L)N.^2w+d3Y%V 1.目的$M;j2K6p'|:y3F'K+K 按照中国药典2010版（第一部），采用平皿法对龙加通络胶囊（成品）进行微生物限度检查，本方案是对此方法进行验证。;x'?8a'^6C5@!^ 2.范围&J+b'o7r7m6Z5t 龙加通络胶囊成品8A,S/U]3h1J 3.责任者及职责 部门职责 QC起草并审核验证方案 进行验证试验的具体操作 完成验证记录中相关操作记录的填写 根据验证结果起草和审核验证报告6q5D5e1|(h,f3C QA审核并批准验证方案和验证报告(S&h:^!z#k,K:B1Q!j)?&^ 监督验证方案的实施7?4y(`6P(r 4.验证简介 4.1定义 CFU：菌落数 供试液3].N/E/p"O8}6C7R4d 取样品10g，取pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液稀释至1g/ml（1:10）。 供试品对照组 取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。'S#h$n1U:X's/J)e"C 试验组 取规定量供试液采用平皿法进行细菌、霉菌及酵母菌计数。 菌液组 测定所加的试验菌数。%I8Y$G*Q4f;u.C*|%l+N 样品组样品溶液菌悬液 （50-100CFU）稀释液平均菌落数 (CFU/皿) 供试液对照组+-+C供试液对照组3G#_,O-A'P#P;H 试验组+++C试验组 菌液组-+-C菌液组'z5n%U:j2A(~"}N 4.2菌悬液 4.2.1菌种及来源(y)W#A2Q$p.I8y4M4m"z.|#p 本次验证涉及到金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌、枯草芽胞杆菌、白色念珠菌、黑曲霉，其详细情况如下： 培养基名称名称及代号编号批号代次有效期至来源

微生物限度检查办法验证方法

精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4

4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：

药品微生物检验替代方法验证指导原则

药品微生物检验替代方法验证指导原则 本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。 随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。 在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 微生物检验的类型及验证参数 药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。 由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。 表1 不同微生物检验类型验证参数 注： 尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。 进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。 替代方法验证的一般要求 在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法

临床微生物学检验之药敏

临床微生物学检验 一、纸片扩散法 又称Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO 推荐为定性药敏试验的基本方法，已在临床广泛使用。 （一）实验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 （二）培养基和抗菌药物纸片 1、抗菌药物纸片选择直径为6.35mm，吸水量为20μl的专用药敏纸片，用逐片加样或 侵泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存2~8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过一周。使用前将贮存容器移至室温平衡1~2小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。 2、培养基水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培养基是CLSI采用的兼性厌氧菌和需氧 菌药敏试验标准培养基，pH为7.2~7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃温箱孵育15分钟，使其表面干燥。（三）实验方法 实验菌株和标准菌株接种采用直接菌落法或细菌液体生长法、用0.5麦氏比浊管标准的菌液浓度，校正浓度后的菌液应在15分钟内接种完毕。操作步骤如下： 1、接种用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹 接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板內缘涂抹一周。 2、贴抗菌药物纸片平板置室温下干燥3~5分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧 贴于琼脂表面，各纸片中心相距》24mm，纸片距平板內缘》15mm，纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。 3、孵育置35℃孵育箱16~18小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24 小时。 （四）结果判断和报告 用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域），先量取质控菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格；然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI 标准，对量取的抑菌圈直径作出“敏感”、“耐药”、“中介”的判断。 （五）质量控制 对于肠杆菌科细菌，M-H琼脂，生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，35℃+-2℃，空气，16~18小时观察结果，质控菌株推荐为大肠埃希菌A TCC25922，大肠埃希菌A TCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）；对于铜绿假单胞菌A TCC35218；对于葡萄球菌属细菌，16~18小时观察结果，测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24小时，试验温度超过35℃不能检测甲氧西林耐药葡萄球菌，推荐质控菌株为金黄色葡萄球菌A TCC25923，大肠埃希菌A TCC35218，纸片扩散法检测葡萄球菌对万古霉素的敏感性不可靠；对于肠球菌属细菌，16~18小时观察结果，测万古霉素需24小时，推荐质控菌株为粪肠球菌A TCC29212;对于流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，推荐质控菌株为流感嗜血杆菌A TCC49247，流感嗜血杆菌A TCC49766，大肠埃希菌A TCC35218（测试阿莫西林/克拉维酸时）；对于肺炎链球菌和肺炎链球菌之外其他链球菌，培养基为M-H琼脂+5%羊血，35℃+-2℃，5%CO2,20~24小时观察结果，推荐质控菌株为肺炎链球菌A TCC49619.

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、

微生物限度方法学验证

微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表1菌种

表2培养基

表3对照用培养基

表4试剂

稀释液： （1）pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。 （2）0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。 （4）靛基质试液

取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～ 100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证

微生物方法学验证范本

编码：VP-C01-MM-01 XXXX软膏微生物限度检查 方法学验证方案 起草人：年月日 审核人：年月日 年月日 年月日 批准人：年月日 目录 1.验证立项表 2.验证内容 2.1验证目的 2.2验证范围 2.3 验证要求 2.4 验证方法 2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容 2.4.3 金黄色葡萄球菌验证内容 2.4.4铜绿假单胞菌验证内容 3. 验证报告 验证立项表（REC） 立项题目 立项部门申请人

申请日期要求完成日期 验证类别负责部门 参与部门及人员 验证原因 质量部审核意见审核人：日期： 验证领导小组 审批人：日期：审批意见 备注 XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案 编码：VP-C01-MM-01品名验证依据2005版药典 规格验证日期年月日数量报告日期年月日验证项目细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。 2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准 3.1验证小组成员 姓名职务职责 组长负责验证方案、报告的批准 项目负责人负责验证方案、报告的起草与具体实施 验证小组成员负责验证试验及填写记录 3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。 3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。 3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。 4.验证方法 4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物 4.1.1试验样品：XXXX软膏三批，批号为、、。4.1.2稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。配法：照（05版药典附录XIII C）配制； 0.9%无菌氯化钠溶液的配制：取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。 4.1.3实验仪器：无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。 4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。 4.1.5验证用微生物名称及编号 菌珠名称传代次数 大肠埃希菌MCC(B)44102 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501

临床微生物学与检验测试题及标准答案

临床微生物学与检验测试题及答案

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临床微生物学与检验测试题及答案——细菌感染的实验室检查与诊断及细菌生理 一、名词解释 1.血清学诊断 2.培养基 3.基础培养基 4.选择培养基 5.鉴别培养基 6.菌落 二、填空题 1.实验室细菌学检查结果的准确与否和标本的选 择、、有直接关系。 2.辅助诊断风湿热的抗“O”实验属于。 3.血清学试验一般需作两次，其血清分别取自疾病 的和.第二次抗体效价比第一 次时方有诊断意义。 4.对流行性脑炎患者进行细菌学检查，可采集的标本 有、和。 5.进行病原菌的分离培养时，从有正常菌群部位采取的标本应接种 于培养基或培养基。 6.细菌感染实验室检查中，常用的血清学方法 有、和三大类。 7.属于直接凝集反应的血清学试验有和。 三、单项选择题 1.目前在传染病的预防接种中，使用减毒活疫苗比使用灭活疫苗普遍，关于其原因下述不正确的是 A.减毒活疫苗的免疫效果优于灭活疫苗 B.减毒活疫苗刺激机体产生的特异性免疫的持续时间比灭活疫苗长 C.减毒活疫苗能在机体内增殖或干扰野毒株的增殖及致病作用，灭活疫苗则不能 D.减毒活疫苗可诱导机体产生分泌型IgA，故适用于免疫缺陷或低下的患者 E.减毒活疫苗一般只需接种一次即能达到免疫效果，而灭活疫苗需接种多次

2.白百破三联疫苗的组成是 A.百日咳类毒素，白喉类毒素，破伤风类毒素 B.百日咳死疫苗，白喉类毒素，破伤风类毒素 C.百日咳死疫苗，白喉死疫苗，破伤风类毒素 D.百日咳活疫苗，白喉活疫苗，破伤风死疫苗 E.百日咳活疫苗，白喉死疫苗，破伤风死疫苗 3.使用时要注意防止Ⅰ型超敏反应的免疫制剂是 A.丙种球蛋白 B.胎盘球蛋白 C.抗毒素 D.白细胞介素 E.干扰素 4.关于胎盘球蛋白的叙述，错误的是 A.由健康产妇的胎盘和婴儿脐带中提取制备 B.一般含IgM C.一般不会引起超敏反应 D.主要用于麻疹，甲型肝炎和脊髓灰质炎等病毒性疾病的紧急预防 E.免疫效果不如高效价的特异性免疫球蛋白 5.伤寒病人发病第一周内，分离病原菌应采取的标本是 A.血液 B.尿液 C.粪便 D.呕吐物 E.脑脊液 6.咽喉假膜标本涂片染色后，镜检出有异染颗粒的棒状杆菌，其临床意义在于诊断 A.结核病 B.军团病

临床微生物学检验

临床微生物学检验 确保高压效果的可靠性。 【适用范围】 蒸气式高压锅。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。 2．打开排气阀。 3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。 4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa 时，关闭排气阀。 5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。 6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在 0.15mPa。电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分 钟，否则营养物质破坏。 7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。 8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。 操作人员部门主管质量负责人姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日

确保培养箱温度恒定。 【适用范围】 各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。 【该SOP变动程序】 本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。 【操作方法】 1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。 2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。 3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。 4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。 5．培养箱工作温度波动范围应控制在±10C以内。 6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。 7．培养箱内外应保持清洁。 操作人员部门主管质量负责人 姓名唐玉贞检验科检验科 日期 06年06月06日

微生物限度检查办法验证方法

微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3

微生物检验方法验证方案

微生物限度检查方法（平皿法） 验证方案 目录 一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 2．验证方法步骤 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4．验证结果评价分析

5．附件 微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草

2．验证方案的审核与批准 验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理 通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、

临床微生物学检验名词解释

1.微生物microorganism：是存在于自然界的一大群形体微小、结构简单、肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的微小生物。 2.微生物学microbiology：是生物学的一个分支，是研究微生物的类型、分部、形态结构、生命活动及其规律、遗传、进化，以及人类、动物、植物等相互关系的一门科学。 3.医学微生物学medical microbiology：主要是研究与医学和疾病有关的病原微生物的生物学特性、致病性、免疫性，以及特异性诊断和防治措施的学科，目的是控制和消灭微生物引起的感染性疾病，以保证和提高人类的健康水平。 4.细菌L型bacterial L form：细菌在体内外受到各种直接或间接的理化或生物因素影响后导致细胞壁肽聚糖直接破坏或合成被抑制进而形成一种细胞壁缺失或缺陷的细菌。 5.?原生质体protoplast：细菌变成为L型后，细胞壁完全缺失，细菌仅被一层细胞膜包裹。 6.原生质球spheroplast：源于革兰阴性菌的L型。 7.中介体mesosome：细菌细胞膜可内陷形成一种特有的结构，是部分胞膜折叠形成的泡囊状、管状或薄层状结构，在电子显微镜下方能看到。 8.?质粒plasmid：是细菌染色体外的遗传物质，存在于细胞质中，是小的双股闭合环状DNA分子，可独立于染色体存在并复制，也可整合到染色体上。 9.芽孢：很多革兰阳性菌在一定条件下可在菌体内部形成具有多层膜包裹的原型或卵圆形的小体，是细菌代谢处于相对静止状态、维持生存、具有特殊抵抗力的休眠结构。 10.热原质pyrogen：是细菌合成的一种注入人体或动物体内能引起发热的的物质。 11.?噬菌体bacteriophage or phage：是感染细菌、真菌、放线菌和螺旋体等微生物的病毒，只能在活的宿主菌内复制，噬菌体的DNA不仅随着它的感染可在宿主菌之间及宿主菌与噬菌体之间传播，而且还能赋予宿主菌某些生物学性状。 12.?毒性噬菌体virulent phase：为感染宿主后，能在宿主菌细胞内独立复制增殖，产生许多子代噬菌体并最终裂解细菌的噬菌体。 13.溶源性细菌lysogenic：染色体上有前噬菌体的细菌。 14.溶原性噬菌体lysogenic phase：为感染宿主菌后，将其基因组整合到宿主菌染色体上或像质粒存在于细胞之中，随细菌的DNA复制而复制，并随细菌的分裂而传代的噬菌体。15.转座子transposon，Tn：是一类在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动的遗传成分，是细菌基因组中一段特异的具有转位特性的独立DNA序列。 16.突变mutation：是细菌遗传物质的结构发生突然而稳定的改变，导致的变异可传于后代。 17.?转化transformation：是供体菌游离的DNA片段直接进入受体菌，使受体菌获得新的性状。 18.?接合conjugation：是细菌通过性菌毛相互连接沟通，将遗传物质（质粒）从供体菌转移给受体菌。 19.?转导transduction：是以温和噬菌体为载体，将供体菌的遗传物质转移到受体菌中，使后者获得新的性状。 20.?溶原性转换lysogenic conversion：是侵入细菌的噬菌体在溶原期可以前噬菌体形

2015版药典微生物限度微生物无菌方法学验证流程

微生物限度/无菌方法学验证流程 1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月 单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐， 2.每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天 药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌 （细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌 （霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间） 3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天 实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用 药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证： 1.回收率验证：回收率验证实验共需要26天 （若回收率达不到药典规定需要重新选用另一种方法进行验证） 五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2铜绿假单胞菌 3枯草芽孢杆菌 4白色念珠菌 5黑曲霉菌 五种阳性菌的回收率验证需使标准阳性菌回收率在阳性对照组计数达到50％-200％之间 假设验证一次成功 3种细菌回收率各需要4天时间，2霉菌酵母菌各需要7天时间 2.控制菌适用性验证：共需要20天 大肠埃希菌控制菌方法：需要5天时间 其他制剂含药材原粉的中药制剂需要检查沙门菌、耐胆盐革兰式阴性菌各需要7天时间共1周实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等 方法学验证一次顺利完成共需要46天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认 复方茵陈注射液无菌方法学适用性验证： 1.方法适用性验证：验证实验共需要30天 （若回收率失败或达不到药典规定回收率需要重新选用方法进行验证） 五种实验菌分别验证 1金黄色葡萄球菌 2大肠埃希菌菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5白色念珠菌 6黑曲霉菌 6种实验组阳性菌需与对照管组进行对照,含供试品的实验菌均生长良好则说明方法可行 假设验证一次成功 每种菌分别按规定温度培养，培养时间不得超过5天 实验室消毒实验用具灭菌，实验细菌培养物灭活处理，实验用具洗涮等， 方法学验证一次顺利完成共需要30余天，验证方法过程需要重复一遍作为方法学适用性确认

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将

临床微生物学检验

2、（正常菌群）条件致病性微生物——临床上多引起内源性感染。 3、G+菌特有成分：磷壁酸（重要表面抗原，可用于细菌血清学分型）（外毒素） 4、G-菌特有成分：外膜层（由脂多糖（内毒素）、脂质双层（磷脂）、脂蛋白）

5、G+菌和G-菌细胞壁的共同成分是肽聚糖。结构由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥（G-菌无。是溶菌酶、青霉素作用部位） 6、细菌的主要遗传物质：核质（染色体）、质粒（存在于胞质，双链闭合环状DNA分子）、转位因子 7、细菌特殊结构：荚膜（保护，致病，抗原性，鉴别）、芽胞、鞭毛（运动器官）、菌毛（普通菌毛—粘附，致病性；性菌毛—接合方式转移遗传物质） *将芽胞是否被杀死而作为判断灭菌效果的指标 8、L型（细胞壁缺陷）菌落：①“油煎蛋”（荷包蛋）样菌落（典型L 型细菌）。②颗粒型菌落（简称G型菌落）③丝状菌落（简称F型菌落）。高渗环境生长。（环丙沙星） 9、自营菌：以无机物为原料；异营菌(腐生菌：以无生命的有机物质为营养物质；寄生菌：以宿主体内有机物为原料),所有致病菌都是异营菌。 10、细菌营养物质：水、碳源、氮源、无机盐类和生长因子。 11、细菌个体的生长繁殖方式：无性二分裂，在对数期以几何级数增长 12、细菌分类（伯杰）等级依次为界、门、纲、目、科、属、种（最小分类单位）。 13、常用的细菌培养方法是：需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法；

14、通常由正常无菌部位采取的标本接种血平板，置于空气或含5%～10%CO2的气缸中培养，大部分细菌可于24～48h生长良好。 15、血清学诊断时，一般要在病程早期和晚期分别采血清标本2～3份检查，抗体效价呈4倍或以上增长才有价值。 16、透射电子显微镜适于观察细菌内部的超微结构；扫描电子显微镜适于对细菌表面结构及附件的观察。 17、细菌染色的基本程序：涂片（干燥）→固定→初染→染色（媒染）→（脱色）→（复染，使脱色菌体着色）。 18、胃部细菌喜酸，肠道细菌喜碱 19、SS琼脂有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。因选择性过强，可影响检出率，所以，使用时最好加一种弱选择平板以配对互补。 20、碱性琼脂或TCBS琼脂用于从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。 21、痰标本：血平板、中国蓝／麦康凯、巧克力平板作分离。 22、中国蓝／麦康凯用于筛选G-杆菌； 23、含杆菌肽的巧克力平板（含有V和X因子）用于筛选嗜血杆菌 24、连续划线分离法：杂菌不多的标本。 分区划线分离法：杂菌量较多的标本。 25、斜面接种法：该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性 26、倾注平板法：牛乳、饮水和尿液细菌计数

微生物限度方法学验证方案(沙门菌)剖析

微生物限度检测方法学验证方案文件编号：YZ-WJ-001-0

批准签字页

目录 1.目的 (4) 2.责任者及职责 (4) 3.验证简介 (4) 4．验证过程 (5) 5．结果判断 (5) 6．结论和建议 (5) 7．再验证 (5) 8．附件 (5) 附件1：培养基的灵敏度复核 (6) 附件2：稀释液的无菌性检查 (7) 附件3：方法验证 (8) 附件4：培养基厂家报告 (9)

1.目的 按照中国药典2015版（第四部）规定，确认所采用的方法适合该药品的沙门菌的测定。照此检测法和检验条件进行沙门菌检查，能保证结果的准确、可靠。 2.责任者及职责 3.验证简介 验证时，按供试液的制备控制菌检查法所规定的方法及要求进行，验证实验至少进行3次独立平行实验。 3.1验证用菌株 3.2样品名称及数量 3.3实验用品

3.4培养基 检查人：复核人：检查日期： 4．验证过程 4.1试验器具准备 试验前，将先前已准备的适量稀释液和培养基灵敏度复核检查合格的培养基、检品和所用仪器一同放入无菌室的传递厨内。用消毒剂对无菌室进行消毒，并擦拭超净台，打开超净工作台风机及紫外灯灭菌1小时以上。 4.2测定 4.2.1 按照无菌室更衣程序更衣，进入无菌室。 4.2.2 用70%酒精棉球擦拭工作台面与待测品表面。 4.2.3菌液制备：沙门菌菌数控制在10~100cfu/ml 4.2.4取胰酪大豆胨液体培养基两份，分别加入10ml供试液及1ml10~100cfu/ml沙门菌菌悬液，混匀，30~35℃培养18~24小时。取上述各培养物0.2ml，接种至木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上。沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板上生长良好，菌落为淡红色或无色透明或半透明，中心有或无黑色。未接种的木糖赖氨酸脱氧胆算盐琼脂培养基平板作为空白对照。用接种针挑选疑似菌落于三铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18~24小时，或采用其他适宜方法进一步鉴定。 5．结果判定 若木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上有疑似菌落生长，且三糖铁琼脂培养基的斜面为红色、底层为黄色，或斜面为黄色、底层为黄色或黑色，应进一步进行适宜鉴定试验，确证是否为沙门菌。如果平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或三糖铁琼脂培养基的斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色，底层未见黄色或黑色，判定供试品未检出沙门菌。 6．结论和建议 此项中将根据实际测试的结果给出运行确认的结论，有异议的将给出建议。 7．再验证 如该验证的试验方法或试验相关试剂发生改变，需再验证。 8．附件 8.1附件1 培养基灵敏度检查记录 8.2附件2 稀释液无菌检查记录 8.3附件3 微生物方法学验证记录 8.4附件4 培养基厂家报告

2015年版中国药典微生物限度检查方法验证的方案.doc

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审

1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表