改良热硼酸法高效提取苹果果实RNA

改良热硼酸法高效提取苹果果实RNA

姚玉新郝玉金?翟衡赵玲玲

山东农业大学园艺科学与工程学院 (271018)

email: yyx0819@https://www.wendangku.net/doc/10607461.html,

摘要针对苹果果实中多酚多糖和其他次生物质含量较多的特点在原热硼酸法的基础上进行改进主要是添加提取辅助剂和根据辅助剂的特性调整提取步骤改良的方法可以从早期和后期的苹果果肉中高效稳定提取高质量的RNA A260/A230大于2.0A260/A280介于1.8~2.1之间并且RNA提取产量高其中前期果实RNA产率在13.40 μg/g之上后期果

实RNA产率在7.02 μg/g之上完全可以满足RT-PCR cDNA-AFLP等分子生物学实验

关键词苹果果实总RNA改良热硼酸法

提取高质量的苹果果实RNA是对苹果果实品质生长发育和代谢等相关基因进行分子生物学研究的基础苹果果实中含有大量的多糖酚类物质及其他各种次生代谢产物因而提取高质量的苹果果实RNA比较困难目前盐酸胍法硫氢酸胍法Trizol试剂法和CTAB 等常规方法都不能有效提取苹果果实RNA尤其是发育后期的果实RNA降解的趋势大于合成包括RNase在内的各种水解酶大量积累同时多酚和多糖的含量也随之增加RNA 的提取更加困难热硼酸法提取组织RNA最早是由Manning[1]提出在此基础上此方法也被多次改良以满足不同作物和组织RNA的提取要求[2,3]我们针对苹果果实的特点对该方法进行改良改良后的方法可以有效去除苹果果实中的多糖酚类以及其他次生代谢产物可以从不同发育阶段的苹果果实中提取高质量的RNA

1 材料和方法

1.1 材料

以富士东光青苹和金帅早期花后一周和晚期成熟前1周的果实(液氮保存)作为提取RNA的材料

1.2 实验试剂

RNA提取缓冲液为0.2 mol/L 硼砂30 mmol/L EGTA1%w/v SDS DSS10 mmol/L DTT1%w/v NP-402% PVP-4020 mg/ml 蛋白酶K; 10M LiCI10mM Tris-HCI pH 7.52M KAc (pH 5.5)2M KCI无水乙醇DEPC处理水

1.3 总RNA的提取

取10g左右新鲜或液氮保存的苹果果肉放入研钵中液氮研磨后转入预冷的50ml Falcon 管中迅速加入35ml预热到80-90oC的提取缓冲液PVP DTT和NP-40现用现加然后

加入220μl 20 mg/ml 蛋白酶 K 轻轻混匀42oC水浴中1.5小时水浴后加入3.84ml 2M KCI冰浴1小时4oC10000 rpm离心20 min取上清液通过灭菌的Miracloth 将上清液转移到新的50ml 离心管中加入1/4体积10M LiCI混匀后冰浴1小时以上可以过夜

4oC10000rpm离心20min弃上清液用1ml 2M LiCI充分悬浮沉淀然后转移到1.5ml 离心管中4oC15000rpm 离心10min弃上清液重复上一步用400ul 10mM Tris-HCI (pH7.5)使沉淀悬浮室温有利于沉淀悬浮4oC, 15000rpm离心10min取上清液加入1/10体积40μl2M KAc (pH 5.5) 冰浴15min4oC15000rpm离心10min取上清液加入2.5体积的预冷的无水乙醇-80 放置1-2hrs4oC15000rpm离心30min超净台上风干沉淀加入20ul TE pH8.0溶解沉淀-80oC保存

?通讯作者Author for correspondence.

1.4 紫外扫描

取上述RNA溶液1μl稀释100倍用日本岛津UV-2450型分光光度计进行紫外扫描

波长范围为200-300nm记录A230A260和A280并计算A260/ A230和A260/ A280

1.5 凝胶电泳

MOPS缓冲液 1.2%琼脂糖凝胶电泳

1.6 RT-PCR反应

取2μg RNA用M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit 合成cDNA稀释10-50倍用于PCR 扩增PCR扩增产物为ACTIN 基因的部分序列大约800bp5’引物序列为

5’-TGYGAYAAYGGNACNGGNATGG -3’3’端引物序5’-ATRTCNACRTCRCAYTTCATDAT -3’25ul的反应体系为2μl的cDNA约50ng0.4umol/L的上游引物和下游引物 2.5μl

的PCR反应缓冲液200umol/L的dNTP0.5U的TaqE鼎国PCR循环条件为 94oC 预变性10min35个循环94oC变性30s52oC退火45s72oC延伸80s最后72oC延伸5min

1.7 cDNA AFLP分析

取2μg RNA用M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit 合成双链cDNA稀释20-50倍后用EcoRI 和 MseI 酶切然后进行人工接头的连接作为预扩增的模板预扩增扩增产物稀释20倍后用于选择性扩增扩增产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后银染检测

2 结果与分析

2.1 RNA提取产量和质量分析

图1 RNA扫描曲线早期和晚期富士果实

Fig.1 Scanning curve from the young and late fruit pulp of Fuji apples

通过此种方法提取苹果果实RNA早期的果实每克材料可以提取13.40~25.90μg RNA后期的果实每克材料可以提取7.02~8.82μg RNA可见提取效率较高完全可以满足各种分子生

物学实验所得的RNA紫外扫描曲线图1及计算扫描结果表1A

260/A230均大于2.0

A260/A280在1.8~2.1表明此种方法可以有效地去除蛋白质和多糖单凭紫外检测不能完全说明RNA的质量为此在1.2%的琼脂糖上电泳检测从电泳图上可以观测到28S rRNA18S rRNA和5.8S rRNA 3条电泳带RNA基本没有降解而且没有蛋白多糖和DNA的污染

表1 不同时期和品种的RNA提取产量和质量

Table 1 RNA yield and quality from the young and late fruit pulp of different apple cultivars

提取材料A230A260A280A260/A230A260/A280RNA含量

μg·ul-1

RNA产量

μg·g-1

富士1 0.87 1.89 0.96 2.17 1.96 7.54 16.02 富士2 0.45 1.05 0.56 2.32 1.87 4.21 7.02 东光1 1.38 2.90 1.41 2.10 2.05 12.00 25.90 东光2 0.40 0.94 0.47 2.35 1.90 4.21 8.60 青萍1 0.63 1.61 0.87 2.54 1.85 6.45 13.40 青萍2 0.45 1.08 0.56 2.42 1.92 4.32 8.82 金帅1 0.80 1.78 0.93 2.22 1.90 7.12 14.02 金帅2 0.47 1.03 0.53 2.19 1.94 4.12 8.17 注1代表早期果实2代表晚期果实

Note: 1 from the young fruit pulp; 2 from the late fruit pulp

1 2 3 4 5 6 7 8

28S

18S

5.8S

图2. 不同品种和不同时期苹果果实提取RNA的电泳结果

1.富士1

2.东光13青苹1 4.金帅1 5. 富士2 6.东光27.青苹28.金帅2

注1代表早期果实2代表晚期果实

Fig 2. The agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from young and late fruit pulp of different

cultivars

1.Fuji1

2.Dongguang1 3 Granny smith1 4.Golden Delicious1 5. Fuji2 6. Dongguang27. Granny smith2

8. Golden Delicious2

Note: 1 from the young fruit pulp; 2 from the late fruit pulp

2.2 RT-PCR分析

RT-PCR是基因克隆转基因植物分子鉴定等分子学实验的重要方法之一它对RNA

的纯度和质量都有较高的要求特别是DNA的污染问题要求更高利用ACTIN基因对本实

验所提取地8个RNA样品进行特异扩增结果都得到了800bp左右的目的片段电泳条带

清晰一致(图3)说明本实验提取的RNA可以用于RT-PCR

M 1 2 3 4 5 6 7

图3. 不同苹果品种的RT-PCR分析

M. DL2000; 1.富士1 2.东光13青苹1 4.金帅1 5. 富士2 6.东光27.青苹2

注1代表早期果实2代表晚期果实

Fig 3. RT-PCR amplification of different apple cultivars

M. DL2000; 1.Fuji1 2.Dongguang1 3 Granny smith1 4.Golden Delicious1 5. Fuji2 6. Dongguang7. Granny smith2

Note: 1 from the young fruit pulp; 2 from the late fruit pulp

2.3 cDNA-AFLP 分析

cDNA-AFLP实验最为关键的步骤就是获得高质量的模板和对模板进行彻底酶切要获得高质量的cDNA模板必须提取高质量的RNA RNA可以是提取的总RNA但要求完整没有降解和无DAN的污染如果有DAN污染必须用DNase处理本实验所提取的RNA不经DNase处理直接用于合成cDNA, 最后得到了比较理想的AFLP结果图4不同品种间多态

性好同一品种的不同时期的差异带是由不同时期基因表达存在差别或者表达丰度差别太大造成的可见该方法提取的RNA符合该实验的要求

1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8

图4.引物组合 E-ACG/M-CAG 和 E-AGG/M-CTA 产生的电泳图

1.富士1

2. 富士23东光1 4. 东光2 5. 青苹1 6. 青苹2 7. 金帅18.金帅2

Fig.4 cDNA-AFLP electrophoresis figure amplified by E-ACG/M-CAG and E-AGG/M-CT A

1.Fuji1

2. Fuji2 3 Dongguang1 4. Dongguang2 5. Granny smith1 6. Granny smith2 7. Golden

Delicious18. Golden Delicious2

3. 讨论

分离高纯度完整的RNA是基因克隆和基因表达分析的基础但由于RNA很容易被极微量的内源和外源RNA酶降解而且水溶性细胞次生代谢物质, 如多糖多酚在RNA 提取过程中易与RNA结合形成粘稠难溶的胶状物而导致RNA的大量损失目前发表的关于植物RNA提取的文献很多但不同植物种类和同种植物的不同组织因内含物组分及含量有很大差别往往需要不同的RNA提取方法[4]

本方法主要是在原来热硼酸法的基础上加入其他一些提取辅助剂并根据辅助的特性调整提取步骤来高效提取苹果果实中的RNA通过高浓度的KCI和选择性沉淀剂LiCI将RNA 多次沉淀使RNA与多糖和酚类物质最大程度分离[5]加入还原剂DTT螯和剂水不溶性PVP和硼酸可以有效的防止酚类物质的氧化从而组织酚类物质氧化产物与RNA的不可逆结合[6]通过这些优化措施有效的避免了酚类物质的干扰多糖的许多理化性质与RNA很相似很难将他与RNA分开多糖会形成难溶的胶状物与RNA共沉淀, 含有多糖的RNA 沉淀难溶于水或溶解后产生粘稠的溶液无法用于下一步的分子生物学实验因此多糖的去除比多酚物质困难本实验通过用KCI和LiCI使RNA沉淀[5]使RNA和多糖分离然后又通过加入KAc使多糖沉淀[7]有效的避免了多糖的干扰通过蛋白酶K能够有效除去蛋白质全部样品都没有检测出蛋白不过与苯酚氯仿除蛋白质相比成本相对较高通过加入PVP-40可以明显提高提取的产量和质量而加入NP-40则可以进一步提高提取的质量[1]总得来看本方法与其它方法相比提取需要的成本稍高主要是应用了蛋白酶K但可以高效稳定的从早晚期果实中提取高质量的RNA完全可以满足各种分子生物学实验是一种比较理想地提取苹果果实RNA的方法同时该方法也为其他植物材料RNA的提取提供参考

参考文献

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Biol Reptr, 1993, 11: 21~215

A Modified Hot Borate Method Significantly Enhances the

Yield of High-Quality RNA from Apple Pulp

Yao Yuxin, Hao Yujin* Zhai Heng Zhao Lingling

College of Horticultur Science and engineering ,

Shandong Agriculture University, Tai’an, PRC ,271018

Abstract

Extracting high quality RNA from apple pulp is difficult due to interference by high levels of endogenous phenolics, polysaccharides, and secondary metabolites. A modified hot berate procedure was developed to extract RNA of high quality and yield. Following this efficient procedure, we obtained more than 13.40 ug/g and 7.02 ug/g total RNA from young fruit approximately 7 days post- anthesis and late fruit 7 days before ripening, respectively. The ratio of A 260/A230 >2 and A260/A280=1.8~2.1.The RNA is suitable for RT-PCR, Northern Blot and cDNA library construction. Key Words: Apple Pulp; Total RNA; Modified Hot Borate Method

RNA试剂盒提取步骤

常规植物样品总RNA小量抽提 1. 植物样品的研磨。 ?收集植物样品并尽快浸泡到液氮中以防止RNA 的降解。使用研钵、研磨棒和液氮将植物样品研磨成尽量细小的粉末。RNA 的产量取决于样品类型和研磨效果。 注：研磨后的植物粉末可直接保持于-70°C。 ?快速称取50-100mg 的研磨好的植物样品至1.5ml 预冷的离心管中。 注：在加入裂解液之前，不要让样品解冻。初次使用时，推荐先使用50mg，待取得理想结果后， 再酌情提高用量。 2. 立即加入500μlBuffer RL/β-ME混合液至样品中。立即于最高速度涡旋30-60 秒 充分打散样品，室温静置3-5 分钟让样品充分裂解。 注：使用前分装适量的Buffer RL，每1ml Buffer RL 加入20μl β-疏基乙醇(β-ME)或2M DTT。 若植物用量增加超过100mg，按比例增加Buffer RL/2-ME 的用量。 3. 室温下，14,000 x g 离心5 分钟。 4. 把gDNA 过滤柱装在2ml 收集管中。把第三步的上清液转移至gDNA过滤柱中。14,000 x g 离心1 分钟。 5. 弃去gDNA 过滤柱。加入0.5倍体积无水乙醇(~250μl)至滤液中。用移液枪吸打3-5次混匀。 6. 把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管中。转移第5 步的混合液至RNA柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。 7. (可选)这一步可插入DNase 进行膜上消化。(请另外订购DNase On Column Kit 进化 膜上DNase 消化)。 8. 倒弃滤液，把柱子装在收集管中。加入500μl Buffer RW1 至柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。9. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl Buffer RW2 (已用乙醇稀释)至柱子中。10,000 ×g 离心30-60 秒。 注：在使用Buffer RW2 之前，必须按瓶子标签指示用无水乙醇进行稀释。 10. 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。加入600μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱 子中。10,000×g 离心30-60 秒。 11. 倒弃滤液，把柱子套回空的收集管。10,000 ×g 离心空柱2 分钟甩干柱子。 12. 将柱子转移至新的1.5ml 离心管。加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 13. (可选)再加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 注：HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是30μl，小于30μl 会导致RNA 的洗脱效率下降。如果RNA 产量超过30μg，推荐按第13 步进行第二次洗脱。 14. 弃去柱子，把RNA 保存于-80oC。

植物RNA提取步骤

植物RNA提取步骤（附图） 实验步骤 1. 在eppendorf管中加入700ul 提取液（配方见后面）和10 ul巯基乙醇（在有褐化现象的时候再加就行，否则推荐不加），65度预热（可选）。 2. 研钵液氮预冷，取适量材料加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（有滑腻感），加入到预热的eppendorf管中水浴6min（可选）.取出后加入氯仿、酚各350ul，振荡20min。 3. 4℃13000rpm 离心15min，同时在另外的eppendorf管加入氯仿、酚各350ul。 4. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10 min。 5. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入氯仿700ul。 6. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10min。 7. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入350ul的75％乙醇、350ul的8MLiCl。 8. 吸取上清，加入到上述离心管中，－20℃沉淀30min，13000rpm离心20min。 9. 弃上清，75％乙醇清洗两次。 溶于30ul 的水（DEPC水），直接进行测定浓度和电泳，CTAB结果如下(左侧四个）：0.155ug/ul 260/280=2.11 260/230=2.20 SDS结果如下（右侧四个） 0.102ug/ul 260/280=1.78 260/230=2.05 电泳结果如下： 加入DNase和buffer（promega）,37度消化30min,氯仿抽提两次,用1/10体积NaAc 和二倍体积无水乙醇沉淀15min,13000rpm离心10min.75%酒精洗两次, 溶于30ul 的水（DEPC水）中.

硼砂(水合四硼酸钠)

一、硼酸 硼酸，为白色粉末状结晶或三斜轴面鳞片状光泽结晶，有滑腻手感，无臭味。溶于水、酒精、甘油、醚类及香精油中，水溶液呈弱酸性。大量用于玻璃（光学玻璃、耐酸玻璃、耐热玻璃、绝缘材料用玻璃纤维）工业，可以改善玻璃制品的耐热、透明性能，提高机械强度，缩短溶融时间。 1.硼酸的详细说明 CAS:10043-35-3 分子式: H3BO3 分子质量: 61.83 熔点: 169℃ 中文名称: 硼酸(医药级) 英文名称: Boric acid Boracic acid basilit b boric acid borofax boron trihydroxide 性质：硼酸实际上是氧化硼的水合物（B2O3·3H2O。比重1.435（15℃）。硼酸在水中的溶解度随温度升高而增大，并能随水蒸汽挥发；在无机酸中的溶解度要比在水的溶解度小。加热至70～100℃时逐渐脱水生成偏硼酸，150～160℃时生成焦硼酸，300℃时生成硼酸酐（B2O3）. 溶解度表为： 0℃3g、10℃3g、20℃5g、30℃7g、40℃9g、50℃11g、60℃15g、70℃18g、80℃23g、 90℃29g、100℃37g 硼酸对人体有毒，内服影响神经中枢。 2.硼酸的生产方法 制法及工艺流程 1、硼砂硫酸中和法将硼砂溶解后。加硫酸复分解制得硼酸。 Na2B4O7+H2SO4+5H2O→4H3BO3+Na2SO4 2、碳氨法将硼矿粉与碳酸氢铵溶液混合，经加温加热后分解得到含硼酸氨料液，再经脱去反 应生成的氨，即得硼酸。 2MgO.B2O3+2NH4HCO3+H2O→2(NH4)H2BO3+2MgCO3 (NH4)H2BO3→H3BO3+NH3 3、盐酸法。用盐酸酸解硼精矿，再经过滤、结晶和干燥，即得硼酸。 2MgO.B2O3+4HCl+ H2O→2H3BO3+2MgCl2 4、井盐卤水盐酸法。由含硼卤与盐酸一起蒸煮，再经脱水、结晶、干燥即得硼酸。 包装：用内衬二层牛皮纸（或塑料袋）的麻袋包装。每袋净重25公斤或80公斤。

提取细胞RNA的步骤

提取细胞RNA的步骤 提取细胞RNA的步骤： 1) 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。 2) 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12，000g，15min）。 3) 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。 4) 加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。 5) 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心（4℃，7，500g，5min）。 6) 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清，尽量除去。 7) 加入20ul DEPC水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。 8) 细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。 1、实验目的 提取人体细胞的总RNA和mRNA。 2、本实验所需试剂 1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件， 2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂， 3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管, 4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇， 5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

(完整版)总RNA提取的原理、步骤

总RNA提取的原理、步骤 1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 2.简易步骤 细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆 ↓ 室温静置5分钟 ↓ 加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀 ↓ 室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟 ↓ 将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀 ↓ 室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清 ↓ 向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟 ↓ 弃上清保留沉淀，干燥 ↓ 沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中 ↓ 注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。 注意事项 ①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 ②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。

③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 ④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在 15 -30°C的条件下。 ⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至 0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。) ⑥每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 ⑦单层生长的细胞直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL 量（每10 cm2加1 ml）。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。 ⑧在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（RNA 洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。 逆转录cDNA及注意事项 如果cDNA当天不使用，则要保存在-20℃或-70℃。 RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下：（在冰盒上操作） 1.将提取的RNA溶解于11 μl DEPC-t净化水中，加入1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP 轻微震荡后离心3-5秒。 2.在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。 3.冰上冷却1分钟，并短暂离心，向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl，10 mM dNTP mix 2μl。 4.轻微震荡后离心3-5秒，在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。 5.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl，在PCR 扩增仪上42℃ 60分钟进行逆转录，70℃ 10分钟灭活逆转录酶。 6.收集反应产物，冰上冷却

硼砂硼酸分析方法 中和滴定法

硼砂—硼砂的测定—中和滴定法 应用范围： 本方法采用中和滴定法测定硼砂（Na2B4O7·10H2O）的含量。 本方法适用于硼砂的测定。 方法原理： 取供试品适量，加水溶解后，加0.05%甲基橙溶液1滴，用盐酸滴定液（0.1mol/L）滴定至橙红色，煮沸2分钟，冷却，如溶液呈黄色，继续滴定至溶液呈橙红色，加中性甘油与酚酞指示液，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定至显粉红色。每 1mL氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于9.534mg的Na2B4O7·10H2O，计算，即得。 试剂： 1. 水（新沸放置至室温） 2. 0.05%甲基橙溶液 3. 中性甘油 4. 盐酸滴定液（0.1mol/L） 5. 甲基红-溴甲酚绿混合指示液 6. 基准无水碳酸钠 7. 氢氧化钠滴定液（ 0.1mol/L ） 8. 酚酞指示液 9. 基准邻苯二甲酸氢钾 试样制备： 1. 0.05%甲基橙溶液 取甲基橙0.05g，加水100mL使溶解，即得。 2. 中性甘油 取甘油80mL，加水20mL与酚酞指示液1滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定至粉红色。 3. 盐酸滴定液（0.1mol/L） 配制：取盐酸9.0mL，加水适量使成1000mL，摇匀，得0.1mol/L盐酸滴定液。标定：取在270~300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约0.15g，精密称定，加水50mL使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示液10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每1mL盐酸滴定液（0.1mol/L）相当于5.30mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度。 4. 甲基红-溴甲酚绿混合指示液 取0.1%甲基红的乙醇溶液20mL，加0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30mL，摇匀。 5. 氢氧化钠滴定液（0.1mol/L） 配制：取氢氧化钠适量，加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后备用。取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6mL，加新沸过的冷水使成1000mL，摇匀。 标定：取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6g，精密称定，加新沸过的滴，用本液滴定，在接近终点时，应使2，振摇，使其尽量溶解，加酚酞指示液50mL冷水．

RNA提取步骤

1. 组织样品：称取20mg-50mg 样品，使用液氮研磨或者匀浆器匀浆，加入RNA-Solv ? Reagent裂解 2. 室温静置2-3 分钟。 3. 加入200μl 氯仿(氯仿的使用量为1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量），涡旋混匀15 秒，冰浴10 分钟。 4. 4℃，12,000×g 离心15min。 5. 小心转移不大于80%的水相层至新的离心管，加入1/3 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀15 秒。 6. 将HiBind RNA 结合柱套在2ml 离心管中，转移不大于700μl 混合液至HiBind RNA 结合柱中。 室温下10,000×g 离心1 分钟，弃滤液。 7. 重复步骤六，直至所有的混合液全部离心，结合到HiBind RNA 结合柱上。 8. 将HiBind RNA 结合柱套在新的2ml 离心管中，加300μl RNA Wash Buffer I 至HiBind RNA 结合柱中，10,000×g 离心1 分钟，弃滤液； 9. （选做）DNase I 消化: a. 配制DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Free DNase I,1.5μl),混匀。 b. 将上述75μl DNase I 溶液转移至HiBind RNA 结合柱膜的正中央，不要将消化液转移至柱子内 壁。 c. 室温静置15 分钟。 10. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中，加入400μl RNA Wash Buffer I 洗涤，如做了DNase I 消化，需室温静置 5 分钟，10,000×g 离心1 分钟，弃滤液。 11. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中，加入500μl RNA Wash Buffer II 洗涤，10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液。 12. 重复步骤11 一次，＞10,000xg 离心空甩2min 干燥HiBind RNA 结合柱基质。 13. 将HiBind RNA 结合柱套在干净的1.5ml 离心管中，加30-50μl DEPC Water，室温静置2min。≥10,000xg 离心1min 洗脱RNA。

硼酸和硼砂的性质实验报告

竭诚为您提供优质文档/双击可除硼酸和硼砂的性质实验报告 篇一：硼砂的性质 硼砂也叫粗硼砂[1]，在化学组成上，它是含有10个水分子的四硼酸钠。它的晶体为板状或柱状，晶体集合在一起形成晶簇状、粒状、多孔的土块状等等，颜色为白中带灰硼砂 或带浅色调的黄、蓝、绿等，具有玻璃光泽。 物化性质 无色半透明晶体或白色结晶粉末。无臭，味咸。比重1.73。320℃时失去全部结晶水。易溶于水、甘油中，微溶于酒精。水溶液呈弱碱性。硼砂在空气可缓慢风化。熔融时成无色玻璃状物质。硼砂有杀菌作用，口服对人有害。cAs:1303-96-4分子式:na2b4o7.10h2o分子质量:381.37沸点:1575℃熔 点:320℃ 篇二：实验三(氮族、硅、硼) 实验三p区金属元素(二)(氮族硅硼) 实验摘要:

本实摘通过对氯化铵、硫酸铵和重铬酸铵三种铵盐的分解总结铵盐热分解产物与阴离子的关系，可知铵盐热稳定性差，受热易分解为氨和相应的酸。让亚硝酸钠和稀硫酸反应可知亚硝酸盐可转化为亚硝酸，与酸化的碘化钾溶液和高锰酸钾溶液反应会分别生成碘单质和+2价锰离子，可知亚硝酸盐既有氧化性又有还原性。观察浓稀硝酸分别和锌粒反应的现象和程度分析硝酸氧化性和浓度的关系，同时，硫粉和浓硝酸反应同样可(:硼酸和硼砂的性质实验报告)知浓硝酸有强氧化性；通过加热分解硝酸钠和硝酸铜可知硝酸盐也可分解，且产物为亚硝酸盐。测定磷酸钠、磷酸一氢钠和磷酸二氢钠的ph值，并且三种溶液都和硝酸银溶液和氯化钙溶液反应，观察现象和ph的变化；向硫酸铜溶液中逐滴加入焦磷酸钠溶液直至过量，观察现象，探究磷酸盐的酸碱性和溶解性。通过硅酸水凝胶的生成实验掌握硅酸的性质。饱和硼酸加入甘油后ph值减小；点燃硼酸晶体、乙醇浓硫酸的混合物，观察火焰为绿色。进行硼砂珠的制备反应，并分别粘上硝酸钴和三氯化铬，观察颜色变化，以此练习硼砂珠的有关操作。 关键词: 铵盐分解亚硝酸及其盐硝酸及其盐磷酸盐硅酸及其盐硼酸硼砂珠 实验用品:

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free） 三、准备工作 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品

的所有部分都浸泡到溶液中。 3）在通风柜中室温处理过夜。 4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。 （液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应） 2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

关于豆制品中硼酸和硼砂含量检测方法的研究

关于豆制品中硼酸和硼砂含量检测方法的研究 摘要：研究豆制品国家标准中关于硼酸和硼砂含量的技术要求与实际检测豆制品中硼含量异常，通过反复的试验，对样品的处理与姜黄试的纸制作进行了改良，大幅度提升了检验样品的速度，其在食品卫生与监督作用中起到了积极良好的实用性效果。 关键词：姜黄试纸法相高效液相色谱硼砂的危害 豆制品以含有丰富的人体所必须的营养成分而深受人们的喜爱，其含有人体必需的各种氨基酸，同时也含有钙、铁、磷等人体必需的矿物质成分，其中所含的维生素bl、b2 和纤维素，更是平衡人体膳食的重要成分。豆制品也是人们日常餐桌上的健康食品。如今有些许唯利是图的不法商贩为了让豆制产品口感爽滑、具有韧性、不易煮糊，便在豆制品加工制作的过程中添加硼酸或者硼砂，由于硼能够在人体内积蓄，长时间的摄入可能会引起人体蓄积性中毒症状，直接造成人体的皮肤黏膜、脑部、肝脏、肾脏的损害，严重危害到广大消费者的身体健康和生命安全。 四硼酸钠就是我们常说的硼砂，外表看上去是白色或者无色的结晶性粉末状。硼砂通过食物加工经过口腔进入人体消化，在胃中接触胃酸，在其作用下产生化学反应生成硼酸。硼酸是有毒物质，致死量成人一般约为15—20克，幼儿一般约为3—6克。由于硼酸在人体内代谢相当的缓慢，所以持续少量的摄入可能导致硼酸在人体内的积蓄，从而成为了慢性中毒，表现出的症状是食欲不振、厌食、

精神萎靡，乏力、精神恍惚甚至错乱、皮肤炎症、大量脱发以及生理期紊乱。若是一次性大量摄入，吸收后可能会导致急性中毒，初期表现出的症状是呕吐和严重腹泻以及皮疹，影响中枢神经的兴奋，对脑膜有严重的刺激症状并造成严重的肾损伤，严重的中毒可能导致急性肾衰和循环衰竭以至于休克。 正常情况下，硼砂作为化工原料作用于纺织、肥料、玻璃、陶瓷等工业，硼酸一般起到杀菌、杀虫、消毒收敛以及防腐的作用。但是在人们长久的文化生活中硼酸、硼砂许久之前就被人们作用于乳或乳制品、豆制品、肉类的防腐剂。尤其是是硼砂，为了让食品口感爽滑，而在一些食物制品中例如腐竹、猪肉丸、豆腐、河粉、牛肉丸、米粉、肠粉等作为膨松剂添加。然而，由于其具有积聚性可使人引起急性或者慢性中毒，所以《国家食品卫生法》的有相规定。国家食品卫生检验法第sb5009·29—85中明确规定“禁止使用防腐制定性试验”中提及了硼酸、硼砂的定性检测方法。检验样品需经烘干处理，炭化以及高温灰化，这个方法最为作繁琐、复杂、费力、费时，完全无法达到快速检测的要求，以致导致含有硼砂的食品能够广泛流入市场和扩散开来，给民众的身心健康造成了严重的影响。而迅速、可靠、安全、稳定的豆制品中硼砂硼、酸的检测方法正对能保证广大消费者健康和加强国家豆制品质量安全监管具 有十分重要的意义也是非常必要的解决途径之一。 1 “姜黄试纸法”所需材料与对比方法

RNA提取一般步骤总结

RNA提取一般步骤总结 RNA提取原理： | 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。 3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。 4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 5、融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA 时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。 I氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。 试验试剂： 1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 试验步骤： 1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。

RNA提取标准流程图

RNA提取标准流程 原理： TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。 预防RNase污染注意事项： 1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3．RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。 4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。） RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer （宝生物工程（），货号：D603，35元，1mL×5支） 准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。 操作步骤: 1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组

织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50～100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 2．将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于2～8℃ 10000 × g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。 3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC 法） 4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600μl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层） 5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。 b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。 6. 4oC 10000 × g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。 8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol 至少加1 mL 75%乙醇。4℃不超过7500×g离心5 min，弃上清。 9.室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～ 10 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5 μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情

硼砂的功效与作用

篇一：硼砂简介及作用 如明矾，南者黄如桃胶，皆是炼结成，如硇砂之类。西者柔物去垢，杀五金，与硝石同功，与砒石相得也。【小知识】硼砂为硼酸钠的俗称，为白色或无色结晶性粉末，因为毒性较高，世界各国多禁用为食品添加物。硼砂对人体健康的危害性很大，连续摄取会在体内蓄积，妨害消化道的酶的作用，其急性中毒症状为呕吐、腹泻、红斑、循环系统障碍、休克、昏迷等所谓硼酸症。人体若摄入过多的硼，

会引发多脏器的蓄积性中毒。硼砂的成人中毒剂量为 1-3 克，成人致死量为 15 克，婴儿致死量为 2-3 克。炮制方法硼砂：碾成细粉。煅硼砂：将硼砂砸成小块，置锅内加热，炒至鼓起小泡成雪白色结块，取出，放凉。 1.《纲目》：硼砂，研如飞尘。 2.《本草求真》：硼砂，甘草汤煮化，微火炒松用。注意：硼砂为硼酸钠的俗称，为白色或无色结晶性粉末，因为毒性较高，世界各国多禁用为食品添加物。硼砂对人体健康的危害性很大，连续摄取会在体内蓄积，妨害消化道的酶的作用，其急性中毒症状为呕吐、腹泻、红斑、循环系统障碍、休克、昏迷等所谓硼酸症。人体若摄入过多的硼，会引发多脏器的蓄积性中毒。硼砂的成人中毒剂量为 1-3 克，成人致死量为 15 克，婴儿致死量为 2-3 克。主要成分主要为四硼酸钠（na2b4o7·10h2o）．药理作用 1. 抑菌作用有报告指出, 硼砂为一弱碱，其与硼酸一样有弱的抑菌作用．用平板法使培养基中含 10%的硼砂, 对大肠杆菌、绿脓杆菌、炭疽杆菌、福氏痢疾杆菌、志贺痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、变形杆菌及葡萄球菌、白色念珠菌均有抑制作用；用纸片法证明，硼砂还能抑制白喉杆菌、牛型布氏杆菌、肺炎双球菌、脑膜炎球菌及溶血性链球菌等． 2. 抗惊厥及抗癫痫作用实验证明：硼砂给小鼠灌服 130～260mg/kg有抗惊厥作用, 该作用可随给药次数的增加而逐渐增强，最大抗惊厥作用

RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤

RNA提取及反转录合成cDNA具体实验步骤 由杨盛于2011/6/8 12:56 创建 一、RNA提取前的准备 RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施： 1、戴一次性手套； 2、使用RNA操作专用实验台； 3、在操作过程中避免讲话等。 通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 二、使用器具 尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理： 1、用0.1%DEPC水溶液在37℃下处理12小时， 2、然后在120℃下高温灭菌30min以除去残留的DEPC， （RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其他实验。） 三、试剂配制 用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。 RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 四、实验操作 在研磨样品前，先把所要用到的试剂和枪头、研钵（未拆开报纸）放在超净工作台上，打开紫外灯照射20-30min杀菌。 1. 50-100mg的普通组织样品：RNAiso Plus 1ml

2. 试验样品的研磨和匀浆 （1）将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研钵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的 课件颗粒，如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量）。（研磨好的 样品立即加入RNAiso Plus） （2）对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Plus，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置，直至样品完全融化， 再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。 （3）将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min。 （4）12000g 4℃离心5min。 （5）小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀）。 3.Total RNA 的提取 （加入RNAiso Plus 后，静置5min，离心转移上清，避免未破碎的杂蛋白污染） （1）向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5体积量），盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15s（氯仿沸点低，易挥发，振荡时应小心 离心管突然弹开）。待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5min。（2）12000 g 4℃离心15min。 （3）从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的 离心管中（切忌吸出白色中间层）。 （4）向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30℃下静置10min。

RNA提取中的原理

氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA 进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA 的亲水基团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。 异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。 氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制RNase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚（Trizol主要成分就是苯酚，很多自己配试剂提的方法也用苯酚，抽提蛋白时也会用到苯酚），苯酚微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。 通常氯仿里面会加少量异戊醇（1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作，不过个人经验感觉加不加没什么太大区别，也许是我的样品里蛋白不多吧。 异丙醇是沉淀核酸用的，作用和乙醇一样。只不过用量少一点，0.6V~1V就够了，不像乙醇沉淀需要至少2V，一般需要2.5倍体积。在水相很多，离心管容积有限，加不下太多乙醇的时候一般会用异丙醇沉淀。不过感觉效果不如乙醇，偶尔会有沉淀不出来东西的时候。 Trizol法提RNA，加氯仿就是要剧烈手摇才行，这样才能彻底地两相混匀。而且DNA 在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的，不会跑水相里头去。 醇沉淀是很经常用的方法，因为RNA和某些杂质不溶于异丙醇，所以可以用来沉淀。 l楼主问的问题，我的个人理解是： 前面提取的RNA经异丙醇沉淀后，总会含有一些未除去的蛋白和其它杂质分子，这些蛋白和杂质分子如果不除尽的话，就会直接影响所提取的RNA的纯度和稳定性。为此，就需要用70%乙醇洗涤沉淀(因为在70%乙醇里RNA是不溶的,而一些蛋白和其它杂质分子却可溶),并且最好是洗涤2次，然后高速离心后，倒去上清，即可得到较纯的RNA沉淀。用无水乙醇则达不到这个目的!。 以下是我个人提取RNA时的操作总结，不正之处，请战友指正！ 1.1 匀浆 1) 每个无菌的2 ml圆底离心管中加入0.75 ml TRIZOL试剂，每个大鼠的腺垂体从-80°C取出后立即于预冷的TRIZOL试剂里用POLYTRON组织匀浆器（瑞士）进行匀浆。 【注：1. 匀浆液的量按每50-100 mg组织加1 ml TRIZOL，样品的体积不能超过匀浆液体积的10%。2. TRIZOL试剂用前应于4°C保存，操作时应带手套和口罩。3. 匀浆器头用前需在3% H2O2（DEPCC水配）里浸泡，然后于0.1% DEPC水中空转2次，最后于TRIZOL试剂中空转2次，方可用于匀浆。4. 匀浆时间不宜太长，转速不宜过大，刚开始时由慢到快至中档处，然后减速，重复1-2次，未见有组织碎块即可．５．如果样品数多的话，可先将TRIZOL试剂一并加好，然后逐一加入样品匀浆。６.特注：每加完一种试剂，都应及时盖上管盖，夹取管子或者打开管子时，尽可能不要碰到管的内缘。】。 2) 将匀浆样品置于15-30°C下静置5分钟，以使核酸蛋白复合物完全分离。如果所

RNA提取原理及步骤

细菌总RNA提取 一、TRIzol溶液提取细胞总RNA实验原理 1. TRIzol溶液的成分及作用:苯酚、异硫氰酸胍、8－羟基喹啉等。其中苯酚可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，8－羟基喹啉（可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用）、异硫氰酸胍（是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离）、β-巯基乙醇（主要作用是破坏RNase 蛋白质中的二硫键）。因此内源和外源RNase（RNA酶）受抑制，在样品裂解或匀浆过程中，TRIZOL能保持RNA完整性。 2. 提取原理：细胞用TRIzol溶液裂解后，加入氯仿后溶液分为水相和有机相，RNA在水相中（上层）、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质层。之后将水相取出，用异丙醇或者无水乙醇沉淀回收RNA。RNA沉淀用70%的乙醇进行漂洗，最后加ddH2O溶解。 二、实验步骤 1.取一只2mL离心管，加入大肠杆菌培养液0.7ml，10,000 rpm离心2 min，倒掉上清液。 2.加入2mL TRIzol溶液, 至菌体彻底悬浮并彻底裂解。之后，在室温下放置5min,使核酸蛋白质彻底分离。 3.往管中加入0.4ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec,之后在室温放置3min。 4.4℃,13000rmp,离心15min。取出后，可见样品分成三层，RNA在水相中（上层）、中层为DNA、下层为粉色的蛋白质。 5.将上层水相小心取出（约0.5ml）,加入1.5ml离心管中，往管中加入等体积的异丙醇。室温下在室温放置5min。 6. 4℃,13000rmp,离心10min。离心后，可见管底见胶装沉淀。 7.加入2ml 70%乙醇洗涤沉淀，之后倒出液体，注意不要将沉淀倒出，若沉淀松动，可稍离心。 8.用黄色枪头将剩余液体全部吸出后，往管中加入25μl ddH2O,彻底溶解RNA。 9.电泳检测RNA以及昨天实验的DNA。各取8μl样品与2μl loading buffer 混匀，点样。

RNA提取步骤及注意事项

RNA分离纯化的原理、提取步骤及注意事项 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时，常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学的成败。Trizol是一种新型总RNA提取试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、1.5mlEP管（无RNase）、枪头（无RNase）、异丙醇、水（DEPC处理） 低温离心机 三、提取步骤 1、从组织中提取总RNA ①液氮研磨。组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变 软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加 入Trizol，转入离心管进行第二步操作。 ②匀浆。组织样品按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，另外，组织体 积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充 分匀浆约需1-2分钟。 2、从细胞中提取总RNA ①培养贴壁细胞：不需消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，操作步骤： 吸尽培养液，用PBS洗涤细胞2-3次，按10cm2/mlTrizol比例加入Trizol，吹打，使细胞充分裂解。 ②对于悬浮细胞，可直接收集、裂解，每mlTrizol可裂解5×106动物、植 物或酵母细胞，或107细菌细胞。操作步骤：收集细胞，600g离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞2-3次。 ③细胞或组织加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。（此时可放 入-70℃长期保存。 ④12000rpm离心5min，弃沉淀，上清吸入到另一个RNase-free的EP管中， 按200μL氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。（禁用 涡旋振荡器，以免基因组DNA断裂）。 ⑤4℃，12000rpm离心15min，吸取上层水相，至另一个离心管中 （RNase-free）（千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则 保留下层酚相保存于4℃冰箱，如只提取RNA，则弃下层酚相。 ⑥按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min。4℃， 13000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底。 ⑦按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管（或用枪头吹打）， 悬浮沉淀。4℃，13000rpm离心15min，尽量弃上清。 ⑧室温晾干或真空干燥5-10min（RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解）。 O溶解样品，立即进行反转录。 加入20μl Elution Buffer或H 2 四、注意事项 1、RNase非常稳定，是导致RNA降解的最主要的物质，它在一些极端的条件下 可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌