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生物制药工艺学总结

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生物制药工艺学总结

生物制药工艺学

第一章生物药物概述

1、我国药物的三大药源指的是化学药物、生物药物、中草药。

2、现代生物药物已形成四大类型,包括基因工程药物、基因药物、天然生物药物、医

学生物制品。

3、药物、生物药物、生物制品

药物:用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质,有4大类:预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。

生物药物:是利用生物体、生物组织、细胞或其成分,综合应用生物与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的原理与方法进行加工、制造而成的一大类预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

广义:从动物、植物、微生物和海洋生物为原料等制取的各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成的天然物质类似物;还包括生物工程技术制造生产的新生物技术药物。

医学生物制品:

一般指:用微生物(包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等)、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等加工制成的预防、治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病的免疫制剂,主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原与血液制品等。

《新生物制品审批办法》生物制品定义:

是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的,用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品。

4、生化药物、微生物药物

生化药物:指从生物体(动物、植物、和微生物中获得的天然存在的生化活性物质(或者合成、半合成的天然物质类似物),其有效成分和化学本质多数比较清楚,通常按其化学本质和药理作用分类命名。微生物药物:是一类特异的天然有机化合物,包括微生物的初级代谢产物、次级代谢产物和微生物结构物质,还包括借助微生物转化产生的药物或中间体。

5、基因重组药物与基因药物有什么区别?

基因重组药物属于基因工程药物,这类药物主要是应用基因工程和蛋白质工程技术制造的重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。而基因药物不是基因工程药物,这类药物是以基因物质(RNA或DNA及其衍生物)作为治疗的物质基础,包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。

6、生物药物有哪些作用特点?

答:药理学特性:

1)活性强: 体内存在的天然活性物质

2)治疗针对性强,基于生理生化机制

3)毒副作用一般较少,营养价值高

4)生理副作用常有发生,可能具免疫原性或产生过敏反应

理化特性:

1)生物材料中有效成分浓度低,杂质种类多且含量相对较高

2)生物活性物质组成结构复杂、稳定性差

3)生物材料易染菌、腐败

4)生物药物制剂的特殊要求:缓释、控释

第二章生物制药工艺技术基础

1、生化活性物质浓缩可采用的方法有盐析浓缩、有机溶剂沉淀浓缩、用葡聚糖凝胶浓缩、用聚乙二醇透析浓缩、超滤浓缩、真空减压浓缩与薄膜浓缩。

2、生化活性物质常用的干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

3、冷冻干燥是在低温、低压条件下,利用水的升华性能而进行的一种干燥方法。

4、固定化酶常采用的方法可分为吸附法、包埋法、交联法和共价键结合法四大类。

选择题:

5、由于目的蛋白质和杂蛋白分子量差别较大,拟根据分子量大小分离纯化并获得目的蛋白质,可采用( C )

?A、SDS凝胶电泳B、盐析法C、凝胶过滤D、吸附层析

6、分离纯化早期,由于提取液中成分复杂,目的物浓度稀,因而易采用( A )

?A、分离量大分辨率低的方法B、分离量小分辨率低的方法

?C、分离量小分辨率高的方法D、各种方法都试验一下,根据试验结果确定

7、简述生物活性物质分离纯化的主要原理。

生物大分子分离纯化的主要原理是:

1 )根据分子形状和大小不同进行分离,如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等;

2 )根据分子电离性质(带电性)差异进行分离,如离子交换法、电泳法、等电聚焦法;

3 )根据分子极性大小及溶解度不同进行分离,如溶剂提取法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等;

4 )根据物质吸附性质的不同进行分离,如选择性吸附与吸附层析等;

5 )根据配体特异性进行分离,如亲和层析法等。

8、生化制药的六个阶段

(1)原料的选择和预处理

(2)原料的粉碎

(3)提取:从原料中经溶剂分离有效成分,制成粗品的工艺过程。

(4)纯化:粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制的工艺过程。

(5)浓缩、干燥及保存

(6)制剂:原料药(精制品)经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用的各种剂型。

9、生物活性物质的来源及生物材料选择的质量准则

(一)生物活性物质的来源

●动物脏器

●血液、分泌物和其他代谢物

●海洋生物

●植物

●微生物

●开发生物新资源

(二)生物原料选择的质量准则:

?有效成分含量高的新鲜材料;

?来源丰富易得;

?成本比较低;

?杂质含量少

?原料的采集不破坏生态环境, 对环境友好的原材料资源。

10、常用的活性物质提取的方法有哪些?

①酸、碱、盐水溶液提取方法②表面活性剂提取方法与反胶束提取方法③有机溶剂提取

④双水相萃取法⑤超临界萃取法

11、盐溶作用的原理?

在稀盐溶液中,盐离子作用于生物大分子表面,增加了表面电荷,使之极性增加,水合作用增强,促进形成稳定的双电层,对生物大分子起到助溶作用。

12、活性物质提取时的保护性措施哪些?

活性物质的保护措施:

(1)缓冲盐系统:防止pH大幅度变化

(2)保护剂:还原剂、酶的底物、金属鳌合剂

(3)抑制水解酶的作用

加EDTA除去重金属抑制酶活性

选择热变性,使蛋白酶变性

添加酶抑制剂

(4)其它保护措施(防过冷、过热、酸、碱、紫外线、搅拌、高频振荡等)

13、生物制药中分离制备方法的基本原理有哪些?

(1)据分子形状和大小:

差速离心与超离心、膜分离(透析,电渗析)与超滤,凝胶过滤法。

(2)据分子电离性质的差异性:

离子交换法,电泳法,等电聚集法。

(3)据分子极性大小及溶解度不同:

溶剂提取法,盐析法,等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。

(4)据物质吸附性质的不同:

选择性吸附法与吸附层析法。

(5)据配体特异性进行分离:亲和层析法。

第三章生物材料的预处理、细胞破碎和液-固分离

1.细胞培养液的预处理方法。(书P117-120)

1)细胞及蛋白质的处理

(1)加入凝聚剂(2)加入絮凝剂(3)变性作用(4)吸附

(5)等电沉淀(6)加各种沉淀剂沉淀

2).多糖的去除

3).高价金属离子的去除

2.凝聚作用和絮凝作用的原理各是什么?

凝聚作用:指在某些电解质作用下,使胶体粒子的扩散双电层的排斥电位降低,破坏了胶体系统的分散状态,而使胶体粒子聚集的过程。

絮凝作用:当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时,胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面的功能团上,而且一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的颗粒的表面上,形成架桥联接,形成粗大的絮凝团沉淀出来,有助于过滤。

3.常用的细胞破碎方法有哪些?

1)机械法:匀浆法、珠磨法、超声波

2)物理法:干燥、冻融、渗透压冲击

3)化学法:化学试剂处理、制成丙酮粉

4)生物法:酶解法、自溶

4.固液分离方法有哪些?

1)、细胞及蛋白质的处理

(1)加入凝聚剂

Al 2(SO 4)3·18H 2O 、AlCl 3·6H 2O 、FeCl 3、ZnSO 4、MgCO 3

(2)加入絮凝剂

?絮凝剂:有机高分子,易溶,链长,活性功能基团多

?影响因素:分子量、用量、pH 、操作条件(搅拌)

(3)变性作用

(4)吸附

?加入吸附剂:活性碳除热原

?加入反应剂:相互作用形成沉淀吸附蛋白质

(5)加各种沉淀剂沉淀

2)过滤:常规和错流

3)离心:过滤式离心和沉降式离心

第四章 萃取法

1.掌握萃取与反萃取,分配系数与分配比,萃取比和萃取率,分离因素的概念。

(1)萃取:料液与萃取剂接触后,料液中的溶质向萃取剂转移的过程

(2)反萃取:将萃取液与反萃取剂(含无机酸或碱的水溶液或水)相接触,使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。

(3)分配定律:一定温度、一定压力下,某一溶质在互不相溶的两种溶剂间分配时,达到平衡后;在两相中的活度之比为一常数,如果是稀溶液,可以用浓度代替活度,即:

K 称为分配系数。

(4)在萃取过程中,溶质在两相的分子形式常常并不相同,仍然采用类似分配定律的公式作为基本公式。这时候溶质在萃取相和萃余相中的浓度,以分配比表示。

分配比(D ):两相中各种化学形式进行分配的溶质总浓度的比值

K 表示在特定的平衡条件下,被萃物在两相中的有效浓度(即分子形式一样)的比值;

D 表示实际平衡条件下被萃物在两相中总浓度(即不管分子以什么形式存在)的比值。分配比随着萃取条件变化而改变。

(5)萃取因素:也称萃取比,指被萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。通常以E 表示。 (6)萃取率:一种萃取剂对某种溶质的萃取能力(工业上用)

(7)分离因素:料液中的溶质并非是单一的组分,除了所需产物(A )外,还存在有杂质(B )。分离因素常用?表示,其定义为:在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。值越大(或越小)分离效果越好,越接近于1,分离效果越差。

2.萃取的方法有哪些?

萃取按照操作方式分类:(一)单级萃取 (二)多级错流萃取(三)多级逆流萃取

方法:溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取

3.影响溶剂萃取的因素?

(1)、乳化和破乳化

(2)、pH 的影响 表

Rn

R3R2R1Ln L3L2L1C C C C C C C K C C C D R L =++++++++==ΛΛ2

1211V V K V M V M E 表萃余相中溶质总量萃取相中溶质总量===2

(3)、温度和萃取时间的影响

(4)、盐析作用的影响

(5)、溶剂种类、用量及萃取方式的选择

4.萃取的步骤有哪些?

(1)、混合

(2)、液—液两相分离

(3)、离心萃取

(4)、溶剂回收

5.双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取基本原理及各自的优点?

(1)双水相萃取

原理:利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程。

优点:保留产物的活性、可连续化操作

(2)反胶束萃取:

原理:表面活性剂溶于非极性溶剂中,并使其浓度超过临界胶束浓度,便会在有机溶剂内形成聚集体,非极性基团在外,极性基团则排列在内,形成一个极性核,此极性核具有溶解极性物质的能力。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后,蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中,由于周围的水层和极性基团的保护,蛋白质不与有机溶剂接触,从而不会造成失活。

优点:具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都高等。

(3)超临界流体萃取

原理:利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来分离纯化的技术。

当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时,不会凝缩为液体,只是密度增大,具有许多特殊的物理化学性质:

?流体的密度接近于液体的密度,

?粘度接近于气体;

?在临界点附近,超临界流体的溶解度对温度和压力的变化非常敏感;

优点: ①具有广泛的适应性:

②萃取效率高,过程易于调节:

③分离工艺流程简单:

④有些分离过程可在接近室温下完成

缺点:分离过程必须在高压下进行,设备及工艺技术要求高,投资比较大,普及应用较为困难。

6.什么是流体,利用CO2作为超临界萃取的优点

流体是液体和气体的总称。流体是由大量的、不断地作热运动而且无固定平衡位置的分子构成的,它的基本特征是没有一定的形状和具有流动性。

利用CO2作为萃取剂主要有以下优点:

(1) 二氧化碳超临界温度(T c=31.06℃)是所有溶剂中最接近室温的,可以在35~40℃的条件下进行提取,防止热敏性物质的变质和挥发性物质的逸散。

(2)在CO2气体笼罩下进行萃取,萃取过程中不发生化学反应;又由于完全隔绝了空气中的氧,因此,萃取物不会因氧化或化学变化而变质。

(3)由于CO2无味、无臭、无毒、不可燃、价格便宜、纯度高、容易获得,使用相对安全。

(4)CO2是较容易提纯与分离的气体,因此萃取物几乎无溶剂残留,也避免了溶剂对人体的毒害和对环境的污染。

(5) CO2扩散系数大而粘度小,大大节省了萃取时间,萃取效率高。

7、破乳方法主要有哪些?

1)加表面活性剂:改变界面张力

2)离心:促进乳状液滴碰撞聚集

3)电解质:中和电荷,盐析蛋白质

4)加热:促液滴布朗运动增加,降低黏度

5)吸附:介质对油和水的吸附能力差异破乳

6)高压电:破坏双电层等

7)稀释:降低乳化剂浓度

8)其他:超滤、反应萃取、结合萃取剂和破乳剂的筛选

第五章固相析出分离

1.固相析出法主要包括盐析法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,结晶法及其它多种沉淀方法等。

2.按照一般的习惯,析出物为晶体时称为结晶法,析出物为无定形固体则称为沉淀法。

3. K S盐析法、β盐析法

右下图示:盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线,在盐析区,符合公式

log S=?-K s?

S——蛋白质溶解度,g/L;?—盐离子强度;C i——i离子浓度,mol/L;Z i——i离子化合价;

?——常数,为纵坐标上的截距;K s——盐析常数

两种类型:

(1)在一定的pH和温度下改变离子强度(盐浓度)进行盐析,称作Ks盐析法。

由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感,易产生共沉淀现象,因此常用于提取液的前处理。

(2)在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析,称作β盐析法。

由于溶质溶解度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,后期分离(结晶)。

4. 结晶包括三个过程:(1) 形成饱和溶液;(2) 晶核形成;(3) 晶体生长。

5.晶体的质量主要是指晶体的大小、形状和纯度等3个方面。

选择:

1、在一定的pH和温度下改变离子强度(盐浓度)进行盐析,称作(A )

A.K S盐析法B.β盐析法C.重复盐析法D.分部盐析法

2、盐析法与有机溶剂沉淀法比较,其优点是(B )

A.分辨率高

B.变性作用小

C.杂质易除

D.沉淀易分离

3、将配基与可溶性的载体偶联后形成载体-配基复合物,该复合物可选择性地与蛋白质结合,在一定条件下沉淀出来,此方法称为( A )

A.亲和沉淀B.聚合物沉淀C.金属离子沉淀D.盐析沉淀

4、影响晶体大小的主要因素与下列哪些因素无关( D )

A.过饱和度B.温度C.搅拌速度D.饱和度

思考题

1. 沉淀与结晶有何不同?常用的沉淀方法包括哪些?

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出,形成新相的过程。

沉淀是溶液中难溶解的固体物质从溶液中析出的过程。

?结晶法:析出物为晶体。

?沉淀法:析出物为无定形固体。

沉淀方法:(1)有机溶剂沉淀法(2)等电点沉淀(3)成盐沉淀法(4)亲和沉淀(5)高分子聚合物沉淀法(6)表面活性剂沉淀法

2 .何谓盐析?其原理是什么?常用的盐析方法有哪些?影响盐析的主要因素有哪些?盐析操作时常用的盐是什么?

(1)盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异,通过向溶液中引入一定数量的中性盐,使目的物或杂蛋白以沉淀析出,达到纯化目的的方法。

(2)原理:盐溶现象和盐析作用

盐析作用的原理是:

破坏双电层:在高盐溶液中,带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷,使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。

破坏水化层:中性盐的亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜,暴露出疏水区域,由于疏水区域的相互作用,使其沉淀。

(3)影响盐析的因素

①无机盐的种类

盐析用盐的选择:盐析作用要强

盐析用盐需有较大的溶解度

盐析用盐必须是惰性的

来源丰富、经济

②溶质(蛋白质等)种类:Ks、β

③溶质(蛋白质等)浓度:2~3%

④温度

⑤pH

(4)盐析中常用的盐:硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠。

硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂

3 . 有机溶剂沉淀法的主要原理是什么?影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些?

(1)主要原理:

①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数,使溶质分子之间的静电引力增加,聚集形成沉淀。

②水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度,压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度,降低了它的亲水性,导致脱水凝集。

以上两种因素相比较,脱水作用比静电作用强。

(2)影响沉淀效果的因素

①有机溶剂种类②pH的影响③温度④无机盐的含量

⑤某些金属离子的助沉淀作用⑥样品浓度

4. 什么是结晶?结晶过程包括哪些?在何种条件下,溶液中才有晶体析出?

(1)溶液中的溶质在一定条件下因分子有规则的排列而结合成晶体。结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出,形成新相的过程。

(2)过程:①形成过饱和溶液;②晶核形成;③晶体生长

(3)溶质只有在过饱和溶液中才能析出

条件:

推动力:形成新相(固体)需要一定的表面自由能。因此,溶液浓度达到饱和溶解度时,晶体尚不能析出,只有当溶质浓度超过饱和溶解度后,才可能有晶体析出。

晶核:最先析出的微小颗粒是以后晶体的中心,称为晶核。

首先形成晶核,由Kelvin公式,微小的晶核具有较大的溶解度。实质上,在饱和溶液

中,晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中,只有达到一定的过饱和度

以后,晶核才能够稳定存在。

5. 提高晶体质量的途径

晶体质量包括三个方面的内容:晶体大小、形状和纯度

(1)晶体大小

1)过饱和度

过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区内,又保持较高的晶体生长速率,使结晶高产而优质。

2)温度(缓慢冷却)

3)搅拌速度:适当,不宜太快

4)晶种:诱导结晶,控制晶体形状大小均匀度

(2)晶体形状

?控制晶体生长速度和结晶温度

?控制过饱和度

?选择不同的溶剂

?调节溶液的pH

?有目的地加入某种能改变晶形的杂质

(3)晶体纯度

杂质对晶体的成长速率的影响较为复杂,有的杂质能抑制晶体的成长,有的能促进成长,有的能改变晶型。

?过滤分离母液中的杂质

?晶体越细小,杂质越多

?洗涤有利提高纯度

?结晶速度过快,易产生“晶蔟”,包含杂质

(4)晶体结块

原因:粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长

措施:控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存

(5)重结晶:晶体用合适溶剂溶解后再次结晶,提高纯度

第六章吸附分离法

1、吸附剂按其化学结构可分为两大类:一类是有机吸附剂,如活性炭、淀粉、大孔吸附树脂等;另一类是无机吸附剂,如白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。

2、常用的吸附剂有活性炭、硅胶和白陶土等。

3、大孔网状聚合物吸附剂按骨架的极性强弱,可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。

选择:

?1、用大网格高聚物吸附剂吸附的弱酸性物质,一般用下列哪种溶液洗脱(D )

?A.水 B.高盐 C.低pH D. 高pH

?2、“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质( B )

?A.极性溶剂 B.非极性溶剂 C.水 D.溶剂

?3、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强?(A)

?A.水 B.甲醇 C.乙醇 D.三氯甲烷

?4、关于大孔树脂洗脱条件的说法,错误的是:(A)

?A .最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。

?B. 对弱酸性物质可用碱来解吸。

?C. 对弱碱性物质可用酸来解吸。

?D.如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时,则常常仅用水洗就能解吸下来。

问答:

1、吸附原理

吸附作用:界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力,界面分子的力场不饱和,即存在一种固体的表面力,能从外界吸附分子、原子或离子,并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。

2、大网格吸附剂及其吸附的特点

大孔网状吸附剂(大网格吸附剂):在树脂聚合时加入惰性的致孔剂,待网格骨架固化和链结构单元形成后,用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉,形成不受外界环境条件影响的孔隙,其孔径远大于2~4nm,可达100nm,故称“大孔”。

特点:

①选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度好、可反复使用等优点。

②其孔隙大小、骨架结构和极性,可按照需要,根据不同的原料和合成条件而改变,因此可③适用于吸附各种有机化合物。

④适合弱电解质及非离子型化合物分离。

3、大网格吸附剂吸附的操作过程

⑴树脂选择⑵吸附条件选择⑶洗脱条件选择

预处理、上样、吸附、洗杂、洗脱、再生

第七章凝胶层析

?1、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度,其越小,凝胶孔径越大;而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。

?2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大,其分离范围随着凝胶浓度上升而

下降,颗粒强度随浓度上升而提高。

选择:

?1、凝胶层析中,有时溶质的Kd>1,其原因是(B )

?A.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低

?2、凝胶层析中,有时小分子溶质的Kd<1,其原因是(A )

?A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低

?3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是(A )

?A.分子量最大的 B.体积最大的 C.分子量最小的 D.体积最小的

?4、为了进一步检查凝胶柱的质量,通常用一种大分子的有色物质溶液过柱,常见的检查物质为蓝色葡聚糖,下面不属于它的作用的是( C )

?A.观察柱床有无沟流 B.观察色带是否平整

?C.测量流速 D.测量层析柱的外水体积

思考题

1.凝胶层析的原理及特点。

凝胶层析原理:是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相,由于各组分流经体积的差异,使不同分子量的组分得以分离的层析方法。

特点:(1)凝胶层析操作简便、设备简单(仅需一根层析柱) 。

(2)分离效果较好,重复性高,样品回收率高,接近100%。

(3)分离条件缓和。

(4)应用广泛。

(5)分辨率不高,分离操作较慢。

2.柱床体积、内水体积、外水体积、基质体积、洗脱体积、分配系数、全渗入、全排阻

⑴柱体积(V A) :柱体积是指凝胶装柱后,从柱的底板到凝胶沉积表面的体积,又称“床”体积(V A)。

⑵外水体积(Vo):色谱柱内凝胶颗粒间隙,这部分体积称外水体积,亦称间隙体积,常用V0表示。

⑶内水体积(V i):因凝胶为三维网状结构,颗粒内部仍有空间,液体可进入颗粒内部,水的总和为内水体积,又称定相体积,常用表示。不包括基质的体积(Vg)。

V A=V0+V i+V g

V柱内空间=V o+V i

柱床体积V A可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处,然后测量水的体积来测定。

V A = 1/4 D2h计算

外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定,一般常用蓝色葡聚糖

-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大(为200万),在各种型号的凝胶中都被排阻,并且它呈蓝色,易于观察和检测。

⑷峰洗脱体积(淋出体积Ve):是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积,常用Ve表示。V e=V0+V i ,ace V i,ace是V i的一部分,它与V i之比成为K d(分配系数)V e=V0+V i K d

(5)(排阻系数)分配系数K d

?当K d=1时,洗脱体积V e=V0+V i,为全渗入。

?当K d=0时,洗脱体积V e=V0,为全排阻。

?0<K d<1时,洗脱体积V e=V o+K d V i,为部分渗入。

因此分子的正常Kd值0~1之间,这种由小到大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。

3.了解葡聚糖凝胶、生物凝胶、琼脂糖凝胶的结构及特点

⑴葡聚糖凝胶(Sephadex)

①结构

商品名为Sephadex G类。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1,2-环氧丙烷为交联剂,形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。

②性质:稳定性。存在非特异性吸附

⑵聚丙烯酰胺凝胶(生物凝胶)

①结构:商品名为生物凝胶-P(Bio-Gel P)。该凝胶由丙烯酰胺组成;以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,聚合而成。

②聚丙烯酰胺凝胶的性质:

1)孔径大小(可通过交联度调整);

2)稳定性、强度;

3)无非特异吸附,保存方便;

4)生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-Gel P-100。

⑶琼脂糖凝胶

①结构:是由β-D-半乳糖与3,6-脱水-L-半乳糖以α-1,3-和β-1,4-糖苷键相间连接而成的链状分子。

②特点Α、没有共价键的交联。

Β、孔径琼脂糖的浓度。

C、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。

D、颗粒强度差。

E、非特异性吸附力低。

F、分离范围大。

4.什么是“类分离”和“分级分离”?

(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开,如蛋白质与盐类,称作类分离。

(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离,如分离血清球蛋白与白蛋白,这叫做分级分离。

5.在实验中应如何选择凝胶与预处理?

(1)凝胶的选择:

一方面要考虑凝胶的性质,包括凝胶的分离分子量范围(渗入限和排阻限),理化稳定性,强度、非特异性吸附性质等;另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。

①选择作类分离的凝胶是,应使样品中大分子的分配系数K d=0,小分子的K d=1。

②选择作分级分离的凝胶型号时必须使各种物质的K d值尽可能相差大。要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧,或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分,最好一个接近全排阻,另一个接近全渗入,第三个为部分渗入,且分子量大于渗入限的3倍,并小于排阻限的1/3。

(2)凝胶粒度的选择:

?细粒凝胶柱流速低,洗脱峰窄,分辨率高,用于精制分离或分析。

?粗粒凝胶柱流速高,洗脱峰平坦,分辨率低,用于粗制分离,脱盐。

此外,凝胶颗粒必须均匀,颗粒越小更好。

(3)预处理:

?凝胶在使用前须溶涨,使干胶颗粒充分吸收溶剂,并达到平衡。

?干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。

?热法溶涨(水浴)。

6.凝胶用过后,有那几种保存方法?

葡聚糖凝胶有3种,干法、湿法和半缩法

1)湿法:加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存。

2)干法:用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶,脱水收缩,抽滤,用60~80℃吹干。

3)半缩法:60-70%乙醇使凝胶部分脱水收缩,封口,4℃保存。

琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥,否则不能再溶胀恢复原有形状,因此商品在都以含水状态供应,并应在湿态保存。一般悬浮在103mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。避免硼酸缓冲液

7.凝胶层析的操作步骤?

(1)样品和加样

蛋白质类样品浓度:不大于4%。样品粘度小于0.01Pas;样品浑浊应先过滤除颗粒后上柱

(2)洗脱与收集

1).洗脱剂:常采用缓冲盐溶液进行洗脱;洗脱液的成分也不应改变,以防凝胶涨缩引起柱床体积变化或流速改变。

2)流速(操作压、型号、粒度)。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压;编号小,颗粒粗---流速大;与操作压成正比,柱长成反比。

3)部分收集器。

(3)凝胶柱的再生

板结、不溶物污染、严重吸附;反冲。重新装柱。

8.细粒凝胶柱流速慢,洗脱峰越窄,分辨率高,适用于什么产品的分离或分析?粗粒凝胶柱流速高,但洗脱峰平坦,分辨率低,适用于产品制备那个阶段的分离?

(1)用于精制分离或分析(2)用于粗制分离,脱盐

9.凝胶层析的应用范围有哪几方面?

⑴脱盐和浓缩

⑵分子量测定

⑶凝胶在生化制药中的应用包括:去热原和分离纯化

10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意哪些问题和采取那些措施?

注意有没有色谱峰变宽。措施:减少峰宽效应,选择合适溶剂,填料均匀,填料粒度一致,降低流速,适当增加柱长,增加分辨率里两个峰的峰间距离。

凝胶过滤层析经常遇见的问题:

1)流速慢

(1)有气泡、出水管阻塞

(2)没打开夹子

(3)柱压太紧(操作压过大、长期使用)

2)柱内产生气泡

(1)上水口不流或皮管破裂,洗脱液外流

(2)接口漏气,如上水口螺丝拧的不紧

3)条带扭曲

(1)胶面不平(2)样品或洗脱液中有颗粒(3)装柱不均匀

4)分辩率不高

(1)装拄不均匀(2)样品量过大(3)流速太快(4)柱不垂直或柱不合适

(5)长菌(6)柱下口软管太长(7)胶不适当

11.根据凝胶层析分离大分子物质的原理,分子质量为2万,6万和10万的蛋白质可选择哪种规格型号的Sephadex G凝胶将三者分开?洗脱后顺序如何?为什么?

选择:Sephadex G-75

洗脱顺序是10万>6万>2万

因为分子量较小的分子可以占据较多的孔体积,而大分子占有的孔体积较小,小分子在柱中停留时间比大分子长,于是样品各组分按分子大小顺序而分开,最先洗脱出来的是最大的分子。若要脱盐的就选择Sephadex G-25

第八章离子交换法

1、离子交换剂由载体、功能基团和平衡离子组成。平衡离子带正电荷为阳离子交换树脂,平衡离子带负电荷称阴离子交换树脂。

2、写出下列离子交换剂类型:732 强酸001x7树脂(强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂),724 弱酸101x4树脂(阳离子型),

717强碱201x7树脂(强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂),

CM-C 羧甲基纤维素(弱酸性阳离子交换纤维素),

DEAE-C 二乙基氨基乙基纤维素(强碱型阴离子交换纤维素),

PBE94 多缓冲交换剂(碱性阴离子交换剂)。

3、色谱聚焦(chromatofocusing)是一种高分辨的新型的蛋白质纯化技术。它是根据蛋白质的等电点,结合离子交换技术的大容量色谱,能分离几百毫克蛋白质样品,洗脱峰被聚焦效应浓缩,分辨率很高,操作简单。

4、在采用多缓冲阴离子交换剂作固定相的离子交换聚焦色谱过程中,当柱中某位点之pH值下降到蛋白质组分PI 值以下时,它因带正电荷而下移,如果柱中有两种蛋白组分,pI 值较大者会超过另一组分,移动至柱下部pH较高的位点进行聚焦。

思考题:

1.离子交换层析的原理

利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离。

2.离子交换树脂的分类

分类:平衡离子带正电荷:阳离子交换树脂

平衡离子带负电荷:阴离子交换树脂

具体分为:阳离子交换树脂分类:强酸型树脂、中酸性树脂、弱酸性树脂

阴离子交换树脂分类:强碱型阴离子交换树脂、

弱碱型阴离子交换树脂、

中强碱性阴离子交换树脂

3、离子交换树脂的预处理和再生办法

树脂的预处理

?(1)物理处理:去杂,过筛。

?(2)化学处理:用8~10倍的1mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡。

?(3)最后以去离子水或缓冲夜平衡

再生过程:

?(1)?去杂,大量水冲洗,除去物理吸附的杂质。

?(2)?用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质。

?(3) 转型:按要求的人为的赋予平衡离子的过程

4、多糖基离子交换剂主要分为哪两类

?离子交换纤维素

?葡聚糖凝胶离子交换剂

5、CM-sephadex C-25(羧甲基纤维素);C—阳离子

功能基团是:羧甲基;载体是:葡聚糖凝胶;型号是:G-25;类型:弱酸型阳离子交换剂DEAE-sephadex A-25(二乙胺基乙基纤维素);A—阴离子

功能基团是:二乙基氨基乙基纤维素;载体是:葡聚糖凝胶;型号:G-25;

类型:强碱型阴离子交换剂

7、离子交换法有哪些方面的应用

?分离纯化——氨基酸制备

?无盐水制备

8、色谱聚焦的原理

?自动形成pH梯度。

?蛋白质的色谱行为

?聚焦效应

9、K值为离子交换常数,K>1说明树脂对交换离子吸引力较大

10、由下图,利用给出的两种离子交换剂(E1,E2)分离3种蛋白质(P1、P2、P3),用箭头流程图表示(并指出E1,E2的类型)。

E1弱酸型阳离子交换剂E2为强碱阴离子交换剂

11、请以CM-C为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些?并说出各种方法的洗脱原理。

升高环境的pH、降低pH或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来。

H2N-P表示蛋白质 C表示离子纤维素

第九章亲和纯化技术

?1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱,特殊洗脱,专一性洗脱。

?2、亲和力大小除由亲和对本身的解离常数(亲和势K L )决定外,还受许多因素的影响,其中包括微环境、空间位阻、配基浓度、载体孔径、结合位点等。

?3、亲和层析中常用作分离酶的配基有底物的类似物,抑制剂,辅酶和底物。

?4、亲和层析中非专一性吸附有离子效应、疏水作用、复合亲和力。

?5、亲和过滤指的是将亲和层析和膜过滤结合运用,它包括亲和错流过滤

和亲和膜分离两大方法。

选择题:

?1、制备亲和柱时,应首先选用的配基是(A )?A.大分子的 B.小分子的 C.中等大小的 D.不确定

?2、亲和层析的洗脱过程中,在流动相中加入配基的洗脱方法称作(C )?A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 竞争洗脱 D. 非竞争洗脱

?3、亲和层析的洗脱过程中,在流动相中减去配基的洗脱方法称作(D )?A. 阴性洗脱 B. 剧烈洗脱 C. 正洗脱 D. 负洗脱

三、名词解释

1、亲和反胶团萃取

指在反胶团相中除通常的表面活性剂以外,添加另一种亲水头部为亲和配基的助表面活性剂;通过亲和配基与目标分子的亲和结合作用,促进目标产物在反胶团相的分配。

2、亲和膜:

亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质,是固定床亲和层析的变型。

3、二次作用亲和沉淀

亲和介质结合目标分子后,通过改变物理场使介质与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。

4、亲和萃取:

利用偶联亲和配基的PEG为成相聚合物进行的双水相萃取,在亲和配基的亲和结合作用下促进目标产物在PEG相(上相)的分配,提高目标产物的分配系数和选择性。

5、亲和吸附剂:

被固定在基质上的分子称为配体,配体和基质是共价结合的,构成亲和层析的固定相,称为亲和吸附剂。

6、负洗脱:S(固定化配基),E(酶),I(游离配基)

也叫反竞争性效应:ESI>EI稳定性,I使ES结合紧,I ,E洗脱出来。

7、亲和层析:利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。

8、亲和膜分离:用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质亲和纯化目标蛋白质的方法。

9、金属离子亲和层析:利用金属离子的络合或形成螯合物的能力吸附蛋白质的分离系统。

四、回答问题:

1、亲和层析的原理是什么?主要特点是什么?

原理:(1)配基固定化:配基与载体偶联,结合成具有特异亲和性的分离介质。

(2)吸附样品:亲和层析介质选择性吸附生物活性物质.

(3)样品解吸:选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。

特点:经过一次处理可得到高纯度活性物质;

设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度快、分离效果好、分离条件温和;

亲和吸附剂通用性较差,专用的吸附剂。

2、对亲和层析的公式进行说明。设K L=10-7,求[L0]

(1)对亲和层析公式的说明如下:

式中,E——被分离的酶,L——配基,EL——复合物,K L——为EL复合物的解离常数

根据化学反应平衡方程式:

式中,Eo和Lo——分别为原始的酶浓度和配基浓度,当Lo>>Eo时,Lo-[EL] ≈Lo,则

在亲和层析中,定义分配比k为:

一般柱层析公式为:

式中,Ve——蛋白质洗脱体积;Vo——凝胶载体外水体积。由此可导出亲和势与洗脱体积的关

系式:

(2)求[L0]:

因为K L=10-7,所以≥10,→[L0]

3、何谓“手臂”?其长短与亲和层析效果有何联系?为什么?

“手臂”就是用来消除空间障碍插在载体和配基间的基团。

手臂的长度是有限的,不可太短也不可太短也不可太长,太短不能起消除空间障碍的作用,太长往往会使非特异性吸附增加。

4、什么是拟生物亲和层析?其中多肽配基有何优点?

(1)拟生物亲和层析是利用部分分子相互作用,模拟生物分子结构或某些特定部位,以人工合成的配基为固定相吸附分离目的蛋白质的亲和层析。

(2)多肽配基的优点:只含有一些氨基酸,即使脱落也不会产生免疫反应;与抗体配基相比,稳定性好;成本低;与金属和染料配基相比,特异性较高,且通常无毒;可采用温和的洗脱条件避免了蛋白质的变性失活,收率高

第十章离心分离技术

?离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力,加速固体沉降速度的一种分离方式。

?差分离心法:差分离心法亦称为“差速离心法”,是依据不同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不同进行离心分离的一项技术。

?速度区带离心法:又称速率区带离心法或分级区带离心法。它是将样品放在一个连续的密度梯度液体上,通过离心,大颗粒沉降快,小颗粒沉降慢。经过一段时间,相同的颗粒就在同一深度。形成一条带子,因此把各种组份分开来。

?等密度区带离心法:离心力作用下,不同密度的多组分颗粒在梯度介质中“向上”或“向下”移动,当移动至其密度与介质密度相等的位置便不再移动,形成静止区带,即达到离心平衡,各组分按密度不同处于区带的不同位置。该离心方法称等密度离心法。

第十一章膜分离技术

1、克服浓差极化现象的措施有振动、搅拌、错流、切流。

1、透析是膜分离技术的一种,通常利用透析技术进行( B )

A 脱脂

B 脱盐

C 除菌

D 除热源

2 在超滤过程中,主要的推动力是(C)

A. 浓度差

B. 电势差

C. 压力

D. 重力

1.不对称膜、超滤、浓差极化现象

(1)不对称膜指膜的化学结构或物理结构随膜的部位而异,即各向异性的膜。

(2)超过滤(简称超滤)是一项分子级膜分离手段,以压力差为推动力将不同分子量的物质进行选择性分离。一般用于液相分离,也可用于气相分离。

(3)外源压力迫使分子量较小的溶质通过薄膜,大分子被截留于膜表面,并逐渐形成浓度梯度,这就是浓差极化现象。

2.简述膜分离的优点

①高效:由于膜具有选择性,它能有选择性地透过某些物质,而阻挡另一些物质的透过。选择合适的膜,可以有效地进行物质的分离,提纯和浓缩。

②节能:多数膜分离过程在常温下操作,被分离物质不发生相变, 是一种低能耗,低成本的单元操作。

③过程简单、容易操作和控制。

④不污染环境。

3.用于制作透析膜的材料所应具有的特点

(1)在溶剂中能形成分子筛状多孔薄膜,只允许小分子溶质通过,而阻止大分子(如蛋白质)通过;

(2)化学惰性;在水、盐溶液、稀酸或稀碱溶液中稳定;

(3)良好的物理性能:有一定的机械强度和良好的再生性能

4.透析过程中应注意哪些事项?

(1)透析袋预处理:用50%乙醇慢慢煮沸一小时,再分别用50%乙醇、0.01mol/L碳酸氢纳溶液、0.001 mol/L EDTA 溶液依次洗涤,最后用蒸馏水洗涤三次;

(2)透析前,对装有试液的透析袋检查是否有泄漏;

(3)透析袋装一半左右,防止膜外溶剂因浓度差渗入将袋涨裂或过度膨胀使膜孔径改变;(4)袋要扎紧以防流失。

(5)热敏性物质应置4℃冰箱透析以防变性。

(6)搅拌;定期或连续更换外部溶剂可提高透析效果。

(7)透析袋的保存:短时间,储存于4℃蒸馏水中,长时间,洗净后置于甘油中(防菌)

5.影响超滤流速和选择性的因素有哪些?

?溶质分子性质:大小、形状和带电性质。

?超滤膜的性质:孔径、结构、吸附性。

?超滤装置和操作:膜或组合膜的构造、超滤器的结构以及操作压力、搅拌情况.

?液体物料的温度、粘度、pH、离子强度。

作业题

总结归纳本课程介绍的可用于物质分离纯化的方法,并说出每种方法的原理。

固液分离技术

?过滤、离心

萃取

?溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取

固相析出分离法

?盐析法、有机溶剂沉淀法、结晶法、等电点沉淀法

层析技术

?吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、离子交换色谱聚焦、亲和层析

膜过滤

?透析、超滤、微滤

作业题

比较吸附层析、凝胶层析、离子交换层析、离子交换色谱聚焦、亲和层析五种层析技术并填写下表

生物制药工艺学

三、名词解释 1. 生物制品(Biological Products)生物制品是以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料,应用传统技术或现代生物技术制成,用于人类疾病的预防、治疗和诊断。人用生物制品包括:细菌类疫苗(含类毒素) 、病毒类疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶体内以及体外诊断制品,以及其他生物活性制剂,如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等。 2. 分叉中间体在微生物代谢过程中,一些中间代谢产物既可以被微生物用来合成初级代谢产物,也可以被用来合成次级代谢产物,这样的中间体被称为分叉中间体。 3. 热阻和相对热阻热阻是指微生物在某一种特定条件下(温度和加热方式)的致死时间。 相对热阻是指某一种微生物在某一条件下的致死时间与另一种微生物在相同条件下的致死时间之比。 4. 种子(广义和狭义)广义种子: 从菌种开始,到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义种子:种子罐中的种子。 5. 摄氧率单位体积发酵液每小时消耗氧的量。 6. 呼吸强度单位重量的菌体(折干)每小时消耗氧的量。 7. 呼吸临界氧浓在溶氧浓度低时,呼吸强度随溶氧浓度增加而增加,当溶氧浓度达到某一值后,呼吸强度不再随溶氧浓度的增加而变化,此时的溶氧度称为呼吸临界氧浓度。影响因素:微生物的种类、培养温度以及生长阶段。 8. 凝聚价或凝聚值电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值表示,定义为使胶粒产生凝聚作用的最小电解质浓度。化合价越高,凝聚能力越强。凝聚能力:Al3+>Fe 3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+ >Na+>Li+ 常用的凝聚剂:Al 2(SO 4 ) 3 ·18H 2 O、AlCl 3 ·6H 2 O、FeCl 3 、ZnSO 4 、MgCO 3 等 9. 凝聚作用在某些电解质作用下,使扩散双电层的排列电位降低,破坏胶体系统的分散状态,而使之凝聚的过程。影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类、化合价以及无机盐的用量。 10. 絮凝作用某些高分子絮凝剂存在下,在悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程。 11. 多级错流萃取料液经萃取后的萃余液再用新鲜萃取剂进行萃取的方法。 12. 多级逆流萃取在第一级中加入料液,萃余液顺序作为后一级的料液,而在最后一级加入萃取剂,萃取液顺序作为前一级的萃取剂。 13. 超临界流体抗溶剂法(Supercritical Fluid Anti-solvent,SAS)先用有机溶剂溶解溶质,再加入超临界流体作抗溶剂,使溶质的溶解度大大下降,溶质从溶液中结晶析出。 14. 超临界溶液快速膨胀法(Rapid Expansion of Supercritical Solution, RESS)是利用高密度的超临界流体溶解固体溶质,通过喷嘴快速泄压至1个大气压的低密度气体,溶质的溶解度急剧减小至万分之一以下,造成固体溶质结晶析出。 15. 道南电位由于带电荷粒子在不同相间的分布不同而产生的相间电位差即为道南电位。 16. 吸附等温线当固体吸附剂从溶液中吸附溶质达到平衡时,其吸附量与溶液浓度和温度有关。当温度一定时,吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。 17. 批一次性投入料液,不补料,直到放罐。(或许) 18. 浓差极化当溶剂透过膜而溶质留在膜上时,它使得膜面上溶质浓度增大而高于主体中溶质浓度,这种现象称为浓差极化。为避免浓差极化现象,通常采用错流过滤。 19. 亲和色谱(Affinity Chromatography)具有很高的选择和分离性能以及较大的载量,纯化倍数高,并能保持较高的活性。 20. 疏水相互作用色谱(Hydrophobic Interaction Chromatography)利用蛋白质表面存有的疏水性部位,与带有疏水性配基的载体在高盐浓度时结合,洗脱时将盐浓度逐渐降低,蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而分离。该法中蛋白质与固定相结合力较弱,利于保持活性。 21. 膨胀床色谱传统色谱的最大缺点是不能处理含固体颗粒的料液。色谱吸附剂直接与原料液在搅拌罐中混合来吸附目标产物或流化床吸附。膨胀床色谱操作过程:被处理的料液从膨胀床底部泵入,床内的吸附剂将不同程度地向上膨胀,料液中的固体颗粒可以顺利地通过床层,目标产物在膨胀床内可被吸附剂吸附,从而可达到从料液中吸附和初步纯化目标化合物的目的。原理:吸附介质颗粒在向上流动液体的作用下膨胀起来,液体中的目

生物制药工艺学实验

生物制药工艺学实验指导 (12个实验,36学时) 焦飞 生物技术教研室

实验一健胃消食片配方及片剂的制备 一、实验目的 1.掌握压片机压片的方法及影响片剂成型的主要因素; 2.学会片剂处方的调配。 二、实验材料和仪器 太子参,陈皮,山药,麦芽(炒),山楂,蔗糖粉,糊精,硬脂 酸镁,粉碎机,干燥箱,制片机 三、实验原理 健胃消食片为内科伤食类非处方药品,主治健胃消食,用于 脾胃虚弱,消化不良,脾胃虚弱所致的食积,症见不思饮食,暖 腐酸臭,脘腹胀痛。健胃消食片的配方如下,太子参228.6g,陈皮22.9g,山药171.4g,麦芽(炒)171.4g,山楂114.3g,蔗糖糊精适量,值得片剂为淡棕黄色的片或薄薄膜片,气略香,味微甜,酸。制作方法:太子参半量与山药粉碎成细粉,其余陈皮三味药 及剩余的太子参置于烧杯,加3倍量水,煎煮1小时,滤过,合并两次煎液,减压浓缩至浸膏,干燥。将蔗糖粉糊精和生药粉以 3:1:1的混合粉与浸膏混合制成软材,软材的软硬应适当,以“手握成团,轻压则散”为宜。采用挤出制粒的方法制成颗粒, 颗粒在60-80摄氏度干燥,干燥时应逐渐升温,以免因颗粒表面 干燥过快结成硬壳而影响内部水分的蒸发。颗粒整粒后加入1%硬脂酸镁混合后压片。 四、实验步骤

1.称取太子参2 2.8g,陈皮 2.3g,山药17.1g,山药17.1g,麦芽 17.1g,山楂11.4g 2.太子参山药用粉碎机粉成细粉。 3.将上述药材放入烧杯中,加入3倍量的水,煎煮半小时,重复 两次,将上清液合并,减压浓缩至浸膏,将所得浸膏放入烘 箱中80度干燥。 4.将蔗糖粉糊精和干燥后的粉末以3:1:1的比例混合制成颗粒 软材,将软材放入烘箱中逐渐升温干燥。 5.干燥后的软材加入1%硬脂酸镁放入压片机中压片。 实验二溶菌酶结晶的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法提取蛋白质的原理和过程; 2.学会溶菌酶的结晶和精制方法。 二、实验材料与仪器 新鲜鸡蛋,氯化钠, 1 氢氧化钠溶液,醋酸缓冲液,烧杯,玻璃棒,布氏漏斗,干燥箱。 三、实验原理 溶菌酶又称细胞壁质酶或N—乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种国内外很紧销的生化物质,广泛应用于医学临床。具有多种药理作用,能抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等,有抗菌 的作用,常用于五官科多种粘膜炎症,皮肤带状疮疹等疾病。是

现代生物制药工艺学

第一章绪论 1、生物药物(biopharmaceuticals)利用生物体、生物组织或其成分(初级代谢和次级代谢产物),综合应用多门 学科的原理和方法进行加工、制造而成的一大类药物。 2、生物药物的特性1)药理学特性:在化学构成上十分接近于体内的正常生理物质,容易为机体吸收利用。(1) 治疗的针对性强、药理活性高、疗效高细胞色素c用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病(2)毒副作用小、营养价值高注射用的纯ATP可以直接供给机体能量;蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物药物本身就直接取自体内(3)生理副作用时有发生(缺点)生物体之间的种属差异或同种生物体之间的个体差异都很大,所以用药时会发生免疫反应和过敏反应。2)原料的生物学特性(1)原料中的有效物质含量低,杂质多激素、酶在体内含量极低。(尿激酶)(2)原料的多样性(来源多样性)(3)易腐败(缺点)生物药物营养价值高,易染菌、腐败。生产过程中应低温、无菌。(4)注射用药有特殊要求生物药物易被肠道中的酶所分解,所以多采用注射给药,注射药比口服药要求更严格(均一性、安全性、稳定性、有效性)(理化性质、检验方法、第二章生物药物的质量管理与控制 1、生物药物质量检验的程序与方法 基本程序:取样→鉴别→检查→含量测定→写出检验报告 1)取样:均匀、合理、有代表性。 2)药物的鉴别试验:化学反应法、紫外分光光度法、色谱法、酶法、电泳法等。 3)药物的杂质检查:分为一般杂质(如酸、碱、水分、氯化物、硫酸盐、砷盐、重金属)和特殊杂质;检查方法:对照法、灵敏度法、比较法。 4)药物的安全性检查(安全性):热源检查、药物的降压物质检查 5)药物含量(效价)测定(有效性): ? 含量表示方法:有效物质的百分数表示,此百分数均系指重量百分数 ? 生物效价或者酶活力单位(对照或标准比对) ? 另外对于制剂,含量(效价)的限度一般用含量占标示量的百分率来表示 6)检验报告的书写 2、中华人民共和国药典 根据药物自身的理化与生物学特性,按照批准的处方来源、生产工艺、贮藏运输条件等所制定的、用以检测药品质量是否达到用药要求并衡量其质量是否稳定均一的技术规定。 3、1)药品生产质量管理规范(GMP) ? GMP是Good Manufacturing Practice,即药品生产质量管理规范。 ? 对药物的生产实行全面管理,是全员全过程的管理。 ?GMP的三大要素:人为产生的错误减小到最低;防止对医药品的污染和低质量医药品的产生;保证产品高质量的系统设计。 2)药品安全试验规范(GLP) ? GLP:Good Laboratory Practice,即药品安全试验规范;非临床研究质量管理规范 ? 主要内容是在规定试验条件下,进行药效、毒性动物试验的准则:对急性,亚急性,慢性毒性试验,生殖试验,致癌,致畸,致突变以及其它毒性试验等临床前安全试验作出规定,是保证药品安全有效的法规 ? 目的:实验研究的质量可靠;实验数据的可信 3)药物临床试验管理规范(GCP) ? GCP:Good Clinical Practice,药物临床试验管理规范 ? 药品临床试验是指在任何人体(健康的志愿者或病人)进行的药品系统性研究,以证实或揭示试验用药品的作用及不良反应等 ? 目的:保证临床试验过程规范,结果科学可靠;保证受试者的权益并保障其安全。 4、加速试验:对药物短时间内施加强应力,促使药物加速反应,按照一定的方法推测其有效期。低温观测法、恒 温法和变温法 第二章抗生素概述 1、抗生素定义: 生物细胞产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质。 1)药理活性物质:作用于动植物体本身的生理功能(如免λ疫调节、降血脂、降血糖、降血压、抗炎、减肥、动植物生长促进、植物生长抑制等) 2)抗生素:作用于动植物体内的寄生(或赘生)生物(细λ菌、真菌、病毒、癌细胞等)瓦克斯曼创造了新

生物制药工艺学思考题和答案解析

抗生素发酵生产工艺 1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义? 青霉素是发现最早,最卓越的一种B-内酰胺类抗生素,它是抗生素工业的首要产品,青霉素是各种半合成抗生素的原料。青霉素的缺点是对酸不稳定,不能口服,排泄快,对革兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后,形成头孢菌素母核,成为半合成头孢菌素的原料。2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制? 青霉素在深层培养条件下,经历7个不同的时期,每个时期有其菌体形态特性,在规定时间取样,通过显镜检查这些形态变化,用于工程控制。 第一期:分生孢子萌发,形成芽管,原生质未分化,具有小泡。 第二期:菌丝繁殖,原生质体具有嗜碱性,类脂肪小颗粒。 第三期:形成脂肪包含体,积累储蓄物,没有空洞,嗜碱性很强。 第四期:脂肪包含体形成小滴并减少,中小空泡,原生质体嗜碱性减弱,开始产生抗生素。 第五期:形成大空泡,有中性染色大颗粒,菌丝呈桶状。脂肪包含体消失,青霉素产量提高。 第六期:出现个别自溶细胞,细胞内无颗粒,仍然桶状,释放游离氨,pH上升。 第七期:菌丝完全自溶,仅有空细胞壁。一到四期为菌丝生长期,三期的菌体适宜为种子。 四到五期为生产期,生产能力最强,通过工艺措施,延长此期,获得高产。在第六期到来之前发束发酵。 3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么? 控制原理:发酵过程需连续流加葡萄糖,硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐,补糖率是最关键的控制指标,不同时期分段控制。在青霉素的生产中,及时调节各个因素减少对产量的影响,如培养基,补充碳源,氮源,无机盐流加控制,添加前体等;控制适宜的温度和ph,菌体浓度。最后要注意消沫,影响呼吸代谢。 4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作? 青霉素不稳定,发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速,防止降解。提炼工艺包括如下单元操作: ①预处理与过滤:在于浓缩青霉素,除去大部分杂质,改变发酵液的流变学特征,便于后续的分离纯化过程。 ②萃取:其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂,而青霉素易溶于水。 ③脱色:萃取液中添加活性炭,除去色素,热源,过滤,除去活性炭。 ④结晶:青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小,在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙醇溶液,青霉素钾盐可直接结晶析出。 氨基酸发酵工艺 1. 如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控? 发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源,补充NH4+;生物素适量控制在2-5μg/L;pH 控制在中性或微碱性;供氧充足;磷酸盐适量。 2. 氨基酸生产菌有什么特性,为什么? L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、小短杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性:①细胞形态为短杆至棒状;②无鞭毛,不运动;③不形成芽孢;④革兰氏阳性;⑤生物素缺陷型;⑥三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变;⑦在通气培养条件下产生大量L-谷氨酸。 3. 生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么?

生物制药工艺学_吴晓英_思考题

生物制药工艺学思考题 总论部分: 一、简述生物制药工艺学的性质与任务。 二、谈谈生物制药工业的重点研究方向。 三、谈谈生物药物的特点。 四、简述生物药物的研究发展趋势。 五、简述生物材料的来源。 六、简述生物活性物质的存在特点。 七、生物活性物质主要有哪些提取方法?举例说明萃取技术的应用 八、生物活性物质有哪些主要的浓缩、干燥方法? 九、生物大分子分离纯化的主要原理。 十、生物大分子常用的纯度鉴定方法有哪些? 十一、已经上市或研究热点的基因工程药物主要有哪些? 十二、简述酶工程技术、细胞工程技术和基因工程技术等现代生物技术在生物制药工业中的应用。 十三、名词解释: 提取,萃取,浓缩,干燥,均一性,上游工艺,下游工艺, 单克隆抗体,PCR,生物合成技术,半合成药物 抗生素部分: 一、抗生素的定义、常用分类法、应用。 二、评价医用抗生素应包括哪些主要要求。 三、抗生素工业生产的主要方法,抗生素发酵生产的特点。 四、简述抗生素发酵中温度、pH、溶氧、基质浓度、菌体浓度、二氧化碳和泡沫等因素的影响及控制。 五、发酵生产庆大霉素的工艺路线及注意问题。 手性药物部分: 一、什么是手性?什么是手性药物? 二、手性药物的主要制备技术? 三、用于制备手性药物的主要的生物催化反应包括哪些? 多肽类和蛋白类药物: 一、了解多肽药物的分类与重要的多肽类药物(包括名称,来源,作用与用途)。 二、了解胸腺素组分5的性质和工艺路线。 三、了解蛋白类药物的分类与重要的蛋白类药物(包括名称,来源,作用与用途)。 四、了解白蛋白的制备工艺要点。 五、了解胰岛素的结构与性质、作用与用途、提取法制备胰岛素的生产工艺要点、以及基因工程技术生产人胰岛素的途径。 酶类药物: 一、酶类药物的分类与重要的酶类药物的名称、来源、作用与用途及对酶类药物的要求。 二、了解L-天门冬酰胺酶和超氧化物歧化酶的性质、作用、工艺路线和工艺要点。

中医药大学生物制药工艺试卷

山东***大学 专业 年级( 科) 《生物制药工艺学》期末考试试卷(A 卷) 姓 名: 学 号: 班 级: 考试时间: 补(重)考:(否) 题号 一 二 三 四 五 六 七 八 总分 核分人 得分 ---------------------------------------- 说明:本试卷总计100分,全试卷共5页,完成答卷时间2小时。 ---------------------------------------- 一、填空题(本大题共10题,每题1分,共10分) 1.微生物的诱变育种常用的诱变剂有物理诱变剂、化学诱变剂和 。 2.工业生产中对大量培养基和发酵设备的灭菌,最有效最常用的方法是 。 3.微生物菌种的 是指利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理,通过 分离、筛选排除衰退型菌株,选择维持原有生产水平的菌株的过程。 4.在超临界流体萃取过程中,为提高溶解度小的物质的溶解能力,常加入 。 5.采用液氮超低温保藏法保藏菌种时,应将盛装菌种的安瓿管保藏在 ℃液 氮管中进行保存。 6.高分子聚合物沉淀法中应用最多的沉淀剂是 。 7.疏水相互作用色谱常用的分离载体为多聚糖和 。 8.较纯的固体一般有 和无定形沉淀两种状态。 9.抗生素包括天然抗生素、半合成抗生素和 。 10.需要通过工业发酵生产的维生素为 和 。 得分 阅卷人 (签全名)

二、单项选择题(本大题共10 题,每题1分,共10分) 1.采用冷冻干燥法保存菌种时常用的保护剂是( )。 A .乙醇 B .甘油 C.脱脂牛奶 D .液体石蜡 E .蛋白胨 2.蛋白质盐析常用的中性盐是( )。 A .碳酸钙 B .磷酸钠 C.氯化钠 D .硫酸镁 E .硫酸铵 3.采用有机溶剂沉淀法时,最重要的因素是( )。 A .温度 B .湿度 C.压力 D .pH E .金属离子 4.次级代谢产物的产生菌一般是( )。 A .细菌 B .放线菌 C.霉菌 D .噬菌体 E .真菌 5.利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法,称为( )。 A .离子交换法 B .等电点沉淀法 C.亲和色谱法 D .双水相萃取法 E .吸附法 6.聚电解质沉淀法中应用较多的沉淀剂为( )。 A .聚乙二醇 B .酸性多糖 C.EDTA D .EDTA-Na E .硫酸铅 7.下面属于β-内酰胺类抗生素的是( )。 A .青霉素 B .链霉素 C.红霉素 D .土霉素 E .金霉素 8.目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质为( )。 A .聚丙烯酰胺凝胶 B .葡聚糖凝胶 C.琼脂糖凝胶 D .聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 E .葡聚糖琼脂糖凝胶 9.结晶过程的推动力是( )。 A .温度 B .pH C.溶质溶度 D .过饱和度 E .时间 10.链霉素发酵生产的菌种为( )。 A .产黄青霉菌 B .灰色链霉菌 C.红色链霉菌 D .金色链霉菌 E .土壤细菌 三、多项选择题(本大题共10题,每题1分,共10分) 得分 阅卷人 (签全名) 得分 阅卷人 (签全名)

生物制药工艺学名词解释

生物制药工艺学名词解释: 第一章: 1.药品:一定剂型和规格的药物并赋予一定的形式(如包装),而且经过有关部门的批准,有明确的作用用途。 药物:能影响机体生理、生化和病理过程,用以预防、诊断、治疗疾病和计划生育的化学物质。 2.生物药物Biopharmaceuticals:以生物体、生物组织或其成份为原料综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。 3.生物活性Biologicalactivity,Bioactivity:对活组织如疫苗有影响的特性。 4.酶工程enzymeengineering:酶学与工程学互相渗透结合,发展形成的生物技术,它是从应用目的出发,研究酶和应用酶的特异催化功能,并通过工程化过程将相应原料转化成所需产物的技术。 5.固定化酶immobilizedenzyme:是指借助于物理和化学的方法把酶束缚在一定空间内并具有催化活性的酶制剂。 6.组合生物合成combinatorialbiosynthesis(组合生物学combinatorialbiology):应用基因重组技术重新组合微生物药物的基因簇,产生一些非天然的化合物。 7.药物基因组学:一门研究个人的基因遗传如何影响身体对药物反应的科学。

8.凝聚作用coagulation:指在电解质作用下,胶粒粒子的扩散双电子层排斥电位降低,破坏了胶体系统的分散状态,使胶体粒子发生聚集的过程。 9.萃取extraction:将物质从基质中分离出来的过程。一般指有机溶剂将物质从水相转移到有机相的过程。 10.反萃取stripping/backextraction:将萃取液与反萃取剂相接触,使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过程。 11.萃取因素/萃取比:萃取溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余相中总量之比。 12.分离因素separationfactor:在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数的比值。 13.双相萃取技术two-aqueousphaseextraction:利用不同的高分子溶液相互混合可产两相或多相系统,静置平衡后,分成互不相溶的两个水相,利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 14.超临界流体萃取技术:利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来进行分离纯化的技术。 15.固相析出分离法solidphasecrystallization:通过改变溶液条件,使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术。 16.盐析法saltprecipitation:利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异,通过向溶液中引入一定数量的中性盐,使目的

生物制药工艺学

生物制药工艺学:对生物药物进行研究、生产和制剂的一门综合学科。 生物制药是把生物体内的具有生物活性的基本物质,保持原来的结构和功能,又能在含多种物质的液相或固相中较高纯度的分离出来,它是一项严格,细致,复杂的工艺过程,涉及物化生工程等方面的知识和操作技术。 遗传与变异:是生命的基本特征,也是菌种选育的理论基础。 杂交育种:是指将两个基因型不同的菌株经吻合(或接合)使遗传物质重新结合,从只能分离和筛选出具有新性状菌株的过程。 原生质体融合:是指把两个亲株的原生质体混合在一起,在融合剂PEG和Ga离子的作用下,发生原生质体的融合,促使两亲本的遗传物质进行交换,从而实现遗传重组。 分批灭菌:将配置好的培养基输入发酵罐内,经过间接蒸汽预热,然后直接通入饱和蒸汽加热,使培养基和设备仪器灭菌,达到要求的温度和压力后维持一定时间,在冷却至发酵要求的温度,这一工艺过程称为。 连续灭菌:培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续加热灭菌,冷却后送入已灭菌的发酵罐内,这种工艺称为。 萃取:液料与萃取剂接触后,液料中的溶质向萃取剂转移的过程。 超临界流体萃取技术是利用处于临界压力和临界温度以上的一些溶剂流体所具有特意增加物质溶解能力来进行分离纯化技术(温度31.06C,压力73.9,密度0.448) 双水相萃取法又称水溶液两相分配技术,它是不同的高分子溶液相互混合产生两相或多项系统,利用物质在互不相容的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。 吸附法:是利用适当的吸附剂,在一定Ph条件下,吸附生物样品中的生物药物,然后再以适当的洗脱剂将吸附的药物从吸附剂上解吸下来,达到浓缩和提纯的目的。 高分子聚合物沉淀法:某些水溶性非离子型高分子聚合物,如聚乙二醇等能使蛋白质水合作用减弱而发生沉淀。 过饱和溶液:溶液浓度等于溶解度时,该溶液称为饱和溶液。溶质只有在过饱和溶液中才有可能析出。 生物药物:是以生物体、生物组织、或其成分为原料(包括组织、器官、细胞器、细胞成分、代谢排泄物)综合应用生物学、物理化学与现代药学原理与方法加工制成的药物 现代生物技术药物:将生物体内生理活性物质的基因分离或人工合成,利用重组DNA技术加以改造,使其在细菌、酵母、动物细胞、转基因动物中间大量表达,通过这种方式获得的药物。 固体培养基:是加入一定量的凝固剂的培养基,适用于菌种的培养、分离、无菌试验、和菌种保藏工作。液体培养基是未加任何凝固剂的培养基 现代生物技术体系:主要的生物技术包括重组DNA技术、原生质体制备与原生质体融合技术、突变生物合成、组合生物合成、选择性生物催化合成、代谢途径工程、淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体、组织培养技术、基因治疗等。 微生物的初级代谢产物:包括氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、酶类、糖类、脂类等 微生物的次级代谢产物:包括抗生素,色素,生物碱、酶的抑制剂、植物生长素等初级代谢:指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢活动,初级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖有密切关系的代谢产物。 次级代谢:指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢活动,次级代谢产物指的是与微生物的生长繁殖无关的代谢产物。 培养基:是人工配制的、供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的多种营养物质的混合物。 前体:在微生物药物的生物合成过程中,有些化合物能直接被微生物利用构成产物分子结构的一部分,而化合物本身的结构没有大的变化,这些物质称为前体。 生长因子:是微生物生长代谢必不可少,但不能用简单的碳源或氮源生物合成的一类特殊的营养物质。 促进剂:在发酵培养基中加入某些微量的化学物质,可促进目的代谢产物的合成,这些物质被称为促进剂。 抑制剂:在发酵过程中加入某些化学物质会抑制某些代谢途径的进行,同时会使另一代谢途径活跃,从而获得人们所需的某种代谢产物,或使正常代谢的中间产物积累起来,这种物质被称为抑制剂。 诱导物:一般是指一些特殊的小分子物质,在微生物发酵过程中添加这些小分子物质后,能够诱导代谢产物的生物合成,从而显著提高发酵产物的产量。 生理酸性物质:经微生物代谢作用后,能产生酸性物质的营养成分称为生理酸性物质。 生理碱性物质:经微生物代谢作用后,能产生碱性物质的营养成分称为生理碱性 物质。 速效碳源、迟效碳源:根据微生物利用碳 源速度的快慢可将碳源分为速效碳源和 迟效碳源。葡萄糖和蔗糖等被微生物利用 的速度较快,它们是速效碳源,而乳糖、 淀粉等被利用的速度相对较为缓慢,它们 是迟效碳源。 葡萄糖效应:在发酵过程中,如果葡萄糖 浓度过高会加快菌体的代谢,以致培养基 中的溶解氧不能满足菌体进行有氧呼吸 的需要,葡萄糖分解代谢就会进入不完全 氧化途径,一些酸性中间产物如丙酮酸、 乳酸、乙酸等积累在菌体或培养基中导致 Ph降低,影响某些酶的活性,从而抑制 微生物的生长和产物的合成,产生葡萄糖 效应。 生产种子的制备:指的是由保藏的菌种开 始,经过不断的扩大培养,使菌体数量达 到能满足发酵罐接种量的需要所涉及的 生产过程。 种子的制备:是将固体培养基上培养好的 孢子或菌体转入到液体培养基中培养,使 其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 诱变育种的基本过程:选择合适的出发菌 株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→ 筛选→保藏和扩大试验 常用的诱变剂:1紫外线2亚硝基胍3硫 酸二乙酯4亚硝酸 杂交育种是将孢子(或摇瓶菌丝)接入的 体积较小的种子罐中,经培养后形成大量 的菌丝,该种子称为一级种子,把一级种 子转入到发酵罐内发酵称为二级发酵,如 果将一级种子接入到体积较大的种子罐 内,经过培养形成更多的菌丝体,这样制 备的种子称为二级种子,将二级种子转入 到发酵罐内发酵,称为三级发酵,同样道 理,使用三级种子的发酵称为四级发酵。 代谢曲线:根据发酵过程中代谢参数变化 绘制出的曲线,作用:可清楚的说明发酵 过程中的代谢变化,并反映出碳源,氮源 的利用和Ph、菌体浓度和产物浓度等参 数之间的相互关系。 为什么要绘制代谢曲线?分析研究代谢 曲线,有利于掌握发酵代谢变化的规律和 发现工艺控制中存在的问题,有助于改进 工艺,提高产物的产量。 膜分离法:又称为超滤法,包括微滤,超 滤和反渗透,是利用可截留一定分子量的 超滤膜进行溶质分离或浓缩。 渗透压冲击法:将细胞置于高渗溶液中 (例如一定浓度的蔗糖或甘油溶液中), 由于渗透压的作用,细胞内的水分便向外 渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将 介质快速稀释或将细胞转入缓冲溶液中, 由于渗透压发生变化,胞外的水分迅速渗 入胞内,是细胞快速膨胀而破裂,使产物 释放到溶液中。 离子交换法:是应用合成的离子交换树脂 作为吸着剂,将溶液中的物质,依靠库伦 力吸着在树脂上,然后用合适的洗脱剂将 吸着物从树脂上洗脱下来,达到分离,浓 缩,提纯的目的。 离子交换树脂:是一种具有网状立体结构 的,含有活性基因而能与溶液中其他物质 进行交换或吸着的聚合物。 交换容量:是表征树脂活性基数量——交 换能力的重要参数,其表示方法有重量交 换容量交换容量体积法。 沉淀法:是利用某种沉淀剂或改变条件, 使所需提取的目的物在溶液中的溶解度 降低而形成无定形固体沉淀从而进行分 离的一种技术方法。 等电点沉淀法:利用大分子两性电解质在 等电点时溶解度最低的原理而建立的分 离法称为~ 凝胶层析(色谱):是指以各种多孔凝胶 为固定相,利用流动相中所含各种组分的 相对分子质量不同而达到物质分离的一 种技术。 亲和层析(色谱法):是利用生物大分子 与某些对应的专一特意识别和可逆结合 的特性而建立起来的一种分离生物大分 子的色谱方法。 重结晶:即将晶体用合适的溶剂溶解再次 结晶,能使纯度提高,因为杂质和结晶物 质不在同溶剂和不同温度下的溶解度不 同。 结晶:是制备纯物质的有效方法,溶液中 的溶质在一定条件下,因分子有规则的排 列而结合成晶体。 晶核:最先析出的微小颗粒是以后结晶的 中心,称为。 自然选育:是利用微生物在一定条件下产 生自发突变的原理,通过分离,筛选排除 衰退型菌株,从中选出维持或高于原有生 产水平菌株的过程。 诱变育种:是利用物理或化学诱变剂处理 均分散的微生物细胞群体,促使其突变率 大幅提高,然后采用简便,高效的筛选方 法,从中选出少数具有优良性状的突变菌 体。 孢子制备:一般采用琼脂斜面或其他固体 培养基,使菌种经过培养得以活化,并产 生数量足够,质量合格的孢子。 英汉互译:抗生素anti bioti cs 氨基酸 amino acid 维生素vitamin 多肽 polype ptide 蛋白质pr otein 蛋白质 的等电点isoelectric point pi 蛋白质的 变性denaturation 胸腺肽al thymosin al 人绒毛膜促性腺激素 human chorionic gonadotropin (HCG)生 物转化biotra nsformati on 基因工程 genetic engineering 基因工程药物 genetically engineered drug 简答: 生物制药的工艺过程?菌种→斜面培养 →种子制备→发酵→发酵液预处理→提 取→精制→成品检验→成品→包装 生物制药产品的类别包括哪些?举例说 明:(一)微生物发酵产物1.微生物菌体 药物:如,酵母菌体,单细胞蛋白,灵芝, 冬虫夏草,茯苓菌等2.微生物酶抑制:如 蛋白酶,淀粉酶,糖化酶,青霉素酰化酶 3.酶活性调节剂:包括酶激活剂和酶的抑 制剂,如血管紧张素转化酶抑制剂,胆固 醇合成酶抑制剂4.微生物代谢产物:如初 级代谢产物氨基酸,次级代谢产物抗生素 等(二)生物转化药物,如激素,维生素, 抗生素,生物碱(三)基因工程药物:如 人胰岛素,人生长因子,白介素,干扰素 (四)动植物细胞培养药物。 生物制药与中医药的关系:①中药鉴定、 识别假冒伪劣药材(DNA芯片技术)②发 现新中药品种③发酵液中提取中药(高效、 结构改善)④利用基因工程产生之植物此 生代谢产物(黄酮素,糖苷,生物碱等) ⑤利用转基因动物生产动物类药材(基因 芯片植入动物→表达→从分泌物(麝香) 或组织中(鹿茸)提取活性物质。 培养基的组成、分类方法、设计注意问题: 培养基成分主要包括碳源、氮源、磷源、 硫源、无机离子(包括微量元素)、生长 因子、前体、促进剂、抑制剂和水分。分 类方法:按培养基组成物质的来源,可分 为合成培养基和复合培养基(天然培养基) 按物理状态可分为固体培养基和液体培 养基及半固体培养基;按工业发酵中的用 途可分为孢子培养基、种子培养基、发酵 培养基和补料培养基。注意问题:①确定 培养基的基本组成②确定培养基成分的 基本配比和浓度(a碳源和氮源的配比和 浓度b生理酸性物质和生理碱性物质的 比例c无机盐浓度d其他培养基成分的浓 度)③具有经济性。 培养基筛选方法:①单因子实验法②正交 试验和均匀设计试验等数学方法。 影响培养基的因素:原材料质量、水质、 培养基的灭菌(一般在121度下灭菌20 到30分钟,含糖培养基112度灭菌15到 30分钟)和黏度 菌种保藏的目的、原理及方法:菌种保藏 的目的是尽可能保持菌种的存活率和优 良性能,保证菌种经过较长时间的保藏后 仍保持存活和生产能力。菌种保藏对于基 础研究和实际应用具有重要意义。 菌种保藏的原理:是根据微生物的生理特 性,人为地创造条件,使微生物处于代谢 不活跃,生长繁殖受抑制的休眠状态,以 减少菌种的变异。有利于微生物休眠的条 件是低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等。 菌种保藏的方法: 1)斜面保藏法,广泛应用于细菌、放线 菌、酵母菌等菌种的短期保存。为了长期 保持菌体存活,每间隔一定时间需重新移 植培养一次。 该方法的优点是简便易行,成本低,能随 时观察菌株是否死亡、变异、退化或染菌。 缺点是由于斜面含有营养和水分,菌种生 长和繁殖还没有完全停止,代谢活动尚能 微弱进行,因此存在自发突变的可能;短 期内多次传代易引起菌种发生变异和引 起退变,污染杂菌的机会也会随之增多。 2)液体石蜡保藏法:在无菌条件下,将 液体石蜡倾注或用无菌吸管移入生长成 熟、丰满的斜面菌种上,使液体石蜡高出 斜面顶端1cm左右,加塞并用固体石蜡封 口,将其直立放在试管架上低温保藏。 3)沙土管保藏法:孢子或芽孢,在干燥 环境中抵抗力强,不易死亡。干燥能使这 些微生物的代谢活动水平降低但不会死 亡,而处于休眠状态。保藏时间可达数年。 4)麸皮保藏法: 5)冷冻干燥法:目前较理想的保藏方法, 也是各类菌种保藏机构广泛采用的主要 保藏方法。最常用的保护剂是脱脂牛奶, 脱脂牛奶可由新鲜的牛奶制备。 6)液氮超低温保藏法:该法保藏菌种的 效果好,方法简单,保藏对象也最为广泛, 几乎所有微生物及动植物细胞等均可采 用该方法。该法的另一优点是可利用各种 培养形式的微生物进行保藏,不论使用孢 子或菌体、液体培养物或固体培养物均可 采用该法。因此被认为是当前最有效、最 可靠的一种长期保存菌种的方法之一。 7)甘油保藏法 8)孢子滤纸保藏法 菌种选育目的:①生产方面:a提高发酵 产量b改进菌种的性能c产生新的发酵产 物d去除多余的组分②科研方面:a了解 菌种遗传背景b提供分子遗传学研究材 料c获得带遗传标记的菌株d生物合成途 径的研究e生物合成机制的研究 发酵过程工艺参数有哪些?(1)物理参 数:①温度②压力③搅拌转速④搅拌功率 ⑤空气流量⑥表观粘度(2)化学参数: ①Ph②基质浓度a糖浓度的测定b氮浓度 的测定c磷酸盐含量的测定d产物浓度的 测定e溶解氧浓度的测定f废气中氧含量 g废气中二氧化碳含量(3)生物参数: ①菌体浓度②菌丝形态 微生物的发酵类型:(1)按投料方式分类: ①分批发酵②补料分批发酵③连续发酵 (2)按与氧的关系分类:①需氧发酵② 厌氧发酵(3)按发酵动力学参数的关系 分类:①生长偶连型②部分生长偶连型③ 非生长偶连型 细胞破碎的方法:一机械法:①液体裁切: 超声波,机械搅拌,压力②固体裁切:研 磨,压力。二非机械法:①干燥:空气干 燥,真空干燥,冷冻干燥,喷雾干燥②溶 胞:物理法,化学法,酶法。 沉淀法有哪些?盐析法;有机溶剂沉淀法; 等电点沉淀法;高分子聚合物沉淀法;聚 电解质沉淀法;不可逆的沉淀去除法 温度对发酵的影响:1温度影响酶的活性 2温度影响发酵液的物理性质3温度影响 代谢产物的合成方向;PH对发酵的影响 1PH影响酶的活性2PH影响基质或中间产 物的解离状态3PH影响发酵产物的稳定 性 育种方法:自然育种,诱变育种,杂交育 种,原生质体融合育种。 主要灭菌和除菌方式:高温灭菌:A1干 热灭菌2湿热灭菌B过滤灭菌C化学物质 消毒和灭菌D其他方式灭菌1辐射灭菌2 臭氧灭菌3静电除菌 生产种子的制备:两个阶段:实验室种子 制备和生产车间种子制备 消除泡沫的方法:机械消除和消沫剂消除 影响孢子质量的因素:培养基、培养温度、 温度、培养时间、冷藏时间、接种量 分离纯化的特点:培养液(或发酵液)中 所含欲分离的生物物质浓度很低;欲分离 的生物或新物质通常很不稳定;发酵或培 养都是分批操作、生物变异性大,各批发 酵液不尽相同,这要求分离有一定弹性, 发酵液的放罐时间、发酵过程中泡沫剂的 加入对分离都有影响;用作医药的生物产 物与人类生命息息相关 影响溶剂萃取的因素:①PH的影响2温 度与萃取时间的影响3盐析作用的影响4 溶剂种类、用量及萃取方式的选择 离子交换速度的影响因素:1颗粒大小2 交联度3温度4离子化合物5离子大小6 搅拌速度7溶液浓度 影响吸附过程的因素:1吸附剂的性质2 被吸附物的性质3溶剂的影响4溶液PH 值的影响5温度的影响6其他组分的影响 常用吸附剂按其化学结构可分为两大类: 一类是有机吸附剂,如活性炭、维生素、 大孔吸附树脂等。另一类是无机吸附,如 白土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。 盐析法的影响因素:1盐的性质2PH值3 盐的饱和度4蛋白质浓度5温度 有机溶剂沉淀法的影响因素:1温度2PH 值3蛋白质浓度4无机盐离子的强度5金 属离子 膜分离机制:利用可截留一定分子量的超 滤膜进行溶质的分离或浓缩,小于截留值 的分子能通过膜,而大于截留值的分子不 能通过膜,因而达到分离。 凝胶色谱分离法的原理:凝胶色谱柱中, 当含有各组分的混合溶液流经凝胶层析 住时,各组分在层析柱内同时进行两种不 同的运动,一种是随着溶液流动而进行的 垂直直下的移动,另一种是不定向的分子 扩散运动(布朗运动)。大分子物质由于 分子直径较大,不能进入凝胶的微孔,只 能分布于凝胶颗粒的间隙中,已较快的速 度流过凝胶剂;较小的分子能进入凝胶的 微孔中,不断地进出于一个个颗粒的微孔 内外,这就使小分子物质向下移动的速度 比大分子的速度慢,从而使混合溶液中各 组分按照Mr由大到小的顺序先后流出层 析柱,大到分离的目的。 凝胶色谱分离法的特点:操作条件温和, 简单易行;分离Mr范围广;离效果一般 不受缓冲液组成的影响;进行一次操作后 无需再生处理就可进行下一次的分离 凝胶色谱分离法的应用:1盐脱2分级分 离3大分子物质的分子量测定 亲和色谱的操作:吸附、冲洗、洗脱、平 衡 饱和溶液形成的条件:蒸发法、冷却法、 化学反应结晶法、盐析结晶法、等电点法、 复合法、共沸蒸馏结晶法 影响晶体大小的因素:过饱和度、温度、 搅拌速度、晶种 改变晶体形状的方法:控制晶体生长速度、 过饱和度、结晶温度、选择不同的溶剂、 调节溶液的PH值和有目的的加入某种能 改变晶形的杂质 工业生产实例:1化学反应结晶2利用温 度差结晶3利用湿度差结晶4盐析结晶5 利用等电点结晶6盐析和冷却结晶7冷却 和化学反应并结晶8共沸蒸馏结晶9重结 晶 氨基酸的制备方法:1水解法a酸水解法b 碱水解法c酶水解法2微生物发酵法3化 学合成法4酶促合成法 氨基酸的分离方法:1基于溶解度或等电 点不同分离2加入特殊沉淀剂沉淀分离3 用离子交换剂分离4用电渗析法分离 维生素的发酵生产工艺路线:1斜面种子 培养2一级种子培养3二级种子培养4发 酵培养

生物制药工艺处理学考试2013-12(A卷)

中国药科大学 生物制药工艺学 期末试卷A卷 2013-2014学年第一学期 专业班级学号姓名 题号一二三四总分 得分 核分人: 得分评卷人一、填空题(每空0.5分,共30分) 1、细胞破碎包括哪三大类方法、和。 2、萃取因素也称萃取比,其定义为被萃取溶质进入的总量与该溶质在 中总量之比。 3、晶体的质量主要是指晶体的大小、形状和纯度,其中影响晶体大小的主要因素有 , , , 。 4、大孔网状聚合物吸附剂是在树脂聚合时加入 致孔剂,待网格骨架固化和链结构单元形成后,用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉,形成不受外界环境条件影响的 ,其孔径远大于2~4nm,可达 ,故称“大孔”。 5、在作分级分离时,为了提高分辨率,多采用比样品体积大倍的柱体积, 的柱比,较吸液量、较粒的凝胶固定相。 6、写出下列离子交换剂类型:732 ,724 ,717 ,CM-C , DEAE-C ,PBE94 。 7、请写出下列药物英文的中文全称:IFN(Interferon)、 第1页(共8页)

IL(Interleukin) 、 CSF(Colony Stimulating Factor)、rhGH(Recombinant Human Growth Hormone)、Ins(Insulin)。 8、生物药物的分类:、、、 。 9、在生化制药工艺中干燥的方法主要包括:、 、。 10、疫苗制备时,可用 、 和 方法扩增病毒。 11、各向异性膜分为两层,一层是,厚度为0.1~1μm,决定了膜的 性质,另一层是,厚度约0.1mm,作用是。 12、制备型高效液相色谱的重要参数有、、 、。 13、密度梯度离心常用的介质有、 、。 14、用100μmol/L NADH使乳酸脱氢酶吸附在固定化丙酮酸类似物上,若NADH从洗脱液中去除,则脱氢酶被洗脱,这种洗脱方法称为。 15、生化药物的主要资源有 、 、 和 。 16、粘多糖是一类含有 和 的多糖。 17、铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)脂质是 ,临床应用效果 ,原因是 。从发现年代上看,该物质 于青霉素被发现。 第2页(共8页)

生物制药工艺学

《生物制药工艺学》四年制本科课程教学大纲 一、课程基本信息 课程编号:0705060 课程名称:生物制药工艺学 英文名称:Bio-pharmaceuticals 课程性质:专业课 总学时:48学时(理论学时:36学时) 学分:2.5学分 适用专业:药学、药物制剂专业 预修课程:有机化学、药理学、生物化学、分子生物学 建议教材:《生物制药工艺学》(吴梧桐主编,中国医药出版社出版) 课程简介: 生物制药工艺学是药学专业的一门专业课,是从事各种生物药物的研究、生产、制剂的综合性应用技术科学。根据药学专业培养的目 标和要求,本课程的主要内容是介绍当前生物制药所需的基本理论和 技术,重点讨论各类生物药品的来源、结构、性质、用途、制造原理、工艺过程与生产方法。在教学过程中,旨在着重培养学生具备从事生 物药品研究、生产和开发的基本知识、基本理论和基本技能。通过本 课程的学习,应使学生达到以下要求: 1. 掌握生物制药所需的基本理论和技术

2. 掌握各类生物药品提取分离的基本原理和技能 3. 熟悉各类生物药品的来源、结构、性质、用途 4. 了解本学科的成就、新进展 本课程总教学时数为 48 学时,其中理论课教学为 36 学时,实验课教学为 12 学时。 大纲的使用说明:凡本大纲所列各章节项目中划有横线“”的,表示必需掌握熟识的重点内容.注明“*”的,一般课堂上不作讲授,供学生参阅或学有余力的自学提高,其余均为应当了解的理论和知识. 二、教学内容与要求 第一篇生物制药工艺基础 第一章生物药物概述 (一)目的要求: 掌握生物药物的含义及特点;熟悉生物药物的分类;了解生物药物研究范围,用途和研究趋势。 (二)学时安排:理论课:2学时 (三)教学内容 1、基本概念或关键词:生物制药;生物药物;特性;分类 2、主要教学内容: (1)概述生物制药的含义 (2)生物药物的研究范围。 (3)生物药物的特性、分类与用途 (4)生物制药的研究发展前景 第二章生物制药工艺技术基础 (一)目的要求: 掌握生物材料的来源,生物活性物质的提取方法及生化物质分离纯化的基本

生物制药工艺学习题集及答案

发酵工艺学(2)习题集 第一章生物药物概述 1、生物药物、抗生素、生化药品、生物制品、基因工程药物的概念 (1)、生物药物:指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果,利用生物体、生物组织、体液或其代谢产物,综合应用化学、生物技术、分离纯化工程和药学等学科的原理与方法加工、制成的一类用于预防、治疗和诊断疾病的物质。 (2)、抗生素:抗生素是生物,包括微生物,植物和动物在内,在其生命活动过程中所产生的(或由其它方法获得的),能在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的有机物质。 (3)、生化药品:利用生理学和生物化学的理论、方法及研究成果直接从生物体分离或利用微生物合成,或用现代生物技术制备的一类用于预防、治疗、诊断疾病,有目的的调节人体生理机能的生化物质。 (4)、生物制品:是指用微生物(包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等)、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物的血液或组织等经加工制成,作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他有关疾病的免疫制剂。各种疫苗、抗血清、抗毒素、类毒素、免疫调节剂、诊断试剂。(5)、基因工程药物:采用新的生物技术方法,利用细菌、酵母或哺乳动物细胞作为活性宿主,进行生产的作为治疗、诊断等用途的多糖和蛋白质类药物。 2、生物药物的分类。 (1)、按照药物的化学本质和化学特性可分为:氨基酸类药物及其衍生物、多肽和蛋白质类药物、酶类药物、核酸及其降解物和衍生物、多糖类药物、脂类药物、维生素。 (2)、按原料来源可分为:人体组织来源的生物药物、动物组织来源的生物药物、微生物来源的生物药物、植物来源的生物药物、海洋生物来源的生物药物。 (3)、按功能和用途可分为:治疗药物、预防药物、诊断药物。 3、生物药物的特性。 药理学特性: (1)治疗的针对性强治疗的生理、生化机制合理,疗效可靠。如细胞色素c为呼吸链的一个重要成员,用它治疗因组织缺氧所引起的一系列疾病,效果显著。 (2)药理活性高生物药物是精制出来的高活性物质,因此具有高效的药理活性 (3)毒副作用小,营养价值高 (4)生物副作用常有发生

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