蛋白质工程重点
一、名词解释
1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。
2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。
3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。
4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。
5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。
6、晶胞(Unit cel l)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。
7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。
8、化学势（位）移（ ）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。
9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。
10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。
二、问答题
1、蛋白质修饰特异性与非特异性诱变方法：
随机突变：UV、X射线、其他化学方法、转座元件、简并引物
定点突变：核式突变、限制性内切酶位点、寡核苷酸介导突变、PCR依赖
1）、Kunkel突变法
双突变菌株
转染于dut+ung+野生型受体菌不含U碱基的保留，含U碱基的被切除
原理：当大肠杆菌dUTP酶缺失突变时（dut-），这些细菌就不能把dUTP转化为dUMP,因而细菌体内的dUTP浓度大为增加，并且一些dUTP会掺入到DNA合成中应该由胸腺嘧
啶占据的位置。而此时大肠杆菌体内还存在一种尿嘧啶-N-糖基化酶，它可以去除掺入到DNA中的尿嘧啶残基。但在尿嘧啶-N-糖基化酶缺陷性菌株中（ung-），由于该酶的失活将不能把尿嘧啶从DNA链中剔除，使细菌DNA中一小部分胸腺嘧啶残基被尿嘧啶所取代。在dut-ung-F’菌株中，取代比例有所提高，由该菌株培养的M13噬菌体的DNA中会含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体转染ung+菌株，尿嘧啶被除去，并因此产生一些可阻断DNA合成且对特定核酸酶敏感的位点。病毒DNA被破坏，感染力下降约5个数量级。
Kunkel 突变法正是利用上述机制，首先在dut-ung-的双突变菌株中培养适当的重组M13噬菌体，制备出带U的单链DNA模板，然后与突变引物退火、引物延伸，然后将延伸反应混合物转染ung+受体菌，模板链因由U碱基位点的存在而被破坏，野生型噬菌体的产生受到抑制。大部分（＞80%）的后代噬菌体是由所转染的不带U的负链复制而来的。由于该链是由突变引物延伸而来的，因此，后代噬菌体多带有突变的目标基因。所以，Kunkel 突变法所产生的突变体不需要利用标记的寡核苷酸探针来筛选阳性噬菌斑，可直接通过序列分析来确定突变体。
2）、DpnI法进行定点突变
常规大肠杆菌中质粒含DpnⅠ位点添加一对正反向突变引物体外退火延伸模板质粒对DpnⅠ酶敏感，被切除体外合成的突变序列质粒成功转化
原理：一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
2、重叠延伸PCR （4个引物）技术
（反向引物）
（第一轮PCR ，共有4种产物）
（引物退火变性延伸）
（用DNA 聚合酶扩增至完整链）
）
原理：由于采用具有互补末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR 技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.
3、蛋白质结构测定方法的优缺点
1）、蛋白质结构测定方法：X 射线晶体结构测定、核磁共振波谱法（NMR ）、三维电镜重构。
2）、X 射线晶体结构测定：
优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整性的大量信息； 缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；
②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）First PCR Remove primers Denature and anneal by DNA polymerase
DNA cloning
③X射线晶体衍射的工作流程较长。
核磁共振波谱法（NMR）：
优点：①同样具有高分辨率
②可以在溶液中操作，接近生理状态
③分析并直接模拟出蛋白质的空间结构、蛋白质与辅基和底物结合的情况以
及酶催化的动态机理
缺点：①样品的分子量要比较小（50KD以下）
②对不溶的蛋白比较困难（如膜蛋白）
③实验周期长（>1年）
三维电镜重构：
优点：1.可以直接获得分子的形貌信息；
2.适于解析那些不适合应用X射线晶体学和核磁共振技术进行分析的样品（如
难以结晶的膜蛋白，大分子复合体等）；
3.适于捕捉动态结构变化信息；
4.易同其他技术相结合得到分子复合体的高分辨率的结构信息；
5.电镜图像中包含相位信息，所以在相位确定上要比X射线晶体学直接和方便。
缺点：①最大的缺点是分辨率较低
②对小分子蛋白效果不佳
4、X射线晶体结构测定原理、步骤及优缺点
1)、原理：1.光的衍射现象
2.X射线的发现及应用
3.晶体学基础知识
4. X射线晶体衍射
?光的衍射现象
衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强不均匀分布的现象
?X射线的发现及应用
?本质的争论（波动说微粒说）
?X射线衍射的发现
?晶体学基础知识
?X射线晶体衍射
2）、X射线晶体结构测定基本过程：①蛋白质获取（提纯）
②晶体生长并经冷冻技术处理
③重原子衍生物制备
④衍射数据收集
⑤衍生数据分析和改进
⑥结构模型的获取（包括修正）
3）、优缺点：
优点：分辨率高、不损伤样品、无污染、相对快捷、能得到晶体完整
性的大量信息；
缺点：①晶体构象是静态的，不能测定不稳定的过渡态的构象；
②很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；
③X射线晶体衍射的工作流程较长。
三、简答题（有些没听到）
1、空间结构组件及其特点
α螺旋（αhelix）、Β折叠（βsheet）、环肽链（loop）、转角（turn）1）.α-螺旋结构：
?多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构.
?肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行(同一方向），具有极性，N(+)、C(-) 。
?中心无空腔，稳定
?蛋白质分子为右手α-螺旋。（选）
?螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;
?沿主链计算，一个氢键闭合的环包含13个原子，3.613
?螺旋一侧主要分布亲水（荷电、极性）残基，另一侧主要集中疏水残基
?对生物活性具有重要作用
?可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测两亲性
2）、Β折叠：
?伸展的构象，每圈只有2个氨基酸残基的特殊螺旋
?α-碳原子处于折叠的角上，R基团处于棱角上与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm
?β折叠片也是一种重复性的结构，可以把它想象为由折叠的条状纸片侧向并排而成。肽主链沿纸条形成锯齿状。
?氢键是在片层间而不是片层内形成。
?折叠片上的侧链都垂直于折叠片的平面，并交替地从平面上下二侧伸出。
3）、转角（turn）
回折(reverse turn)
β转折（转角）(β-turn)
γ转折(γ-turn)
β发夹
β发夹(β－hairpin)
无规则卷曲
2、蛋白质的空间结构层次
一级结构、二级结构、结构模体、结构域、三级结构/亚基、四级结构。
3、第二遗传密码的定义及其特点
定义：无结构的多肽链到有完整结构的功能蛋白质信息传递部分—遗传密码的第二部分，
蛋白质中氨基酸序列与其三维结构的对应关系，称之为第二遗传密码或折叠密
码。
特点：简并性
氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的三维结构。
?多意性
相同的氨基酸序列可以在不同的条件下决定不同的三维结构。
?全局性
在肽链上相距很远的残基可以在空间上彼此靠近而相互作用，并对分子总体结构产生重要影响；后形成的肽段可以影响已经形成的肽段个构象从而造成对分子整体的影响等。
4、表达系统宿主的选择：
体内翻译系统
体外翻译系统：原核生物表达系统：大肠杆菌、枯草杆菌
真核生物表达系统：酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统
5、大肠杆菌表达载体的组件
复制起始点、选择性基因、多克隆位点（MCS）、启动子(Promoter)、终止子(Terminator)、核糖体结合位点(SD序列)
四、其他
一）、蛋白质工程绪论
1、蛋白质工程化的顺序：工程化：理念－设计－制造－功能实现
2
3
?酶工程：酶工程的重点在于对已存酶的合理充分利用和大量制备。
?蛋白质工程：重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。
4、蛋白质工程产生的标志、研究内容、支撑技术
1)、1983年，美国的Ulmer在《Science》上首先提出了“Protein Engineering“——蛋白
质工程诞生(Science, 219: 666-671. )
2）、1. 蛋白质结构分析
——基础
2. 结构、功能的设计和预测
——基础的应用与验证
3. 创造和/或改造蛋白质——新蛋白质
——终目标
3）、蛋白质结构解析技术、生物信息学分析技术、定点突变等遗传操作技术二）、蛋白质结构基础
5、氨基酸的构型与构象及多肽链构象的表征参数
?构型configuration：一个分子中原子的特定空间排布（L-型的单一手性分子）–构型转化时必须有共价键的断裂和重新形成
–不同构型分子除镜面操作外不能以任何方式重合
–化学上可以分离，不可由单键旋转相互转换
?构象conformation：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布–构象转化时不需要共价键的断裂和重新形成
–化学上难以区分和分离
表征参数：（1）多肽链的构象角(φ,ψ)
（2）拉氏构象图（Ramachandra plot）及多肽链构象的允许区
6、可用螺旋转轮(helical wheel)的方式预测两亲性
7、β折叠的几种形式：平行型/反平行型、混合型（选）
8、蛋白质的一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，二硫键的数目和排列方式
9、维系蛋白质结构的作用力：肽键、二硫键、氢键、离子键、疏水键、范德华力
维持蛋白质一级结构的作用力是：肽键、二硫键
三）、蛋白质折叠
10、20世纪60年代，Anfinsen基于还原变性的牛胰RNase在不需其他任何物质帮助下，仅通过去除变性剂和还原剂就使其恢复天然结构的实验结果，提出了“多肽链的氨基酸序列包含了形成其热力学上稳定的天然构象所必需的全部信息”的“自组装学说”。证明了一级结构决定高级结构。
Anfinsen的贡献：氨基酸序列决定空间结构－蛋白质折叠的热力学
第一个发现了二硫键异构酶
亲和层析纯化蛋白
合成葡萄杆菌核酸酶－固相合成
11、体外蛋白质折叠与细胞内新生肽链折叠的区别
?完整肽链在试管内的重折叠相当于翻译完成后才折叠，与新生肽链的合成延伸与折叠同时进行的不同。
?细胞内新生肽链折叠是一个比蛋白质体外重折叠快得多的过程。
?温度、浓度、pH值不同
?细胞和试管另一个重要差别是“大分子拥挤”问题。
12、帮助蛋白质和新生肽链折叠的生物大分子
?分子伴侣（molecular chaperone）
?折叠酶：催化与折叠直接有关的化学反应的酶。
–蛋白质二硫键异构酶(PDI)
–肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)
13、分子伴侣与酶的异同点及作用机制
1）、分子伴侣与酶的异同点
–相同点
?参与促进一个反应而本身并不在最终产物中出现
–不同点
?分子伴侣对靶蛋白不具有高度专一性
?分子伴侣的催化效率很低
?分子伴侣有时只是阻止肽链的错误折叠而不是促进其正确折叠。
2）、作用机制
?识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然结构。与这些中间物结合，生成复合物，防止过早的或者错误的相互作用而阻止不正确的无效的折叠途径，抑制不可逆的聚合物的产生，促进折叠向正确的有效的途径进行。
?分子伴侣首先会识别折叠过程中形成的折叠中间物的非天然构象，而不会去理会天然构象。
?分子伴侣与早期形成的中间物相互作用而防止它们之间的聚合；一旦聚合形成，分子伴侣就无能为力了。
14、蛋白质的质量控制系统（选）
?蛋白质是生物体内一切功能的执行者。
?蛋白质的错误折叠可以导致一些疾病。
?为保证细胞的正常活动，细胞通过各种层次的“质量控制”来识别、纠正和防止错误的发生。
15、折叠病与构象病的区别（选）
?“分子病”:由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况，如地中海镰刀状红血球贫血症。分子病不是构象病。
?“折叠病”:蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变引起的疾病。
四）、蛋白质的理化性质
16、蛋白质的理化性质：
1）、蛋白质折叠过程中会打破水的有序化,则ΔS溶剂为较大的正值,因而有利于折叠态。
2）、对于典型的蛋白质来说,对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是疏水残基引起的ΔS溶剂。
3）、蛋白质的稳定性主要指蛋白质的物理上（热力学）的稳定性，而不是化学稳定性。
4）、与蛋白质折叠相关的焓有两个：
–通过平衡常数算得的Van‘t Hoff 焓，DHVH
–通过量热法获得的量热焓，DHcal
如果DHVH ＝DHcal ，表明在Tm处没有中间体的存在, 系统属于两态转变五）、蛋白质分子模拟与设计
17、设计层次、分类
“小改”：定位突变和化学修饰
“中改”：结构域进行拼接组装
?全新蛋白质设计（“大改”）
–完全从头设计全新的蛋白质
——基于某些理论和研究结果，设计出初始分子模型
——设计循环
18
19
?分子量都比较小
?灵活性Gly>Ala>Pro
?甘氨酸具有高度柔韧性，可在α螺旋、β折叠处出现，但更常见于铰链区或β转角。Gly在定点突变时，一般不宜随意改变
?Pro比较刚性，常出现在β转角
?Ala处于二者之间，常用作取代别的氨基酸的首选。
20、Janus-真正符合Paracelsus挑战的蛋白
六）、蛋白质修饰
21、基因融合与基因连接的方法及用途
方法：通过限制性内切酶、通过无义突变产生的限制性内切酶、重叠延伸PCR
用途：1）、单分子活性组合
2）、检测和提纯
3）、提高基因表达量和增溶作用
4）、细胞定位
22、非天然氨基酸的引入方法（tRNA介导的蛋白质工程）
1）、在体内引入氨基酸类似物
2）、氨酰化tRNA半合成酶介导体内外翻译
3）、非天然氨基酸tRNA合成酶/tRNA对介导的蛋白质工程
复制起始点、选择性基因、多克隆位点、启动子、终止子、核糖体结合位点七）、蛋白质的分离纯化与鉴定
23、与蛋白质分离纯化相关的理化特性
?蛋白质的溶解特性：盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法
?蛋白质的分子大小：透析、超滤、凝胶过滤、离心
?蛋白质的带电特性：电泳、离子交换层析
?蛋白质的吸附性质
?蛋白质与配体特异性结合不同：免疫亲和层析、生物亲和层析、金属螯合亲和层析、拟生物亲和层析
?蛋白质的分子形状
?蛋白质的变性和复性
24、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
?总原则
–以合理的效率、速度、收率和纯度，将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来，同时仍保留其生物学活性和化学完整
性。
?步骤
–选择实验材料，实验材料预处理
–蛋白质的提取
–蛋白质的粗分级
–蛋白质的细分级
–蛋白质的鉴定
25、蛋白质的粗分级、细分级方法
粗分级：1）、使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后，蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低，采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩，同时去除大量的杂质，
这些纯化方法就属于蛋白质的粗分级。
2）、硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋白质结晶等。
细分级：1）、粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大小、分子形状、分子表面特征或分子带电状况进一步纯化，这就
是蛋白质细分级。
2）、常用技术：层析（分子筛层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析）和电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS—
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAGE）、等电聚焦电泳（IEF）、双向电泳）26、不连续PAGE分离蛋白质的原理（选）
–电荷效应
–浓缩效应
?快慢离子效应
?凝胶浓度差效应
–分子筛效应
27、镍离子层析方法属于亲和层析
八）、蛋白质结构测定
28、Western Blot基本原理与步骤
基本原理:在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
一般流程: 蛋白样品的制备、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、抗原抗体显色反应。具体步骤：转膜、封闭、一抗杂交、二抗杂交、底物显色
29
30
(1) 核有自旋(磁性核)
(2)外磁场,能级裂分;
(3)照射频率与外磁场的比值ν0 / H0 = γ / (2π )
——外加射场的频率与原子核自旋进动的频率相同
31、电子显微技术的最大缺点是分辨率较低
谱图中化合物的结构信息
（1）峰的位移(δ )：每类质子所处的化学环境，化合物中位置；
（2）峰的裂分数：相邻碳原子上质子数；
（3）偶合常数(J)：确定化合物构型。
（4）峰的数目：标志分子中磁不等性质子的种类，多少种；
（5）峰的强度(面积)：每类质子的数目(相对)，多少个；
不足之处：
仅能确定质子（氢谱）。
九）、蛋白质组学
32、HPP里程碑
?两谱：蛋白表达谱、修饰谱
?两图：蛋白连锁图、亚细胞定位图
?三库：样本库、抗体库、数据库
33、蛋白质组研究整体技术的特点：规模化、通量化、自动化
技术目标（要求）：有效分离、准确鉴定、合理分析
34、蛋白质组学研究的手段
?蛋白质组研究的核心──用于分离的双向电泳(2 -DE)
?蛋白质组技术的支柱———鉴定技术(Identification)
?蛋白质组研究的百科全书———数据库(database)
35、生物质谱技术
?原理:将样品离子化,根据不同的质量和电荷差
异确定分子量的技术
?应用:蛋白质序列分析
蛋白质修饰分析
?最重要的鉴定技术（支柱）
36、质谱仪组成：进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑、数据分析
系统
离子源
?电子碰撞
?快原子轰击
?电喷雾离子化
?基质辅助激光解吸附
质量分析技术
?飞行时间质谱time-of-flight, TOF
?离子阱质谱iron trap, IT
?四极杆质谱quaddrupole, Q
?傅立叶变换离子回旋共振质谱fourier transform ion cyclotron, FrICR
十）、蛋白质芯片、蛋白质结构预测及表面展示
37、生物芯片的标准（多选）
有规则（ordered）
显微尺度(microscopic)
平面的(planar)
特异性地吸附(specific)
38、目前常用的生物芯片制作方法：（选）
接触点样法、喷墨法、原位合成法（主要是美国Affymetrix公司开发的）
39、探针的标记：（选）
荧光标记（常用Cy3绿色、Cy5红色）：cy3标记case，cy5对照，表达上调则偏绿，
表达下调则偏红，表达不变则黄色。标记相反则结果相反。
40、酵母双杂交系统的组成（选）
酵母双杂交的宿主菌株（酵母菌株）、酵母双杂交的载体质粒（DB载体质粒
、AD载体质粒）
41、诱饵与猎物分别与什么结合（选）
DNA结合结构域(DB)和转录激活结构域(AD),
与DB 融合的蛋白称为“诱饵”(bait)，
与AD融合的蛋白称为“猎物”(prey)。
42、蛋白质结构预测的方法（Prediction Methods）（选）
1）、二级结构的预测放法
?统计学方法（Statistical method ）
?Chou-Fasman 算法（Chou-Fasman）
?GOR方法（GOR method）
?人工神经网络法（Neural network models）
?最邻近算法/同源分析法（Nearest neighbor methods）
?基于所学知识的方法（Knowledge based method）
?Lim-立体化学方法（Lim）
?cohen 法（cohen）
?杂交系统方法（Hybrid system method）
2）、三级结构的预测方法
43、展示系统分类（选）
基于细胞的展示系统：噬菌体展示系统、细胞表面展示系统
展示系统
无细胞展示系统：核糖体展示系统、mRNA展示系统
最先使用的表面展示技术是噬菌体展示技术，在噬菌体展示技术中用的是丝状噬菌体。
蛋白质工程重点
一、名词解释 1、蛋白质工程（Protein Engineering）——以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过化学、物理和分子生物学的手段进行基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求的工程技术。 2、结构模体（supersecondary structure，motif）——介于蛋白质二级结构和三级结构之间的空间结构,指相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，排列形成规则的、在空间结构上能够辨认的二级结构组合体，并充当三级结构的构件（block building），其基本形式有αα、βαβ和βββ等。 3、结构域（domain）——是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体。 4、蛋白质的折叠(protein folding)——从体内新生的多肽链或体外变性的多肽链的一维线性氨基酸序列转化为具有特征三维结构的活性蛋白质的过程。 5、分子伴侣（molecular chaperone）——一大类相互之间没有关系的蛋白质，它们具有的共同功能是帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装和卸装，但不是这些结构在发挥其正常的生物学功能时的永久组成部分。 6、晶胞(Unit cell)——空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。 7、核磁共振现象（nuclear magnetic resonance ，NMR）——指核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频辐射（radio frequency, RF）的物理过程。 8、化学势（位）移（）——在有机化合物中，各种氢核周围的电子云密度不同（结构中不同位置）共振频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。 9、耦合常数（J）——由于自旋裂分形成的多重峰中相邻2峰间的距离。用以表征2核之间耦合作用的大小，单位赫兹Hz。 10、蛋白质组（proteome）——一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的全套蛋白质。
蛋白质组学生物信息学分析介绍
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
酶与蛋白质工程实验及复习题
实验部分 稀释倍数意思就是你得到的最后的活性要换算成最初样品的活性。比如粗酶液是30ml，再取1ml稀释到10ml（最后用移液枪取10ul做微量活性测定）。那么稀释倍数就是 10/1*30=300。 公式里面就有两个体积，一个是反应总体积，一个是酶样液体积。反应总体积是指你最后测定时候，每个试管最终的体积3 ml酶样液体积是你加入试管的SOD的体积，比如微量法就是0.01ml(10ul)。 样液速率是30秒的，需乘以2。 理论部分复习题大纲 （给大家的只是复习的大纲，还有一些由于时间仓促，上课时强调的重点内容有些没在这个大纲上，但仍然是考试内容，希望大家能认真复习。） 一．名词解释8个，每题3分 1.酶工程 2.凝胶过滤层析 3.离子交换层析 4.亲和层析 5.酶的生产 6.酶的改性 7.生物酶工程 8.化学酶工程 9.酶分解代谢物阻遏作用 10.酶生物合成的诱导作用 11.酶生物合成的反馈阻遏作用 12.密度梯度离心 13.等密度梯度离心 14.酶分子修饰： 15.酶大分子结合修饰 16.酶侧链基团修饰 17.酶反应器 18.流化床反应器鼓 19.泡式反应器 20.定点诱变技术 21.蛋白质工程 二．填空每空1分10分 1.化学酶工程研究的主要内容是(酶的制备)、(酶的分离纯化)、（酶与细胞的固定化技术）、(酶分子修饰)、（酶反应器）和(酶的应用)。 2.在酶的发酵生产中，为提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是（延续合成型）。 3.常用的酶或蛋白质干燥的方法有真空干燥、(冷冻干燥)、气流干燥、（喷雾干燥）和吸附干燥。
4.（葡萄唐氧化酶）是一种有效地食品除氧保鲜剂。 5. 通过检测（）的酶活性，可以诊断癌症。 6.（X-射线衍射法）是测定蛋白质晶体结构的极其重要方法。 7.确定蛋白质分子在溶液中结构信息的方法是（核磁共振技术）。 8.酶反应器的操作方式可分为（）反应器、（）反应器和流加分批式反应器。 9.细胞固定化的方法有（吸附法）和（包埋法）。 10．1982年，Thomas R.Cech等人发现四膜虫细胞的26S rRNA前体具有自我剪接功能，将这种具有催化活性的天然RNA称为( )。 11．酶的生产方法主要有（），（）和（）。 12 微生物发酵产酶中使用的两种培养基是（）和（）。 13 针对胞内酶的分离提取，细胞破碎的方法有（）、物理破碎、（） 和（）。 14.利用有机溶剂沉淀法分离酶或蛋白质时常用有机溶剂有丙酮、（）、 （）和（）。 15.离子交换剂由（）、（）和（）构成。 16.凝胶过滤层析中常用的凝胶材料有（）、（）和 （）。 17. 常用的蛋白质序列数据库英文简写：（）和（）。 18.1926年,美国康乃尔大学的Sumner博士从刀豆中提取出( )结晶，并证明 具有蛋白质的性质。 19．常见产酶微生物种类（）、（）、（）和（）。 18. 酶的主要提取方法有酸提取法、（）、（）和（）。 19. 吸附层析中常用的强吸附剂：（）和（）。 20．离子交换层析中常用的阳离子交换基团是（）和 （）。 21．典型的双水相萃取系统：（）和（）。22. 常用的基因组数据库英文简写：（）、（）和 （）。 23．过滤分离的种类有、、和。 24．根据酶分子大小、形状的不同可选择的分离方法有、 或。 25．酶的固定化方法有、、和。 26. 固体发酵产酶的方法有、和。 27. 密度梯度离心常用的梯度介质是和。 28. 凝胶过滤层析中凝胶可分为凝胶、凝胶和凝胶。 29. 典型的双水相萃取系统：和。 30. 根据酶分子电荷性质的不同可选择的分离法是或。 31. 酶制剂有四种类型即液体酶制剂，酶制剂，酶制剂和 酶制剂。 32．CO2超临界萃取的临界温度，临界压力。 33.1902年，亨利根据蔗糖酶催化蔗糖水解的实验结果，提出（）学说。 34.1960年，雅各和莫诺德提出了（）学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。三．选择（5个，每个2分）
融合蛋白表达系统
研究者们在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究最理所当然的工作就是表达，即：有目的性地合成外源基因产物。在重组 DNA技术的发展早期，人 们认为在基因的前面有一个强启动子和一个起始密码子就足以在大肠杆菌中获 得很好的表达。随后，认识到获得有效的翻译所需的条件要复杂得多，除了要有强启动子和起始密码子外，良好的表达尚需编码目的蛋白的mRNA中含有核糖体结合位点，表达水平受密码子喜好程度的影响，也受编码序列中其他目前尚未明了的因素影响。通过改变起始密码子前端的序列，或者在不改变蛋白质序列的条件下利用密码子的简并性改变5’末端编码序列往往有助于解决问题。 通常，两个基因之间的融合表达能更快地解决这些问题。在这种方式中，目的基因被引入某个高表达蛋白序列(fusion tag)的3’末端，比如大肠杆菌的一段 序列，或者任一可在大肠杆菌中高度表达的基因，它提供良好表达所必需的信号，而表达出的融合蛋白的N末端含有由fusion tag编码的片段。fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分。比如6x His Tag、β-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白以及硫氧还蛋 白(Trx)融合蛋白等。 由于利用tag 选择融合表达是为了简化重组一是fusion tag位于目的蛋白的N端，这时tag 帮助提高目的蛋白的表达，缺点是纯化的表达产物中可能会有不完整的目的蛋白，原因是在翻译过程中意外中断的少量(C端)不完整的表达产物会一起被纯化。另一是fusion tag位于目的蛋白的C端，这可以保证只有完整的表达产物才会被纯化。当目的蛋白的功能区位于N端时，fusion tag位于C端可能减少对其功 能的影响，反之亦然。 进行融合蛋白的表达经常会遇到三个问题，它们是：表达蛋白的溶解性、稳定性和fusion tag的存在。前两个问题在融合蛋白表达系统和非融合蛋白表达系统都会遇到，而第三个问题是融合蛋白系统所独有的。 裂解融合蛋白以除去fusion tag 为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。早期已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)、BNPS-3-甲基吲哚(Trp↓)、羟胺(Asn↓Gly)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使该法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。其中有用的酶有：Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶。所有这些 酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。而酶解法存在成本高(这些蛋白酶价格一般都相当昂贵)，反应时间长等问题，更重要的是蛋白酶本身不可避免地会混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述
蛋白质组学蛋白质组学相关技术及发展文献综述 蛋白质组学相关技术及发展文献综述张粒植物学211070161概念及相关内容1994年澳大利亚Macquaie大学的Wilkins和Williams等在意大利的一次科学会议上首次提出了蛋白质组proteome这个概念该英文词汇由蛋白质的“prote”和基因组的“ome”拼接而成并且最初定义为“一个基因组所表达的蛋白质”1。然而这个定义并没有考虑到蛋白质组是动态的而且产生蛋白的细胞、组织或生物体容易受它们所处环境的影响。目前认为蛋白质组是一个已知的细胞在某一特定时刻的包括所有亚型和修饰的全部蛋白质2。蛋白质组学就是从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态了解蛋白质之间的相互作用与联系提示蛋白质的功能与细胞的活动规律。2蛋白质组学的分类蛋白质组学从其研究目标方面可分为表达蛋白质组学和结构蛋白质组学。前者主要研究细胞或组织在不同条件或状态下蛋白质的表达和功能这将有助于识别各种特异蛋白3目前蛋白质组学的研究在这方面开展的最为广泛其运用技术主要是双相凝胶电泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技术以及图像分析系统当对感兴趣的蛋白质进行分析时可能用到质谱。由于蛋白质发生修饰后其电泳特性将发生改变这些技术可以直接测定蛋白质的含量并有助于发现蛋白质翻译后的修饰如糖基化和磷酸化等4。结构蛋白质组学的目标是识别蛋白质的结构并研究蛋白质间的相互作用。近年来酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用时常用的方法同时研究者也将此方法不断改进5。有研究者最近发现在研究蛋白质相互作用时通过纯化蛋白复合物并用质谱进行识别是很有价值的4。3蛋白质组学相关技术目前蛋白质组学研究在表达蛋白质组学方面的研究最为广泛其分析通常有三个步骤第一步运用蛋白质分离技术分离样品中的蛋白质第二步应用质谱技术或N末端测序鉴定分离到的蛋白质第三步应用生物信息学技术存储、处理、比较获得的数据。3.1蛋白质分离技术这类技术主要是电泳其中应用最多的是双向电泳技术其他还有SDS-PAGE、毛细吸管电泳等。除了电泳外还有液相色谱通常使用高效液相色谱HPLC和二维液相色谱2D-LC。另外还有用于蛋白纯化、除杂的层析技术、超离技术等。 3.1.1双相凝胶电泳双相凝胶电泳two-dimensional gel elec—trophoresis2DE这是最经典、最成熟的蛋白质组分离技术产生于20世纪70年代中叶但主要的技术进步如实验的重复性、可操作性蛋白质的溶解性、特异性等是在近lO年取得的。它根据蛋白质不同的特点分两相分离蛋白质。第一相是等电聚焦IEF电泳根据蛋白质等电点的不同进行分离。蛋白质是两性分子根据其周围环境pH可以带正电荷、负电荷或静电荷为零。等电点pI是蛋白质所带静电荷为零时的pH周围pH小于其pI时蛋白质带正电荷大于其pI时蛋白质带负电荷。IEF时蛋白质处于一个pH梯度中在电场的作用下蛋白质将移向其静电荷为零的点静电荷为正的蛋白将移向负极静电荷为负的将移向正极直到到达其等电点如果蛋白质在其等电点附近扩散那么它将带上电荷重新移回等电点。这就是IEF的聚焦效应它可以在等电点附近浓集蛋白从而分离电荷差别极微的蛋白。pH梯度的形成最初是在一个细的包含两性电解质的聚丙烯酰胺凝胶管中进行。在电流的作用下两性电解质可形成一个pH梯度。但由于两性电解质形成的pH梯度不稳定、易漂移、重复性差80年代以后研究人员研制了固定pH梯度的胶条IPG。此种胶条的形成需要一些能与丙烯酰胺单体结合的分子每个含有一种酸性或碱性缓冲基团。制作时将一种含有不同酸性基团的此分子溶液和一种含有不同碱性基团的此分子溶液混合两种溶液中均含有丙烯酰胺单体和催化剂不同分子的浓度决定pH的范围。聚合时丙烯酰胺成分与双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝胶。第二相是SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE根据蛋白质的分子量不同进行分离。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶中进行。SDS是一种阴离子去污剂它能缠绕在多肽骨架上使蛋白质带负电所带电荷与蛋白质的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质分子量的对数与它在胶中移动的距离基本成线性关系。SDS-PAGE装置有水平和垂直两种形式垂直装置可同时跑多块胶如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II系统可同时跑12块胶提高了操作的平行性。经过2DE
融合蛋白定义
融合蛋白 科技名词定义 中文名称：融合蛋白 英文名称：fusion protein 定义1：融合基因的表达产物，或通过生物学和化学方法融合的两个或两个以上蛋白质。 所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科） 定义2：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科） 定义3：由两段或多段基因序列串联形成的融合基因表达所产生的蛋白质。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录
融合蛋白 - 技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进 行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。 技术特点 融合蛋白 融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌) 也可在真核细胞中进行表达。 原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。 技术内容 构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有： 1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。 2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。 3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。 4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。 技术关键 在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列( Linker )，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 一般来说， 3-5 个氨基酸的Linker 可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋
蛋白质工程的现状发展及展望
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
蛋白质工程(1)
蛋白质工程：以蛋白质的结构与功能为基础，利用基因修饰或基因合成而改造现存蛋白质或组建新型蛋白质的现代生物技术，是基因工程的深化和发展。 蛋白质结构：一级结构：蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。 二级结构：一段连续的肽单位借助氢键排列成具有周期性结构的构象。 三级结构：蛋白质多肽链在各种二级结构的基础上，进一步盘曲折叠形成具有一定规律的三维空间。 四级结构：由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链组成的蛋白质的寡居蛋白，通过肽链间的次级键相互结合形成的空间结构。 蛋白质超二级结构：相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成规则排列的组合体，以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合体称为超二级结构，或结构模体。 结构域：指二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体。结构域是蛋白质折叠中的一个结构层次，介于超二级结构和三级结构之间，是蛋白质三级结构的基本单位，也是蛋白质功能的基本单位。 蛋白质变性：天然蛋白质分子受到某些物理因素（热、紫外线、高压）或化学因素（有机溶剂、脲、胍、酸、碱）的影响，引起蛋白质天然结构的破坏，导致生物活性的降低或完全丧失。 蛋白质折叠：蛋白质因所含氨基酸残基的亲水性、疏水性、带正电、带负电……等等特性通过残基间的相互作用而折叠成一立体的三级结构。 蛋白质定向进化：在实验室中模仿自然进化的关键步骤-突变、重组和筛选，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效地改造蛋白质，使之适于人类的需要。 蛋白质的分子设计：蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案，确保获得比天然蛋白质性能更加优越的新型蛋白质。 第二遗传密码：氨基酸顺序与蛋白质三维结构之间存在着对应关系，人们称之为第二遗传密码或折叠密码。蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质一级结构发生改变的过程。 蛋白质组：基因组表达全部蛋白质及其存在方式，或基因组、一个细胞或一种生物表达的所有蛋白质。 蛋白质组学：定量检测蛋白质水平上的基因表达，从而揭示生物学行为，以及基因表达调控的机制的学科。双向电泳：是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。 蛋白质芯片：也叫蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 噬菌体表面展示技术：噬菌体展示技术是将外源基因或一组一定长度的随机寡居核苷酸片段克隆到特定的表达载体内，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。 基因工程抗体：利用基因重组技术对编码抗体的基因按不同需求进行加工改造和重新装配，引入适当的受体细胞，由其编码产生出预期的抗体分子。 抗体酶：通过改变抗体与抗原结合的微环境，并在适当的部位引入相应的催化基团，所产生的具有催化活性的抗体。既有抗体的高度选择性，又有酶的高效催化效率。 单克隆抗体：由一种抗原决定簇激活，并具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体。
融合蛋白标签
在蛋白质功能及结构研究过程中，研究的首要任务就是利用多种方法获得纯化的具有完整结构及生物学功能并能够正确折叠的高度纯化蛋白质。除了蛋白质的研究，具有特定生物活性的高价值蛋白质的生产也需要对蛋白质产品进行纯化。因此，科研人员和工业生产往往大量采用多种多样的表达系统来获得高表达的蛋白质，对其纯化后进行研究或加工，这些表达系统包括原核表达系统、酵母菌表达系统、昆虫动物细胞表达系统、真核细胞表达系统等。 如何将系统中表达的目标蛋白质与其他蛋白分离，一直是表达纯化中的一个重点。为了克服从复杂样品中纯化单一蛋白质这种困难，科学家利用生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别某种特定物质并与该物质分子特异性结合的能力，利用生物分子间的这种特异性结合能力而形成的亲和纯化技术。亲和标签纯化技术已广泛应用于蛋白质，特别是重组蛋白的分离纯化中。在重组蛋白的亲和纯化中，利用基因工程技术，将经过改造优化的亲和标签与目标蛋白融合表达，通过一步简单快速的亲和层析，直接获得纯度较高的重组融合蛋白，已成为重组蛋白纯化的一个通用方法，具有结合特异性高、纯化步骤简便、纯化条件温和、适用性广泛等优点，为蛋白质的有效纯化提供了一条解决的途径，广泛应用于蛋白质结构与功能的研究及重组蛋白纯化工艺的开发中。 自从20世纪70年代中期融合标签技术出现以来，亲和标签已成为一种重组蛋白纯化十分有效的工具，具有结合特异性高、纯化条件温和、纯化步骤简便、适用性广泛等显著优势。通常，亲和标签定义为对特定的生物或化学配基具有高度亲和力的一段氨基酸序列。到目前为止，已经出现了种类众多、功能各异、用途多样的亲和标签，极大地促进了对重组蛋白的有效纯化。 根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类：一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等；另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP等。 短肽标签： His-tag：His标签是目前高通量蛋白纯化最普遍使用的亲和标签，广泛用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His标签一般为5~15个组氨酸，被认为是重组蛋白纯化的首选标签，具有以下优点：（1）位于目标蛋白Ｎ端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，利于蛋白的表达；（2）His标签几乎
蛋白质组学及其主要技术
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
蛋白质营养效价的评定方法-王统石
蛋白质营养效价的评定方法 摘要：理想蛋白质(IP)或氨基酸平衡模式（IAAP）是评价饲料蛋白生物学效价的重要指标。根据其基本概念，提出了估计猪、禽IP需要量及饲料IP水平的估计方法，在此基础上提出了度量饲料氮基酸平衡程度的新型化学指数—氨基酸平衡指数(IAA。应用IP和IAAB实际结果表明，饲料IP及IAAB指标能够比较客观地评定饲料蛋白质的营养价值。 关键词：IP IAAP评定方法应用 蛋白质资源的开发利用和低蛋白饲粮的研究，是为了更好地利用和提高蛋白质的生物学价值。蛋白质的营养价值取决于其质量和数量两个方面；蛋白质转化效率则主要取决于各种必需氨基酸的含量、平衡性及其必需氨基酸与非必需氨基酸的比例关系。因此，如何从质量和数量两个方面客观评定饲料蛋白质的营养价值，以期最有效地利用现有蛋白质饲料资源、提高蛋白质转化效率便成为各国学者研究的热点和难点问题。畜禽营养学理论研究大量试验结果也表明，粗蛋白质指标不能客观地反映饲料蛋白质的营养价值或转化效率。通过对氨基酸营养的认识，人们了解到蛋白质营养价值变化的根本原因：蛋白质不是整体消化，而是被分解成小肽或氨基酸吸收利用的，使用纯合日粮或低蛋白质平衡氨基酸日粮，并不一定能使动物达到最佳生产性能。蛋白质生物学价值不具备可加性，在实践上很难依此配制日粮。由于不同氨基酸蛋白质配合后的互补作用，以及添加限制性氨基酸可使日粮其它氨基酸平衡性得到改变的事实，说明蛋白质生物学价值不具备理想的重现性，只能在特定的（如基础日粮为无氮日粮时）才能重现。氨基酸可利用率的可加性重现性，因此能在日粮或非常规饲料评价中成功表达，受到学者认同，这是是蛋白质营养走向氨基酸营养的重要原因。 营养价值高的蛋白质在氨基酸组成上，与采食该种蛋白质动物体蛋白氨基酸构成基本相似，由此提出了生长动物氨基酸需要量大体可由体蛋白氨基酸组成来确定的理想蛋白质新理论。近来，国内外学者相继提出“理想蛋白质”(IP)的概念，并试图利用IP氨基酸平衡模式（IAAP）评定饲料蛋白质的营养价值。所谓理想蛋白质，用来描述饲料蛋白质品质，指日粮中各必需氨基酸(EAA)的组成和比例与动物的需要相吻合，并能在动物体内实现最大沉积率的饲料蛋白质，即为一种其营养价值不可能通过改变其氨基酸组分间的相互比例而得到提高的蛋白质，也就是是一种各种氨基酸以及供给合成非必需氨基酸的氮源之间具有最佳平衡的蛋白质；此时，各种必需氨基酸及合成非必需氨基酸的氮源对猪、禽具有相 同的限制性，故日粮蛋白质的转化效率最佳。理想氨基酸模式(IAAP)，指理想蛋白质各必需氨基酸的组成相对于赖氨酸的比例关系。IP或IAAP是完全按照动物维持、生产的需要提供适时的各种氨基酸。且所有氨基酸都摆在同样重要的位置来考虑，都可能是第一限制性氨基酸。目前，关于IP的研究主要集中在推荐猪、禽IP氨基酸平衡模式及在IP氨基酸平衡模式指导下配制猪、禽日粮两个方面，但对如何利用IP氨基酸平衡模式评定饲料蛋白质营养价值，尤其是猪、禽IP需要量及饲料IP水平估计方法等却研究得较少。 1．IP或IAAP的概况 理想氨基酸模式(IAAP)首先由ARC(1981)提出，随后美国NRC(1988)、法国AEC(1993)、加拿大PSCI(1995)等在制定猪氨基酸需要量时，相继采纳了理想蛋白质的概念。目前经过10多年的研究，理想蛋白质的概念在生产中得到广泛应用，已经发展成为氨基酸平衡饲粮技术。尤其在现代化养猪生产中,按照“IP”理论配制日粮是相当重要的。 在各种IAAP中，ARC，NRC，AEC和PSCI推荐的模式均以饲粮总氨基酸为基础，而有
基于质谱的蛋白质组学分析.
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2. 生物质谱技术
(整理)蛋白质组学实验方法
2、蛋白质分离的双向电泳过程 2．1溶液配制 常用水化上样缓冲液 （Ⅰ） 尿素 8M 4.805g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml （Ⅱ） 尿素 7M 4.2g 硫脲 2M 1.52g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml (Ⅲ) 尿素 5M 3.0g 硫脲 2M 1.52g SB3-10 2% 0.2g CHAPS 4% 0.4g DTT 65Mm 0.098g Bio-Lyte 0.2%(w/v) 50μl（40％） 溴酚蓝 0.001％ 10μl（1％溴酚蓝） MilliQ水定容至100ml 分成10小管，每小管1ml,-80℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液母液 尿素 6M 36g SDS 2% 2g Tris-HCl 0.05M pH8.8 3.3ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl) 甘油 20％ 20ml
MilliQ水定容至100ml 分装成10管，-20℃冰箱保存。 胶条平衡缓冲液Ⅰ 胶条平衡缓冲液母液 10ml DTT 0.2g 充分混匀，用时现配。 胶条平衡缓冲液Ⅱ 胶条平衡缓冲液母液 10ml 碘乙酰胺 0.25g 充分混匀，用时现配。 低熔点琼脂糖封胶液 低熔点琼脂糖 0.5％ 0.5g Tris 25mM 0.303g 甘氨酸 192mM 1.44g SDS 0.1% 1ml(10%SDS) 溴酚蓝 0.001％ 100μl(1% 溴酚蓝) MilliQ水定容至100ml 加热溶解至澄清，室温保存。 30％聚丙烯酰胺贮液 丙烯酰胺 150g 甲叉双丙稀酰胺 4g MilliQ水 500ml 滤纸过滤后，棕色瓶4℃冰箱保存。 1.5mol/L Tris碱pH8.8 Tris碱 90.75g MilliQ水 400ml 用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml, 4℃冰箱保存。 10% SDS SDS 10g
蛋白质表达的性质
蛋白质表达的性质 关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网 1.所需要的蛋白表达量如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。 2.表达蛋白的可溶性在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。 3.表达蛋白的稳定性在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。 4.蛋白质分子量在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD或者大于100kD的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST、Trx、MBP等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD则建议用6×His、HA等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白(truncated protemin)，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。 5.是否需要活性蛋白如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。
蛋白质工程教学设计
蛋白质工程教学设计 教学内容:蛋白质工程 教学时间:1.5课时 教学对象:小教08数学 讲课者:王约纳29 一、教学目标: 1、掌握蛋白质和蛋白质工程的概念、功能和应用了,解蛋白质工程的原理。 2、尝试运用逆向思维分析和解决问题。 二、教学重难点: (1)蛋白质工程的原理。 (2)蛋白质工程的应用 三、教学方法 教授法、启发式教学 四、教学过程: (一)什么是蛋白质 1.蛋白质的概念
蛋白质是对生命至关重要的一类生物大分子,各种生命功能、生命现象、生命活动都和蛋白质有关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调节等许多方面,起着关键的作用。如血浆蛋白质、纤维状蛋白质、酶蛋白质等。 2.生活中的蛋白质 展示各种生活中蛋白质的图片。还有些什么? 3.蛋白质的功能 蛋白质是一类重要而复杂的生物大分子,它广泛地存在于所有生物界的机体之中,具有许多重要的作用: ①酶:构成生物体新陈代谢的几乎全部的化学反应都是在活性蛋白质-酶的催化下进行的; ②抗原抗体:高等动物的免疫反应,也主要是通过蛋白质即抗原和抗体来完成的;,免疫球蛋白 ③运动:运动时的肌肉收缩靠的是某些蛋白质的相互作用来完成的;鞭毛、肌肉蛋白 ④呼吸:运输氧和二氧化碳的是血红蛋白; ⑤激素:具有代谢和调节功能的是多种蛋白质激素。 蛋白质的应用 ①蛋白质是人类赖以维持生命的重要营养来源之一。人们需要从各种肉、蛋、奶、豆类等主要食品中获得所需的蛋白质营养。
②用蛋白质诊断和治疗某些疾病。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶用于帮助消化,治疗某些消化不良性疾病;胰岛素用于治疗严重的糖尿病;转氨酶作为肝病变的指标等。 ③食品工业和轻工业中主要应用蛋白质或利用蛋白质的性质制造各种产品。 例如,酿造业要用蛋白酶来增加酱油的鲜味等。用于人类衣着的羊毛、纺织品和皮革主要组成是蛋白质。 4.蛋白质的结构 ①氨基酸是蛋白质的基本结构单位,各种氨基酸之间通过肽键彼此按直线 形头尾相连,构成不同长短的肽链。 ②肽链又以一定方式折叠盘绕成独特的空间结构,这时才产生具有生物活 性的天然蛋白质。 ③多肽链的折叠可分为四种不同层次的结构。 (二)蛋白质工程的崛起 1、蛋白质工程的概念 是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求 这是一门从改变基因入手,定做新的蛋白质的技术。故有人将其称为“第二代基因工程”
蛋白质组学研究进展
基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中, 已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥（T. Arabidopsis）等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析。线虫(C.elegans)的基因组DNA测序工作已基本完成。规模更为庞大的人类基因组计划预期在本世纪初(2003～2005年)也将完成全部基因组DNA的序列分析。这些进展是非常令人振奋的。但是也随之产生了新问题。大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。不仅如此, 蛋白质作为生物功能的主要载体，拥有自身特有的活动规律，在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰、转运定位、结构变化、蛋白质与蛋白质间、蛋白质与其他生物大分子的相互作用等，也就是说, 一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。因为基因组学有这样的局限性，促使人们从整体水平上探讨细胞蛋白质的组成及其活动规律。 为了充分了解和全面认识生命活动的奥秘，90年代中期，在人类基因组研究计划的基础上，萌发了一门新兴的学科¾蛋白质组学(proteomics)，即从蛋白质组的水平进一步认识生命活动的机理和疾病发生的分子机制。科学家们预测，随着人类基因组全部测序工作的完成，21世纪生命科学的研究重心将从基因组学转移到蛋白质且学，生命科学领域内一个崭新的时代¾蛋白质组时代即将开始。
1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上, 它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。早期定义为：微生物基因组表达的整套蛋白质，在多细胞微生物中，整套蛋白质指一种组织或细胞表达的蛋白质，后来定义为：一个基因组所表达的蛋白质。但是，从基因表达的角度来看，蛋白质组的蛋白质数目总是少于基因组的基因数目。从蛋白质修饰的角度来看，蛋白质组的蛋白质数却多于其相应的ORF数目，因为mRNA的剪切和编辑可使一个ORF产生数种蛋白质，蛋白质翻译后的修饰，如糖基化、磷酸化同样增加蛋白质的种类，氨基酸序列一致的一级结构在一定条件下可以形成功能完全不一样的具有不同空间结构的蛋白质，如朊病毒。故"蛋白质组内蛋白质数目要多于基因组内的基因数目"。 蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化、翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。