抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则(中文版)

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则

摘要：

几乎所有的生物制药产品都会引起一定的抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）反应，抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。在人体内，抗药抗体通常不会引起明显的临床反应。但是对于某些治疗性蛋白质，抗药抗体反应能引起各种临床的不良反应，包括温和事件及严重不良事件。临床前研究表明，抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。因此治疗性蛋白质的免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构的注意。为了评估生物药物分子的免疫原性，以及将实验结果与临床事件联系起来，在临床前研究和临床研究中，很有必要开发可靠的能够有效评估抗药抗体反应的实验方法。这里方法学验证显得尤为重要，并且方法学验证是药物上市申请必不可少的。现行的监管文件对于免疫分析方法的验证的指导相当有限，特别是缺乏有关免疫原性分析方法的验证的指导。因此，本文对抗药抗体免疫分析方法的验证提供科学的建议。在现有的关于生物分析的规范性文件的基础上加入独特的性能验证。笔者建议采用实验和统计学的方法进行免疫分析的方法学验证。这些建议被视为最佳的例子，旨在促进整个医药行业形成一个更加统一的抗体检测方法。

1．简介：

生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸，一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达，比常规的小分子药物更大（一般大于1~3KD）。由于以上特性，生物制药产品引起免疫反应的潜力更大。生物制药的免疫原性与产品的内在因素（种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质和制剂）、外在因素（给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量）、患者因素（自身免疫性疾病、免疫抑制、和替代疗法）相关。

抗药抗体反应可能会导致严重的临床症状，包括过敏、自身免疫和不同的药代动力学特征（例如，药物中和、生物分布异常和药物清除率增强等均可能会使

药物的的疗效发生改变）。药物引起的免疫反应是药物安全性和有效性的重要指标，这也是监管机构、生产企业、临床医生和患者共同关注的。因此，美国食品药品监督管理局以及欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家的监管机构均要求通过药理学或毒理学相关的方法对抗药抗体进行评估。免疫原性与临床症状之间的相关性的研究依赖于临床前研究和临床研究中对于抗药抗体的客观检测和表征。因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当的开发及验证。已有出版物提供了关于抗药抗体检测和表征的策略、方法开发及优化等方面的指南。方法学验证是对分析方法的评价，通过特定的实验室方法表明采用的分析方法适用于相应的检测要求。具体到抗药抗体的检测方法，验证就是指证明该方法能可靠的（例如一致性和重复性）在复杂的生物基质（血清或血浆）中检测出低量的药物特异性抗体。方法学验证应该通过预先研究阶段和研究阶段两个阶段进行，预先研究阶段是指在分析样品之前的工作，研究阶段是指样品的分析工作，预先研究阶段和研究阶段对于表明分析方法的有效性和可控性同等重要。本文主要介绍抗药抗体免疫分析方法验证的主要性能特征，推荐方法学验证相关的方法和措施。本指南应当被视为最佳实践范例，考虑到具体实际分析方法时，在保持科学合理性和客观性的情况下，也可以采取替代方法。若采用替代方法，建议与监管机构进行充分讨论。以细胞功能为基础的中和抗药抗体生物检测和细胞介导的免疫分析不在本指南的讨论范围内。

2.方法

2.1 抗药抗体检测

临床和非临床研究通常是通过对治疗引起的抗药抗体反应的检测和表征来评估药物的免疫原性。目前可通过多种方法可用于抗药抗体的检测，包括酶联免疫法（ELISA）、放射免疫检定法（RIA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等离子体共振（SPR）、电化学发光法（ECL）。每一种检测方法均有其优点和局限性，在最近的文章中已进行过讨论[8,14]。不管是采用何种方法，在方法开发和优化后均应进行正式的方法学验证，以保证该方法适合相应的检测要求。因此可以预测，本指南的验证建议适用于大部分的抗药抗体免疫检测。研究人员应根据检测系统的特点确定合适的方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体的检测和表征通常包括四种不同类型的方法。抗药抗体检测试验通常包括筛选试验和特异性确证试验，表征试验通常包括抗体滴定和中和抗体检测[10]。应用到具体研究样本时，抗药抗体分析试验需要两个关键决策参数，分别为筛选试验的筛选临界点（screening cut point）和特异性确证试验的特异性临界点（specificity cut point）。筛选临界点有助于抗药抗体检测结果的分类，高于筛选临界点为活性样品（活性样品通常为潜在阳性样品），低于临界点为无活性样品。活性样品通过特异性确证试验（如竞争性药物抑制信号通路）检测是阳性（特异性活性）还是阴性（非特异性活性）。特异性临界点为抑制信号通路所需的样品量，也就是具体药物的抗药抗体，需要通过试验确定。

抗药抗体的检测方法通常是非定量试验（有时是半定量试验），因为没有可用的标准化的物种特异性的抗药抗体作为校正标准品[15]。阳性对照一般都是内部开发的（例如单克隆抗体或高免血清的多克隆抗体），不可能将受试者检测到的所有抗药抗体作为阳性对照。如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平，那应该证明标准品和试验样品的平行性，以确定样品的浓度的准确性[8,10]。若未证明样品与标准品间的平行性，则准确性是可疑的。滴定法是另一种评估抗体水平的方法，该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性。然而，值得注意的是已有研究表明，滴定法适用于抗体水平的评估。几十年来，临床上感染、自身免疫疾病的诊断和治疗以及预防接种等都采用这一方法[16~22]。滴定法比较抗药抗体反应

更为简便且所需的验证工作更少，因为其不需要再对不同产品的抗药抗体与标准品间的平行性进行详细描述与证明。此外质量单位法每当标准品品改变时均需要进行重新验证。综上所述，两种方法都无法提供准确的定量数据。因此，赞助商建议采用相对浓度（质量单位）或滴度表示抗药抗体水平。某些监管机构会更倾向于使用滴度单位。滴度是仍能产生阳性结果的最大稀释倍数的倒数。

在方法的开发和优化阶段，应先确定方法并进行记录，例如选择所需的试剂、最佳浓度、预期样品所需的最大稀释倍数等。这些需要研究人员在预先研究阶段进行简单或重复确证。本文假定以下属性在验证之前已被确证：免疫分析方案及方法设计，分析基质的类型，最大稀释倍数（MRD）、试剂的最佳浓度、酶标板的均匀性评估（如位置的影响、漂移等）。监管机构可能会要求提供相关的数据

支持。在方法的开发和优化阶段，通过对对照品的检测，对方法的变异性有一个初步的认识。

2.2 统计学的应用

降低验证过程中的主观作用是本文的重点之一。为了确保实验的客观性必须依靠于统计手段。由于大多数研究者无法获得统计学家的服务，本文提供了简单且足够严格和有效的统计学方法。所涉及的统计计算都可以采用商业统计软件进行计算，计算过程不需要经验丰富的统计学家。然而，如果有统计学家协助进行验证实验设计和数据处理的话，统计学的应用可能会比本文提供的更为严格和有效。

3.预研究验证

临床和非临床研究中在开始样品生物分析前的验证试验称为预研究验证，它主要从数学和可定量方面描述分析方法的性能特征[8]。预验证(prevalidation)是指研究工作启动前的筹备工作，两者不能混淆。另一方面，在研究验证是指监控整个方法使用过程的性能特征，以确保方法的有效性和数据的可靠性。通过完整的方法开发和优化后，分析方法应具备验证的条件，如优化试验数据表明检测方法具有潜在的可靠性和适用于相应的检测要求。方法的可靠性依赖于分析设备和计算机系统的正常运转以及试验人员的熟练程度。本质上，

分析方法是包含多个因素的整体系统而不仅仅是试剂而已。验证方法应包括系统适用性，这属于在研究验证范畴。

建议开始预研究验证之前制定相应的验证实验方案或验证实验标准操作程序（SOP），验证实验方案应说明该方法的预期目的、分析方法的详细说明、待验证的性能特征以及精密度、稳健性、稳定性和耐用性的预期验收标准。此外建议在验证实验方案中加入适当的实验细节和数据处理步骤，这样可以为验证人员提供一个明确的指导以确保更好的处理数据。

抗药抗体检测应建立相应的验收标准，有助于确保在研阶段的试验的有效性。为此，应通过对验证过程中获得的数据进行统计评价后建立用于质控的系统适用性标准（可接受范围）。此外，在研验证阶段中间精密度试验，对照品和样品检测也应有相应的验收标准。当在研验证阶段的分析数据不符合验收标准时，应拒绝该数据。在预研验证阶段不应建立验收标准，因为这可能会使某些验证数据被排除，导致不能准确估计分析误差。除了可明原因（如技术误差）、有意或无意偏离实验方案所得分析数据应被剔除外，预研阶段的所有分析数据都应计算在内。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）、国际协调会议（ICH）和美国药典的指导性文件阐述了定量检测的分析验证应研究的一般性能特点[23~25]。由于抗药抗体免疫分析属于半定量检测，所以有些要求并不不适用。对于抗药抗体免疫分析方法学验证，应对以下9项参数进行测定：

1. 筛选临界点

2.确证临界点

3.灵敏度*

4.系统适用性控制（QCs）验收标准

5.耐药性*

6.精密度

7.鲁棒性

8.稳定性*

9.耐用性（有条件时）

如果分析方法的开发和优化过程已充分说明并得到适当记录，在预研验证阶段不需要对以上标有*的参数进行重复验证，尽管验证报告中应提供相关的数据。如果最终的方法有所变动的话，预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段的预期用途和产品上市后的用途可能会不同。例如，在开发早期只有一个分析人员进行试验，开发工作完成后和上市后可能会有多个分析人员进行试验。整个产品生命周期的验证要求应随着检测方法应用的改变而改变。然后，在药物申请期间还是应对以上列出的参数进行验证。

传统分析方法的稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。当使用滴度标示抗药抗体反应时，需要使用阳性对照，或者最好使用累积抗药抗体阳性样品，在合理稀释范围内不出现异常非线性。通常，在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度（MRD）的选择，验证阶段不需要进行重复测定。如果出现前带效应，建议选择一个不受前带效应影响的MRD，或者采用多种稀释样品。稀释线性信息有助于设计系统适应性质量控制。

3.1筛选临界点

筛选临界点定义为筛选试验的响应水平，响应值高于该临界点的样品为活性样品（或者称为潜在阳性），响应值低于该临界点的样品为阴性样品。一个有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性的统计分析确定，所使用的样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者。

当免疫分析的方法存在错误风险时，筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴性[8,10]。如果筛选试验中不能识别出活性样品，应怀疑该方法检测低阳性样品的能力。约5%的筛选试验的阳性结果为假阳性，从而保证可以检测出低阳性样品[8]。在实践中，假阳性结果总比没有阳性结果好（如假阳性率可能不等于5%）。

3.1.1 筛选临界点的类型

可以应用于在研验证阶段的筛选临界点共有三种：固定临界点、浮动临界点、动态临界点。

（a）固定临界点：

预研验证阶段确定固定临界点，然后应用于在研验证阶段。固定临界点用于测试样品的分析，直到需要重新验证或改变（如测定方法发生关键变化、转移到

另一个实验室进行试验或仪器升级等）。固定临界值在一个目标人群的同一研究中或多目标人群的各研究间是固定的。当预研究阶段的整个试验的均值相等、方差齐性时，采用固定临界点。

（b）浮动临界点

浮动临界点有两种计算方法，分析过程中数据需要进行对数（Log）转换时，通过预研阶段确定的特定归一化因子乘以在研阶段的生物背景计算而得；分析过程无对数转换时，计算方法归一化因子加上生物背景，生物背景可以由阴性对照（由样品的基质组成，抗药抗体反应为阴性）、分析稀释剂或预处理受试者样品（个体特异性临界点）标示。浮动临界点可以是每一次试验每一块板（每一次试验中的若干块板）所特有的或每一个受试者所特有的（使用受试者的预处理/基线样本结果）。如果采用个体特异性临界点，需要在同一块板上检测预处理样品和处理后样品（或至少在同一试验中检测）。由于浮动临界点的确定过程需要对预研究验证的数据进行方差估计，所以不同试验间的结果应表现出方差齐性。采用阴性对照进行归一化时，应确保阴性对照结果能代表目标人群的药物初治基质样品的结果，例如通过验证阴性对照均值和生物基质样品均值在整个试验中是相关联的。如果均值相关，阴性对照均值适用于计算浮动临界点。如果均值不相关，则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理。

（c）动态临界点、

同一试验的不同板之间、同一研究的不同试验间或不同研究间的动态临界点均不同。动态临界点的确定不需要预研究阶段的方差估计。这一特征将动态临界点和浮动临界点区别开来。只有当不同试验间的结果方差有显著性差异时，才使用动态临界点。实际使用时，动态临界点的限制性因素是每次试验都需要大量的样本数才能确定临界点。建议优先采用固定临界点或浮动临界点。如果试验间的均值或方差存在差异，建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查。例如，若果差异来源于分析员或设备，则采用分析员或设备的固定临界点或浮动临界点

代替动态临界点。因为动态临界点是一种不常见的非常规方法，建议谨慎制定该临界点，最好能与监管机构进行充分沟通。

3.1.2 评估临界点的样品

建议从适当的人群中抽样用于分析临界点的评估。有时候需要在开始预研究验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质是不实际的，甚至是不可能的。因此，一般从药物初治健康受试者的样本中进行评估，并确立一个起始临界点。该方法适用于于临床I期的研究。当临床研究开展到临床II期以后，便可得到目标疾病患者的样本，应该对不同的目标人群重新评估临界点。如果目标人群和正常志愿者的响应值的平均值和方差相当，可以使用同一个临界点。如果没有可比性，则需要采用目标疾病特异性的临界点。

为了确定临界点，在验证阶段应分析足够数量的样本，这样才能对生物和分析变异进行有效的统计学评估。通常在临床研究中，需要分析超过50个独立受试者的样本。非临床研究至少需要15个样品。不应使用混合基质样品进行临界点评估，因为从混合样品中测试重复的样品，检测的只是分析变异而不是生物变异。建议采用平衡实验设计有效评估潜在的变异性来源（see Appendix A）。如果将有多个分析员在研究过程进行分析样品操作，那么在预研究验证阶段应至少包括两位分析员。如果研究过程中只有一个分析员进行样品分析，而这个分析员与验证阶段的分析员不同，预研究验证阶段也应至少包括两位分析员。是否需要对同一样品进行重复试验取决于在研验证的报告形式（例如在微量滴定板中进行两个复孔或三个复孔）。

3.1.3 排除异常值

应确认药物初治患者的偶然活性样本，以确保药物的特异性。在这一点上，确证临界点将不能真正的确认阳性，此时应该使用科学的判断方法，应排除无法确定是否为偶然活性样本。在分析临界点的统计学评估时应去除抗药抗体阳性样品和统计学异常样品（样品响应值过高或过低）。因为下部极端异常值通常会使差异性波动从而影响临界点，所以应当排除。去除较高或较低异常值会得到一个较低的临界点，通常会增加假阳性率而变得更为谨慎（假阳性样本会在随后的特

异性确证试验中被证明为阴性）。如果在临界点评估中使用了强大的统计方法（例如基于中位数的方法，图基的Tukey’s biweight函数），则不需要排除异常点。

3.1.4 确定筛选临界点

为了确定筛选临界点的类型，需要进行一系列的数据评估，如图1所示。首先，如果使用参数估计的方法，需要对药物初治的样本结果的分布类型进行检验（正态分布检验），如果数据不符合正态分布，则可以对数据进行适当的转换（如对数转换），然后排除异常值（Appendix B.1）。如果不需要用到参数估计（第95百分位），则不需要进行数据转换，但仍需要排除异常值。其次，采用单因

素方差分析（ANOVA-based statistical methods）的统计学方法处理比较每一次试验运行的平均值和方差，从而决定采用固定临界点、浮动临界点还是动态临界点（Appendix B.2）。在浮动临界点的评价过程中，如果归一化过程使用了阴性对照，则应该将阴性对照的均值与目标人群的基质样本进行比较，以确定是否适合使用阴性对照。最后，基于以上评估，使用适当的统计学方法计算出临界点（Appendix B.3）。

3.2 确证临界点

特异性是分析方法在其它基质成分存在的条件下明确检测目标分析物的能

力[23]。筛选试验筛选出活性样品（通常称为潜在阳性），因为筛选临界点允许5%的假阳性率，所以这些活性样品可能是非特异性的。因此从活性样品中鉴定出阳性样品需要药物的特异性活性。检测人源样本的抗药抗体特异性是一种常见的做法，动物样本也一样。特异性确证试验通常是一个竞争性抑制试验，通过检测含或不含预孵育研究药物的样品的信号变化来进行评估。此外还可通过比较相同大小和电荷的免疫无关的蛋白质进行评估。还有一些研究者通过比较加药和不加药的信号区别进行评估，然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法的可接受性。以上的任何一种方法，确证阳性信号的变化值称为确证临界点。确证临界点将抗体与药物的特异性结合和非特异性结合区别开来，其有效性非常关键，必须客观

评估。不鼓励使用50%信号抑制等主观标准。信号略高于临界点的低信号的抗药抗体弱阳性样品的评价尤为重要。抗药抗体强阳性药品需要用过量的药物进行竞

争性抑制，所以一般不会出现这一问题。当评价抗药抗体弱阳性样品时，即使是加标药物样品的信号很细微的减弱都可能会使相对应的未加标药物样品的信号降低50%以上，从而导致假阳性。此外，只有将抗药抗体阳性样品的信号下降到背景信号，这信号强度只有未抑制样品信号的50%以下，这样可能会出现假阴性。因此，特异性确证临界点应该通过客观的方法进行评估，在弱阳性样本附近评估分析方法的变异性。有多种试验方法可以用于特异性确证临界点的评估。

建议在筛选临界点的验证过程评估特异性确证临界点。筛选临界点评估试验所用到的药物初治样本可以加入药物后再以相同的方式检验。计算未加标药物样本（抑制）的均值和标准偏差（SD），特异性确证临界点为抑制平均值加上3.09倍的SD值（如果预期假阳性率为1%）。与筛选临界点的评估一样，特异性确证临界点的评估过程也需要排除异常值。特异性确证临界点的详细计算步骤参见附录C（Appendix C）。

在某些实验室，会在低于筛选临界点的样品（建议样本量大于等于25）中加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点。用过量药物孵育后，计算平均抑制百分率，并通过“×SD”值进行校正，确定特异性确证临界点（“×”取决于适当的假阳性率）。必须确保阳性对照样品的信号不会高于筛选临界点太多，以免使假阳性率增高。这一方法确定的特异性确证临界点高度依赖于所使用的阳性对照品。值得注意的是，研究样本中的低抗药抗体亲和力样本（特别是多价IgM，亲和力成熟的IgG）可能会不被抑制。因此，使用单一阳性对照品确定的特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还是非特异性样品。

Neyer等提出了一种基于T检验（t-test）的表示抗药抗体特异性的方法，该方法的原理是比较未加标药物样品与加标药物样品的信号值。然而，该分析法的竞争性抑制结果的观测样本量相当有限，没有考虑到生物变异的影响。

然而，以上列举的方法均比人为的50%抑制率更为客观、可靠。一些研究人员进行抗体免疫耗竭（如Protein A），这一方法并不涉及特异性药物，它只能证明信号来源于免疫球蛋白。这种方法可以用作支撑测试，不建议作为药物特异性的决定性试验。

3.3 灵敏度

完全定量方法一般采用适当的参考标准曲线来估计分析方法灵敏度，而抗药抗体分析的灵敏度高度依赖于所用的阳性对照试剂。例如，在同一个分析试验中，使用高亲和力阳性对照品得到的灵敏度优于低亲和力阳性对照品。因此当有一种以上的阳性对照品时，通常会发现不同的阳性对照品会得到不一样的灵敏度。此外，没有一种阳性对照品能表示出不同化合物处理后的免疫应答图谱。尽管如此，分析灵敏度提供了分析方法的一般相关性，需要进行测定并报告。灵敏度有助于在分析方法开发阶段选择最优的抗药抗体检测方法（方法开发起始阶段比较不同方法），也有助于确定低阳性对照品的验证。

抗药抗体分析的灵敏度指阳性对照抗体能稳定产生阳性信号的最低浓度。例如，预期试验的结果的95%高于筛选临界点的对照抗体的浓度，具体的比例取决于一致性水平。确定分析灵敏度的试验方法参见附录D（Appendix）。

3.4 系统适用性控制

系统适用性控制确保了分析方法的有效性[24]。分析方法通常都包含一系列的质量控制（强、弱阳性对照和阴性对照），这些质量控制确保了性能的一致性，从而确保了结果的有效性。换言之，系统适应性控制有助于确保了分析方法在整个研究阶段都是有效的。因此，系统适用性控制帮助确认试验运行是否通过验证的验收标准。关于系统适用性控制开发和相关的验收标准的详细信息参见附录E （Appendix E）。

3.5 选择性/干扰性（耐药性）

考虑到样品中的其它组分可能会影响抗药抗体的检测。选择性就是指分析方法在其它组分存在的情况下检测目的物质的能力[27]，通过从含有潜在干扰组分（多个）的样品中检测分析物（模拟阳性对照品）的回收率来进行表征。当阳性对照和样品基质来源于不同物种时，anti-framework抗体和抗异种抗体常常会阻碍阳性对照品的回收。注意当使用阳性对照时，抗药抗体分析的选择性不太可能会影响测定临床或非临床样品的选择性。尽管如此，还是很有必要去了解抗药抗体检测的试验条件，基质中可能含有研究药物、内源性抗体、合并用药和类风

湿因子等。

3.5.1 基质成分的干扰

抗药抗体分析的回收率评估包括在试验条件下检测基质成分是否会抑制抗药抗体与药物的结合。如果可能的话，选择性研究应包括阳性对照与疾病状态下的血清的对照试验，因为某些人群或疾病状态下可能会产生干扰性物质。如果有显著比例的测试样本出现溶血或高血脂，则需要进行回收率评价。为了确定目标基质样品的回收率，应将高、低浓度的特异性抗药抗体对照品（单克隆或多克隆）加入分析缓冲液（不含基质成分）、健康个体的生物基质（血清或血浆）、治疗人群样本。比较缓冲液的响应值与生物基质的响应值，可接受标准通常为两者的差异超过20%，具体差异取决于所用的阳性对照。在试验中选择表达高、低非特异性背景的捐助者是很有帮助的。不仅能够检测回收率，还能检查基质的干扰性，确证最小稀释浓度（MRD）。

3.5.2 药物干扰研究（耐药性）

抗药抗体检测的主要干扰物质通常来自药物本身。由于目标药物和试验过程用到的捕获试剂的特异性抗体的产生存在竞争性作用，含药样品可能存在干扰物质，导致出现假阴性。通常的做法是确定抑制阳性对照抗体检测的药物浓度，并将此耐药限度应用于研究样本抗药抗体状态的决策方面。这一做法存在一定的缺陷，因为耐药性高度依赖于所使用的阳性对照，在同一个试验中，使用高亲和力阳性对照可以获得较低的耐药性，而低亲和力对照获得的耐药性更高。因为抗药抗体存在个体差异性，所以研究样本的抗体获得的真正的耐药性可能会与阳性对

照的耐药性不同。事实上，当有一个以上阳性对照时，通常会发现每一个阳性对照会对应一个不同的耐药性值。因此，真正的耐药性是无法确定的。与灵敏度类似，耐药性仅限于了解试验中药物是否会产生干扰，在方法的开发和优化阶段可以用于比较不同方法。尽管如此，确定耐药性是监管期望。

为了测定药物的耐药性，先用系列稀释的药物对低浓度ADA QC进行预孵育，然后再进行检测。抑制低浓度QC信号检测的最低药物浓度就是试验的药物耐受限，该耐受限会随着阳性对照的不同而改变。研究阶段的生物分析报告中，

当在抗药抗体阴性的样本中检测药物时，建议附上该抗药抗体阴性样本可能伴随的药物干扰声明。

3.6 精密度

精密度是指分析方法一系列随机测量值的变异程度，精密度的可接受标准应该在免疫分析的常用预期范围内；同时也应该适合所用的平台（例如，电化学发光法的标准要严于Elisa法）。建议采用平衡实验设计进行精密度性能验证，如附录A（Appendix A）所示。筛选试验、特异性确证试验和滴定方法的精密度确定方法如下。如果可行，建议在研究阶段将精密度试验适当放大至预期实际使用规模。

3.6.1 筛选试验精密度

对试验对照品（阴性对照、高、低浓度阳性对照）进行至少6次独立检测，分析相应数据确定筛选试验精密度。以上数据可以通过附录D（Appendix D）所述的灵敏度确定试验获得。从以上试验中计算出高浓度阳性样品和低浓度阳性样品（刚好高于临界点）的不精确性，不精确性可以用变异系数（CV%）表示，变异系数表征了先关变异的来源。批内分析精密度（也称批内精密度或内部运行精密度）和中间精密度（也称运行间精密度、批间精密度、中间精密度或整体精密度）都应该用变异系数CV%表示，例如最近出版物的表示方式[27]。如果分析研究样本是使用了分析员特异性临界点，则应该测定分析员中间精密度

（inter-analyst CV）。

3.6.2 特异性确证试验精密度

特异性确证试验精密度的目的是检测信号抑制的重复性。为了计算百分抑制率（%），特异性确证临界点的确定试验中，在至少6次独立运行中，往高、低浓度对照组中加入适量的药物。以上试验已经有足够的数据计算批间精密度，计算方式如3.6.1.

3.7 稳健性

鲁棒性能够指示分析方法的可靠性。鲁棒性是指当方法的参数发生故意的微小变化时，分析方法不受影响的能力[23]。鲁棒性关注的是在标准试验室发生真

实生活的变化时分析方法的一致性。验证过程中鲁棒性参数测定需要基于具体的分析方及其相关风险[28]。应该评估特定实验室哪些试验条件可能发生变化，并设计适当的测试，以检查被认为关键的参数。包括微孔板批次、孵育时间、温度、每一次运行的微孔板数、试剂批次和浓度或者设备。研究样本或阳性对照样本都可用于检测鲁棒性。建议在鲁棒性验证过程中使用系统适用性控制的验收标准（在方法开发和优化阶段计算或验证系统适用性验收标准）

3.8 稳定性

稳定性研究评估分析方法在预期样品的储存条件下的分析性能。理想状态下，稳定性测试条件应模仿预期样品和试剂的装卸条件、储存温度和不同的储存时间。考虑到分析物的稳定性，抗药抗体的本质属性值得深思。不管抗药抗体分析物是抗X药物抗体还是抗Y药物抗体，他们都是多克隆抗体。因此，有理由认为抗药抗体的稳定性都是一样的。按照这一逻辑，抗药抗体的稳定性接近血清或血浆中任意抗原的免疫球蛋白的稳定性。建议对每一物种的的基质样本分开进行稳定性表征，无论是临床的还是非临床的，然后在研究实验室内将试验结果推广至所有的药物检测项目，有必要检测来自目标适应症（如类风湿性关节炎）的基质。因此，并未规定分析不同药物时样品稳定性都要分开进行验证。需要注意一个事实，当不同受试者注射不同的药物时，产生的IgM，IgG1， IgG2，IgG3或IgG4的比

例各不相同，不可以知道并模拟不同人群的免疫球蛋白的比例。因此使用该法评价分析物质的稳定性是合理的。

加了阳性对照的药物初治基质可以用作模拟阳性样本进行稳定性测定，但是这样的样本是否能合理的模拟预期测试样品需要科学的判断。最好是能有多个不同浓度的阳性样品，至少也要包含一个强阳性对照和一个弱阳性对照。更详细的信息参见附录F（Appendix F）。

稳定性表征还应包括关键试剂的稳定性，如质量控制样品、涂层试验板或芯片（如果有使用）以及其它关键试剂（如偶联物）。然而，这是一个商业决策而不是规定的验证项目，因为抗药抗体分析是一个稳定性指标试验方法（如，关键试剂的稳定性缺失就会导致分析性能不佳或分析失败，可以由系统适用性控制

进行监控）。

3.9 重现性

重现性是指在一个以上实验室进行试验时，分析方法的可靠性。因此它需要证明分析方法在不同实验室间是有效的。在FDA和ICH的方法学验证指导原则中并没有重现性这一术语[13,23,24]。美国药典将其描述为实验室间精密度和分析员间精密度。分析员间精密度在ICH的文件中描述为中间精密度[23,24]。ICH

将实验室间精密度描述为再现性(reproducibility)。重现性经常被错误的解释为“常规的变化”（routine changes），如设备间的不精确性，实际上属于稳健性的范畴。

因为有些公司可能含有多个生物分析实验室，或者由于外包的不断增长，建议在这种情况下验证重现性。重现性成为评价分析方法的“转让性能”的好方法，如在两个或两个以上的实验室测试样本的邮箱，并比较不同实验室的数据。例如，分析灵敏度使用了单一的阳性对照，应对临界值和控制范围进行评估；可以在主办方的试验室中产生盲样然后由接收实验室进行检测。当只有一个实验室进行抗药抗体分析时，直到该方法要转移到另一个实验室时才需要进行重现性验证。

4.在研究验证（监控）和重新验证

在研究验证（系统适用性监控或保持）和重新验证是生物分析方法的关键组成部分。因此，分析方法的验证工作直到该方法停止使用时才结束。

对于定量生物分析方法的在研究验证，通常需要精密度和准确性的验收标准

[13]。因为抗药抗体分析方法中并未涉及准确性，所以按照3.4部分描述的办法监测质量控制样品的性能。再度确保该监测系统是适用预定用途的，如分析方法仍是有效的，其性能仍像预先研究验证阶段一样。弱阳性对照的使用确保了分析方法的灵敏度。关于样品和微孔板的验收标准参见附录E2(Appendix E2)。建议根据测定法减少“漂移”的需要，对分析方法进行重新验证。例如，当分析方法的关键部分、设备或者样品（疾病适应症）发生改变时，需要进行重新验证。重新验证应包括部分或全部验证特性（如部分或全部重新验证）。分析关键试剂的批号与预先研究验证阶段的批号不同时不需要进行重新验证，但必须通过适当的实验资质进行支持，以保持系统适应性。

5、结语

关于免疫原性评估系列论文共有三篇，第一篇介绍了生物制药产品抗体免疫分析方法的开发和优化[8]，第二篇介绍了抗药抗体的评估策略[10]，本文介绍了抗药抗体免疫分析验证的重要性能特点，并提供了测定各性能的建议。旨在促进整个生物制药行业形成治疗性蛋白质免疫原性评估的标准化方法。这三篇论文里的建议都应被视为最佳实践范例。只要保持科学原理和客观性，也可以接受替代方法。

期望在此推荐的方法可以产生高质量的抗药抗体数据，从而更好的了解免疫原性在临床上的影响。同时也希望论文的发表会促进全世界的监管机构颁布具体的指导文件。

20.化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 2005年颁布

指导原则编号： 【H】G P H 5-1 化学药物质量控制分析方法验证 技术指导原则 二○○五年三月

目 录 一、概述 (1) 二、方法验证的一般原则 (2) 三、方法验证涉及到的三个主要方面 (2) （一）需要验证的检测项目 (2) （二）分析方法 (3) （三）验证内容 (3) 四、方法验证的具体内容 (3) （一）专属性 (3) 1、鉴别反应 (4) 2、杂质检查 (4) 3、含量测定 (4) （二）线性 (5) （三）范围 (5) 1、含量测定 (6) 2、制剂含量均匀度 (6) 3、溶出度或释放度 (6) 4、杂质 (6) （四）准确度 (6) 1、含量测定 (7) 2、杂质定量试验 (7) （五）精密度 (7) 1、重复性 (8) 2、中间精密度 (8) 3、重现性 (8)

（六）检测限 (8) 1、直观法 (8) 2、信噪比法 (9) （七）定量限 (9) 1、直观法 (9) 2、信噪比法 (9) （八）耐用性 (10) （九）系统适用性试验 (10) 五、方法再验证 (11) 六、方法验证的评价 (12) （一）有关方法验证评价的一般考虑 (12) （二）方法验证的整体性和系统性 (12) 七、参考文献 (13) 八、著者 (13)

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则 一、概述 保证药品安全、有效、质量可控是药品研发和评价应遵循的基本原则，其中，对药品进行质量控制是保证药品安全有效的基础和前提。为达到控制质量的目的，需要多角度、多层面来控制药品质量，也就是说要对药物进行多个项目测试，来全面考察药品质量。一般地，每一测试项目可选用不同的分析方法，为使测试结果准确、可靠，必须对所采用的分析方法的科学性、准确性和可行性进行验证，以充分表明分析方法符合测试项目的目的和要求，这就是通常所说的对方法进行验证。 方法验证的目的是判断采用的分析方法是否科学、合理，是否能有效控制药品的内在质量。从本质上讲，方法验证就是根据检测项目的要求，预先设置一定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所采用的分析方法能否符合检测项目的要求。 方法验证在分析方法建立过程中具有重要的作用，并成为质量研究和质量控制的组成部分。只有经过验证的分析方法才能用于控制药品质量，因此方法验证是制订质量标准的基础。方法验证是药物研究过程中的重要内容。 本指导原则重点探讨方法验证的本质，将分析方法验证的要求与所要达到的目的结合起来进行系统和规律性的阐述，重点阐述如何科学合理地进行论证方案的设计。 本指导原则主要包括方法验证的一般原则、方法验证涉及的三个主要方

(完整版)临床免疫学检验知识点.doc

临床免疫学检验 1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。 3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织 4、 B 细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg 表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、 Fc 受体、补体受体、EB 病毒受体和小鼠红细胞受体。 成熟 B 细胞： CD19、CD20、 CD21、 CD22 （成熟 B 细胞的 mIg 主要为 mIgM和 mIgD）同时检测 CD5分子，可分为 B1 细胞和 B2 细胞。 B 细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。 5、T 细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是 CD3（多链糖蛋白）；辅助 T 细胞的标志是 CD4；杀伤 T 细胞的标志是 CD8； T 细胞受体 =TCR。 T 细胞和 NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）； CD3＋ CD4＋CD8－ =辅助性T细胞（Th） CD3＋ CD4－CD8＋ =细胞毒性T 细胞（ Tc 或 CTL）（ T 细胞介导的细胞毒试验） CD4＋ CD25＋ =调节性T细胞（Tr或Treg） T 细胞功能检测：植物血凝素（ PHA）刀豆素（ CONA）刺激 T 细胞增殖。增殖试验有：形态 法、核素法。 T 细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法 *E 花环试验是通过检测SRBC受体而对T 细胞进行计数的一种试验； 6、 NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞） 表面标志： CD16（ ADCC）、 CD56。 测定人 NK细胞活性的靶细胞多用K562 细胞株，而测定小鼠胞株。NK细胞活性则常采 用 YAC-1 细 7、吞噬细胞包括：单核 - 吞噬细胞系统（MPS，表面标志外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。CD14，包括骨髓内的前单核细胞、（表达 MHCⅡ类分子） 8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。 9、免疫球蛋白可分为分泌型（ sIg ，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（ mIg，作为抗原受体表达于 B 细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白） 10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序） 免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。 11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL） 12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和 VL（高变区）是抗原结合部位。

药品微生物检验替代方法验证指导原则

药品微生物检验替代方法验证指导原则 本指导原则是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验提供指导。 随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分为三类：（1)基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等；(2)直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等；（3)基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技术、基因指纹分析技术等。这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。 在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。 微生物检验的类型及验证参数 药品微生物检验方法主要分两种类型：定性试验和定量试验。定性试验就是测定样品中是否存在活的微生物，如无菌检查及控制菌检査。定量试验就是测定样品中存在的微生物数量，如菌落计数试验。 由于生物试验的特殊性，如微生物检验方法中的抽样误差、稀释误差、操作误差、培养误差和计数误差都会对检验结果造成影响，因此，药品质量标准分析方法验证指导原则（附录XIX A)不完全适宜于微生物替代方法的验证。药品微生物检验替代方法的验证参数见表1。 表1 不同微生物检验类型验证参数 注： 尽管替代方法的验证参数与药品质量标准分析方法验证参数有相似之处，但是其具体的内容是依据微生物检验特点而设立的。替代方法验证的实验结果需进行统计分析，当替代方法属于定性检验时，一般采用非参数的统计技术；当替代方法属于定量检验时，需要采用参数统计技术。 进行微生物替代方法的验证时，若替代方法只是针对药典方法中的某一环节进行技术修改，此时，需要验证的对象仅是该项替代技术而不是整个检验方法。如无菌试验若改为使用含培养基的过滤器，然后通过适宜的技术确认活的微生物存在，那么，验证时仅需验证所用的微生物回收系统而不是整个无菌试验方法。 替代方法验证的一般要求 在开展替代方法对样品检验的适用性验证前，有必要对替代方法有一个全面的了解。首先，所选用的替代方法应具备必要的方法适用性证据，表明在不含样品的情况下，替代方法

免疫学检验试题(附答案)

免疫学检验试题（一） 1. 免疫监视功能低下时易发生（）。 A．自身免疫病 B．超敏反应 C．肿瘤 D．免疫缺陷病 E．移植排斥反应答案C 解析免疫系统的功能之一是对自身偶尔产生的有癌变倾向的细胞进行清除，此即免疫监视功能，免疫监视功能低下时易发生肿瘤。 2. 免疫自稳功能异常可发生（）。 A．病毒持续感染 B．肿瘤 C．超敏反应 D．自身免疫病 E．免疫缺陷病答案D 解析免疫系统的功能之一是对自身衰老的组织细胞进行清除，即免疫自稳功能，免疫自稳功能异常可发生自身免疫病。 3. 既具有抗原加工提呈作用又具有杀菌作用的细胞是（）。A．树突状细胞 B．巨噬细胞

C．中性粒细胞 D．B 细胞 E．T 细胞答案B 解析树突状细胞、巨噬细胞和B 细胞都有抗原加工提呈作用，但只有巨噬细胞兼有吞噬杀菌作用。 4. 免疫应答过程不包括（）。 A．T 细胞在胸腺内分化成熟 B．B 细胞对抗原的特异性识别 C．巨噬细胞对抗原的处理和提呈 D．T 细胞和B 细胞的活化、增殖和分化 E．效应细胞和效应分子的产生和作用答案A 解析免疫应答过程指免疫系统针对抗原的反应过程，不包括免疫细胞的发育过程。 5. 关于外周免疫器官的叙述，不正确的是（）。 A．包括淋巴结、脾和黏膜相关淋巴组织 B．发生发育的时间晚于中枢免疫器官 C．是免疫应答发生的场所 D．是免疫细胞发生和成熟的场所 E．是所有淋巴细胞定居的场所答案D 解析免疫细胞发生和成熟的场所在中枢免疫器官，故 D 项不正确。

5. 在正常血清中，含量最高的补体成分是（）。 A．C1 B．C3 C．C4 D．C5 E．C4Bp 答案B 解析在正常血清中含量最高的补体成分是C3。 7. 细胞因子不包括（）。 A．单核因子 B．淋巴因子 C．生长因子 D．抗体 E．集落刺激因子答案D 解析细胞因子是生物活性的小分子多肽，抗体不是。 8. 体内抗病毒、抗毒素、抗细菌最重要的抗体为（）A．IgM B．IgA C．IgG D．IgE E．IgD 答案C 解析IgG 是体内抗感染的最主要的抗体。

生物样品定量分析方法验证指导原则

9012 生物样品定量分析方法验证指导原则
1. 范围
准确测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿）中的药物浓度，对于药物和 制剂研发非常重要。这些数据可被用于支持药品的安全性和有效性，或根据毒动 学、药动学和生物等效性试验的结果做出关键性决定。因此，必须完整地验证和 记录应用的生物分析方法，以获得可靠的结果。
本指导原则提供生物分析方法验证的要求，也涉及非临床或临床试验样品实 际分析的基本要求，以及何时可以使用部分验证或交叉验证，来替代完整验证。
生物样品定量分析方法验证和试验样品分析应符合本指导原则的技术要求。 应该在相应的生物样品分析中遵守 GLP 原则或 GCP 原则。
2. 生物分析方法验证
2.1 分析方法的完整验证
分析方法验证的主要目的是，证明特定方法对于测定在某种生物基质中分析 物浓度的可靠性。此外，方法验证应采用与试验样品相同的抗凝剂。一般应对每 个物种和每种基质进行完整验证。当难于获得相同的基质时，可以采用适当基质 替代，但要说明理由。
一个生物分析方法的主要特征包括：选择性、定量下限、响应函数和校正范 围（标准曲线性能）、准确度、精密度、基质效应、分析物在生物基质以及溶液 中储存和处理全过程中的稳定性。
有时可能需要测定多个分析物。这可能涉及两种不同的药物，也可能涉及一 个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体。在这些情况下，验证和 分析的原则适用于所有涉及的分析物。
对照标准物质 在方法验证中，含有分析物对照标准物质的溶液将被加入到空白生物基质 中。此外，色谱方法通常使用适当的内标。 应该从可追溯的来源获得对照标准物质。应该科学论证对照标准物质的适用 性。分析证书应该确认对照标准物质的纯度，并提供储存条件、失效日期和批号。 对于内标，只要能证明其适用性即可，例如显示该物质本身或其相关的任何杂质 不产生干扰。 当在生物分析方法中使用质谱检测时，推荐尽可能使用稳定同位素标记的内 标。它们必须具有足够高的同位素纯度，并且不发生同位素交换反应，以避免结 果的偏差。
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美国FDA分析方法验证指南中英文对照

I. INTRODUCTION This guidance provides recommendations to applicants on submitting analytical procedures, validation data, and samples to support the documentation of the identity, strength, quality, purity, and potency of drug substances and drug products. 1. 绪论 本指南旨在为申请者提供建议，以帮助其提交分析方法，方法验证资料和样品用于支持原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力方面的文件。 This guidance is intended to assist applicants in assembling information, submitting samples, and presenting data to support analytical methodologies. The recommendations apply to drug substances and drug products covered in new drug applications (NDAs), abbreviated new drug applications (ANDAs), biologics license applications (BLAs), product license applications (PLAs), and supplements to these applications. 本指南旨在帮助申请者收集资料，递交样品并资料以支持分析方法。这些建议适用于NDA，ANDA，BLA，PLA及其它们的补充中所涉及的原料药和制剂。 The principles also apply to drug substances and drug products covered in Type II drug master files (DMFs). If a different approach is chosen, the applicant is encouraged to discuss the matter in advance with the center with product jurisdiction to prevent the expenditure of resources on preparing a submission that may later be determined to be unacceptable. 这些原则同样适用于二类DMF所涉及的原料药和制剂。如果使用了其它方法，鼓励申请者事先和FDA药品评审中心的官员进行讨论，以免出现这种情况，那就是花了人力物力所准备起来的递交资料后来发现是不可用的。 The principles of methods validation described in this guidance apply to all types of analytical procedures. However, the specific recommendations in this guidance may not be applicable to certain unique analytical procedures for products such as biological, biotechnological, botanical, or radiopharmaceutical drugs. 本指南中所述的分析方法验证的原则适用于各种类型的分析方法。但是，本指南中特定的建议可能不适用于有些产品所用的特殊分析方法，如生物药，生物技术药，植物药或放射性药物等。 For example, many bioassays are based on animal challenge models, 39 immunogenicity assessments, or other immunoassays that have unique features that should be considered when submitting analytical procedure and methods validation information. 比如说，许多生物分析是建立在动物挑战模式，免疫原性评估或其它有着独特特性的免疫分析基础上的，在递交分析方法和分析方法验证资料时需考虑这些独特的性质。Furthermore, specific recommendations for biological and immunochemical tests that may be necessary for characterization and quality control of many drug substances and drug products are beyond the scope of this guidance document. 而且，许多原料药和制剂的界定和质量控制所需的生物和免疫化学检测并不在本指南的范围之内。 Although this guidance does not specifically address the submission of analytical procedures and validation data for raw materials, intermediates, excipients, container closure components, and other materials used in the production of drug

(整理)常用免疫学检查参考值

常用免疫学检查参考值 血清免疫球蛋白分类Ig通常是指具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。 应用免疫电泳与超速离心分析可将Ig分5类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。 IgG：含量最多或最主要的Ig（75%），唯一能够通过胎盘的Ig。主要由脾脏和淋巴结中的浆细胞合成与分泌。 IgA：约占10%，SIgA在局部免疫中起重要作用。主要由肠系淋巴组织中的浆细胞产生。 血清免疫球蛋白 IgM：分子量最大，由5个IgM单体通过J链连接。是最早出现的Ig，是抗原刺激后最早出现的抗体，其杀菌、溶菌、溶血、促吞噬以及凝集作用比IgG高500-1000倍。 测定方法：单向免疫扩散法（RID）或免疫比浊法。 血清免疫球蛋白测定参考值 参考值：IgG：7.6-16.6g/L （RID法）IgA：710-3350mg/L IgM ：0.48-2.12 g/L 临床意义 免疫球蛋白增高 多克隆增高:常见于各种慢性感染、慢性肝病、肝硬化、淋巴瘤和某些自身免疫性疾病，如SLE、类风湿关节炎等。 单克隆增高:主要见于免疫增殖性疾病，如多发性骨隋瘤、原发性巨球蛋白血症等。 免疫球蛋白降低：常见于各类先天性免疫缺陷病、获得性免疫缺陷病、联合免疫缺陷病及长期使用免疫抑制剂的病人。 血清IgD测定 免疫扩散法：0-62mg/L 已发现有些抗核抗体、抗基底膜抗体、抗甲状腺抗体和抗“O”抗体等均属IgD，但活性甚低。 血清IgE：主要由鼻咽部、支气管、胃肠道等粘膜固有层的浆细胞分泌，为亲细胞抗体，能与肥大细胞、嗜碱性粒细胞膜上的FceR结合，产生I型变态反应。 ELASA：0.1-0.9mg/L 临床意义： 1. I型变态反应 2. IgE型骨髓瘤、寄生虫感染等 3. 慢性肝炎、SLE、类风湿性关节炎等。 血清M蛋白测定（M protein，monoclonal immunoglobulins）是一种单克隆B淋巴细胞异常增殖时产生的IgG分子或片段，一般不具有抗体活性。 参考值：蛋白电泳法，免疫电泳法：阴性 意义：1.多发性骨髓瘤（MM），占35%-65%，其中IgG型占60%左右；IgA型占20%左右；轻链型占15%左右；IgD、IgE型罕见。2.巨球蛋白血症。3.重链病（HCDs）。4.半分子病。5.恶性淋巴瘤。6.良性M蛋白血症。 血清补体测定 补体是具有酶活性的一种不耐热球蛋白，分3组：9种补体成分（C1-C9）；B、D、P、H、I 因子；补体调节蛋白，如C1抑制物、C4结合蛋白、促衰变因子等。 总补体溶血活性（CH50）测定 参考值试管法：50000-100000U/L 意义：增高见于急性炎症、急性组织损伤、恶性肿瘤及妊娠。降低见于急性肾小球肾炎、自身免疫性疾病、亚急性感染性心内膜炎、慢性肝病、肝硬化、AIDS、严重烧伤等。

美国FDA药物分析程序及方法验证指导原则(中文版)

药品及生物制品的分析方法和方法验证指导原则 目录 1.介绍...................... (1) 2.背景..................... .. (2) 3.分析方法开发. ..................... . (3) 4.分析程序内容.............................................. ......... ..................................... .. 3 A.原则/范围 (4) B.仪器/设备............................................. . (4) C.操作参数.............................................. .. (4) D.试剂/标准............................................. . (4) E.样品制备.............................................. .. (4) F.标准对照品溶液的制备............................................ .. (5) G.步骤......... ....................................... (5) H.系统适应性..... (5) I.计算 (5) J.数据报告 (5) 5.参考标准和教材............................................ (6) 6分析方法验证用于新药，仿制药，生物制品和DMF (6) A.非药典分析方法............................................. (6) B.验证特征 (7) C.药典分析方法............................................. .. (8) 7.统计分析和模型 (8) A.统计 (8) B.模型 (8) 8.生命周期管理分析程序 (9) A.重新验证 (9) B.分析方法的可比性研究............................................ . (10) 1.另一种分析方法............................................... .. (10) 2.分析方法转移的研究 (11) C.报告上市后变更已批准的新药，仿制药，或生物制品 (11) 9.美国FDA方法验证............................................... . (12) 10.参考文献

201507fda行业指南：分析方法验证(中英文)(下).doc

201507 FDA行业指南：分析方法验证（中英文）（下） VII. STATISTICAL ANALYSIS AND MODELS 统计学分析和模型 A. Statistics 统计学 Statistical analysis of validation data can be used to evaluate validation characteristics against predetermined acceptance criteria. All statistical procedures and parameters used in the analysis of the data should be based on sound principles and appropriate for the intended evaluation. Several statistical methods are useful for assessing validation characteristics, for example, an analysis of variance (ANOVA) to assess regression analysis R (correlation coefficient) and R squared (coefficient of determination) or linear regression to measure linearity. Many statistical methods used for assessing validation characteristics rely on population normality, and it is important to determine whether or not to reject this assumption. There are many techniques, such as histograms, normality tests, and probability plots that can be used to evaluate the observed distribution. It may be appropriate to transform the data to better fit the normal distribution or apply distribution-free (nonparametric) approaches when the observed data are

方法学验证指导原则

一、准确度 准确度系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率（％)表示。准确度应在规定的范围内测定。 1.化学药含量测定方法的准确度 原料药采用对照品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。制剂可在处方量空白辅料中，加入已知量被测物对照品进行测定。如不能得到制剂辅料的全部组分，可向待测制剂中加人已知量的被测物对照品进行测定，或用所建立方法的测定结果与已知准确度的另一种方法测定结果进行比较。准确度也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。 2.化学药杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂处方量空白辅料中加人已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产物对照品，可用所建立方法测定的结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。在不能测得杂质或降解产物的校正因子或不能测得对主成分的相对校正因子的情况下，可用不加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比（％) 或面积比（％ )。 3.中药化学成分测定方法的准确度 可用对照品进行加样回收率测定，即向已知被测成分含量的供试品中再精密加人一定量的被测成分对照品，依法测定。用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量计算回收率。在加样回收试验中须注意对照品的加人量与供试品中被测成分含有量之和必须在标准曲线线性范围之内；加入对照品的量要适当，过小则引起较大的相对误差，过大则干扰成分相对减少，真实性差。 回收率：％= (C - A ) /S X 100% 式中：A为供试品所含被测成分量；B 为加入对照品量； C 为实测值。 4.校正因子的准确度 对色谱方法而言，绝对（或定量）校正因子是指单位面积的色谱峰代表的待测物质的量。待测定物质与所选定的参照物质的绝对校正因子之比，即为相对校正因子。相对校正因子计算法常应用于化学药有关物质的测定、中药材及其复方制剂中多指标成分的测定。校正因子的表示方法很多，本指导原则中的校正因

实验诊断学习题20临床常用免疫学检查

临床常用免疫学检查 第一节血清免疫球蛋白检测 一、填空题 1、血清M蛋白阳性见于、、 、 和。 2、免疫球蛋白存在于机体的、、和 3、血清中最少的一种免疫球蛋白为，相对分子质量最大的为 含量最多的为 二、是非题 1、血清中含量最少的免疫球蛋为IgE。（） 2、肾病综合征的患者血清可以出现IgM降低。（） 三、名词解释 免疫球蛋白 四、选择题 A型题 1、IgG降低见于：（） A.病毒感染 B.肺结核 C.链球菌感染 D.慢性肝炎 E.淋巴瘤 B型题 问题3～5 A、IgG降低 B、IgE增高 C、IgD 降低 D、IgG升高. E、IgE 降低 2、各种过敏性疾病（） 3、无丙种球蛋白血症（） 4、应用免疫抑制剂患者（） C型题 问题5～6 A、M蛋白阳性 B、IgG增高 C、二者都有 D、二者都无 5、多发性骨髓瘤（） 6、各种慢性感染（） X型题 7、免疫球蛋白降低常见于：（） A、体液免疫缺陷病 B、慢性肝病 C、寄生虫病 D、长期应用免疫抑制剂者 E、多发性骨髓瘤 五、问答题 免疫球蛋白G增高常见于哪些情况。 【参考答案及题解】

一、填空题： 1、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病、轻链病和半分子病 2、血液、体液、外分泌液和某些细胞的细胞膜上 3、免疫球蛋白E、免疫球蛋白M、免疫球蛋白G 二、是非题：1、√；2、√ 三、名词解释： 免疫球蛋白：通常是指由浆细胞产生的具有抗体活性和（或）抗体样结构的球蛋白。 四、选择题：1D 2B 3C 4A 5C 6B 7AD 五、问答题： 答：①多克隆性增高，常见于各种慢性感染、慢性肝病、淋巴瘤、肺结核、链球菌感染以及自身免疫性疾病如SLE、RA等；②单克隆性增高，主要见于免疫增殖性疾病，如分泌性多发性骨髓瘤。 【王彦平】 第二节血清补体的检测 一、填空题 1、总补体溶血活性主要反映，它的降低很有意义，见于、 、、、。 2、补体C3的增高主要见于、、和。 二、是非题 补体C3、C4的水平可以反映系统性红斑狼疮的活动程度。（） 三、名词解释 补体 四、选择题 A型题 1、血清总补体活性增高见于：（） A、感染性心内膜炎 B、病毒性肝炎 C、组织损伤 D、皮肌炎 E、狼疮性肾炎 B型题 问题2～5 A、血清总补体活性（CH50） B、补体C3增高 C、补体C4降低 D、AP-H50 E、C3SP增高 2、主要反映补体传统途径活化的活性程度（） 3、反映体内补体被活化（） 4、反映补体旁路途径活化的情况（） 5、反映排异反应（） C型题 问题6-7 A血清C3降低 B血清C4降低 C两者都有 D二者都无 6、急性肾小球肾炎（） 7、恶性肿瘤（）

免疫学及免疫学检验学+题库答案

一、名词解释 第1章概论 1.免疫学： 2.免疫分子： 3.补体： 4.临床免疫学： 第2章抗原抗体反应 5.抗原抗体反应： 6.抗原抗体反应特异性 7.可逆性 8.比例性 9.抗原抗体反应的等价带（zoneofequivalence） 10.最适比（optimalratio） 11.带现象（zonephenomenon） 第3章免疫原和抗血清的制备 12.免疫原(immunogen)

13.半抗原 14.免疫佐剂 15.多克隆抗体(polyclonal antibody, pcAb) 第5章凝集反应 16.凝集反应 17.直接凝集反应 18.间接凝集反应 19.明胶凝集试验 第6章沉淀反应 20.沉淀反应 21.絮状沉淀试验 22.免疫浊度测定 23.凝胶内沉淀试验 24.单项扩散试验

25.双向扩散试验 26.免疫电泳技术 27.对流免疫电泳 28.火箭免疫电泳 29.免疫电泳 30.免疫固定电泳 第19章补体检测及应用 31.补体 32.免疫溶血法 33.补体结合试验 第22章感染性疾病与感染免疫检测34.感染 第23章超敏反应性疾病及其免疫检测35.超敏反应

36.Ⅰ型超敏反应 37.Ⅱ型超敏反应 38.Ⅲ型超敏反应 39.Ⅳ型超敏反应 第24章自身免疫性疾病及其免疫检测 40.自身耐受 41.自身免疫 42.自身免疫病 43.自身抗体 44.抗核抗体 第25章免疫增殖性疾病及其免疫检测 45.免疫增殖性疾病 46.免疫球蛋白增殖病 47.本周蛋白

48.血清区带电泳 49.免疫电泳 50.免疫固定电泳 第26章免疫缺陷性疾病及其免疫检验 51.免疫缺陷病 52.获得性免疫缺陷综合征 第27章肿瘤免疫与免疫学检验 53.肿瘤免疫学 54.肿瘤抗原 55.肿瘤标志物 第28章移植免疫及其免疫检测 56.移植 57.主要组织相容性复合体 58.移植排斥反应

(整理)17常用免疫学检查.

一、名词解释 1．M蛋白2．ASO 3．肥达反应4．类风湿因子 5．抗核抗体6．肿瘤标志物7．C-反应蛋白 二、填空题 1．血清M蛋白阳性提示单克隆免疫球蛋白增殖性疾病，可见于、、、重链病和半分子病等。 2．血清中最多的一种Ig为，大多数抗细菌、抗病毒、抗毒素抗体为类免疫球蛋白，含量最少的免疫球蛋白为。 3．补体C3作为急性时相反应蛋白，在、、、和移植物排斥反应时增高。 4．检查梅毒抗体的定性试验有快速血浆反应素试验（RPR）、不加热血清反应素玻片试验（USR）和性病研究实验室试验（VDRL），VDRL法为WHO推荐使用，这类试验敏感性高、特异性。 5．TORCH是一组病原微生物英文名称的第一个字母缩写组成的，它们是孕期感染的主要病原微生物。T代表，O代表，R代表，C代表，H代表单纯疱疹病毒。 6．确有溶血型链球菌感染，但ASO不见增高可因该溶血型链球菌株不产生或产生很少量的链球菌溶血素O，此时应联合检查或以提高阳性率。 7．类风湿因子检测主要用于的辅助诊断，但并不是该病独有的特异性抗体，其它的自身免疫性疾病，如、、等亦可阳性，还可见于某些感染性疾病，如传染性单核细胞增多症、结核病等。 8．某30余岁女青年，面部及手部出现不规则形红斑，并有严重关节疼痛及胸闷，做ASO检测，阴性，?RF阳性（中等滴度），抗核抗体阳性，可初步诊断为。 9．器官移植的成败主要取决于供者和受者的组织相容性，其中型别是否相符起关键作用。 10．传统的方法和细胞学分型方法有许多不足之处，随着科技的进展，技术已经成为HLA分型的主流。 三、判断题 1．IgG是唯一能通过胎盘的Ig，通过自然被动免疫使新生儿获得免疫抗体。（） 2．慢性活动性肝炎、肝硬化患者的血清Ig呈多克隆性增高。（） 3．补体C3、C4的水平可用于反映系统性红斑狼疮的活动程度，在活动期增高。（）4．AIDS患者CD4+细胞减少，CD4/CD8比值降低，甚至倒置（<1）。( ) 5．T淋巴细胞表面有多种特异性抗原，称白细胞分化抗原（CD），例如CD3代表总T 淋巴细胞，CD4代表T抑制细胞（T S），CD8代表T辅助细胞（T H）等。( ) 6．由于A群溶血型链球菌感染后，血清中ASO持续数月到半年才下降至正常水平，故一次测定结果偏高，不一定就是近期感染的佐证。( ) 7．早期使用抗生素或免疫抑制剂治疗者，在伤寒沙门菌感染时，肥达反应可出现假阴性。（） 8．肥达反应单次效价增高，判断的可靠性较差，动态观察对诊断伤寒沙门菌感染意义更大。（） 9．检查梅毒螺旋体特异性IgG抗体，可用于观察判断疗效。（）

美国FDA分析方法验证指南中英文对照

美国FDA分析方法验证指南中英文对照 美国FDA分析方法验证指南中英文对 照 I. INTRODUCTION This guidance provides recommendations to applicants on submitting analytical procedures, validation data, and samples to support the documentation of the identity, strength, quality, purity, and potency of drug substances and drug products. 1. 绪论 本指南旨在为申请者提供建议，以帮助其提交分析方法，方法验证资料和样品用 于支持原料药和制剂的认定，剂量，质量，纯度和效力方面的文件。 This guidance is intended to assist applicants in assembling information, submitting samples, and presenting data to support analytical methodologies. The recommendations apply to drug substances and drug products covered in new drug applications (NDAs), abbreviated new drug applications (ANDAs), biologics license applications (BLAs), product license applications (PLAs), and supplements to these applications. 本指南旨在帮助申请者收集资料，递交样品并资料以支持分析方法。这些建议适 用于NDA，ANDA，BLA，PLA及其它们的补充中所涉及的原料药和制剂。 The principles also apply to drug substances and drug products covered in Type II drug master files (DMFs). If a different approach is chosen, the applicant is encouraged to discuss the matter in advance with

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则

化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则【】HGPH 5-1指导原则编号: 化学药物质量控制分析方法验证 技术指导原则 二??四年十一月 目录 一、概 述 ..................................................................... ............................................ 1 二、方法验证的一般原 则 ..................................................................... ................ 2 三、方法验证涉及到的三个主要方 面 (2) ,一,需要验证的检测项 目 ..................................................................... . (2) ,二,分析方 法 ..................................................................... .. (3) ,三,验证内 容 ..................................................................... .......................... 3 四、方法验证的具体内 容 ..................................................................... . (3)

,一,专属 性 ..................................................................... (3) 1、鉴别反 应 ..................................................................... (3) 2、杂质检 查 ..................................................................... (4) 3、含量测 定 ..................................................................... (4) ,二,线 性 ..................................................................... . (5) ,三,范 围 ..................................................................... . (5) 1、含量测 定 ..................................................................... (5) 2、制剂含量均匀度...................................................................... (5)

免疫学检查

免疫学检查 免疫学检查是什么 1、免疫学检查是机体识别“自身”与“非己”抗原，对自身抗体形成天然免疫耐受，对非己抗原产生排斥作用的一种生理功能的检测。正常情况下，这种生理功能对机体有益，可产生抗感染、抗肿瘤等维持机体生理平衡和稳定的免疫保护作用。在一定条件下，当免疫功能失调时，也会对机体产生有害的反应和结果，如引发超敏反应、自身免疫病和肿瘤等。 2、血清免疫学检测，是主要的免疫学检查。检查内容主要为：免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白M（IgM），免疫球蛋白D（IgD），免疫球蛋白E（IgE），心肌肌钙蛋白T（cTnT），肌红蛋白（Mb），类风湿因子（RF）。部分男性因为出现免疫性不育，即体内存在非正常的精子抗体，可以通过免疫学检查来诊断并对症治疗。 3、不孕不育的免疫学检查包括男性抗精子自身免疫不育、女性抗精子同种免疫不育和女性抗透明带免疫不育。用免疫学技术来检测精浆和血清中抗精子抗体，是了解男性不育原因的重要手段之一。 免疫学检查的意义与适应症 免疫学检查的意义在于检查不明原因的不孕不育男女。精子具有抗原性，在一定条件下能诱发特异性抗精子抗体产生，用免疫学方法检测原因不明的不育男女，发现有部分不育男性血清和（或）精浆、女性血清和（或）宫颈粘液中存在抗精子抗体，所以，目前公认抗精子抗体是免疫不育的重要原因。 检测抗精子抗体，除检测血清中抗体外还要注意生殖道内产生的局部抗体，如精浆和宫颈粘液中的抗体。抗精子抗体的检测方法很多，可能结果会不尽相同，应尽量采用新的、标准化的方法测定，结合病史和其他指标做综合判断。 免疫学检查的适应症是针对男性出现不育以及女性出现不孕的情况。当免疫学检查中如果出现异常结果，通过多项免疫学检查说明不孕不育，则需要进行针对性的治疗。 免疫学检查项目 免疫学检查项目包括免疫球蛋白G（IgG），免疫球蛋白A（IgA），免疫球蛋白M（IgM），免疫球蛋白D（IgD），免疫球蛋白E（IgE），心肌肌钙蛋白T（cTnT），肌红蛋白（Mb），类风湿因子（RF）。 免疫学检查项目：免疫球蛋白G 正常参考值：IgG 7.0-16.6克/升（7.0-16.6g/L） 意义： （1）IgG增高： ① IgG、IgA、IgM在机体的防御中发挥重要作用。若IgG、IgA、IgM几种不同的免疫