气相色谱法—内标法

什么叫内标法?怎样选择内标物?
    

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。
    

内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。
    

在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
    

影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。
    

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。
    

化学方面的因素包括：
    

1、内标物在样品里混合不好；
    

2、内标物和样品组分之间发生反应，
    

3、内标物纯度可变等。
    

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，
    

在制作内标标准曲线时应注意什么?
    

在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，

曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

归一化法、外标法、内标法的区别

色谱定量方法 一、归一化法 由于组分的量与其峰面积成正比，如果样品中所有组分都能产生信号，得到相应的色谱峰，那么可以用如下归一化公式计算各组分的含量。 (7.34) 若样品中各组分的校正因子相近，可将校正因子消去，直接用峰面积归一化进行计算。中国药典用不加校正因子的面积归一化法测定药物中各杂质及杂质的总量限度。 (7.35) 归一化法的优点是：简便、准确、定量结果与进样量重复性无关(在色谱柱不超载的范围内)、操作条件略有变化时对结果影响较小。 缺点是：必须所有组分在一个分析周期内都流出色谱柱，而且检测器对它们都产生信号。不适于微量杂质的含量测定。 二、外标法 用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线法是用对照物

质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。 外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量： W＝A(W)／(A)(7.36) 式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分的重量及相应的峰面积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。 外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。 三、内标法 选择样品中不含有的纯物质作为对照物质加入待测样品溶液中，以待测组分和对照物质的响应信号对比，测定待

色谱分析中归一化法、外标法、内标法的区别

色谱分析中面积归一化法、外标法、内标法适用范围及优缺点简介 在色谱分析中，即我们常用的高效液相色谱分析（HPLC）和气相色谱分析（GC）分析中，进行分析时，通常采用三种方法：面积归一化法、外标法、内标法。这三种方法的适用范围及各自的优缺点是什么呢？在这里简单做一介绍。 1、归一化法。即在一定分析条件下，样品经过直接溶解，过滤等操作以后,直接进分析仪器检测，得到色谱图。通常用于粗略检查样品中的各出峰成分含量，用于定性和粗略的定量。 优点：与进样量准确度无关、与仪器和分析条件有关。 缺点：a.在此条件之下，所有有效组分必须出峰，且所有组分必须在一个分析周期内流出色谱峰； b.定量计算必须先知道各成分的校正因子，校正因子的求出较麻烦。 2、易挥发性的油脂类化合物和混合性气体、液体，可用GC归一化法进行定量检测。例如食用油里面各成分的含量测定。 2、外标法。用待测组分的纯品作为对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号（即峰面积大小）相比较进行定量的方法。优点：简便；只关注待测成分出峰，不需要所有成分出峰。 缺点：a.必须有被测组分的纯品作为标准对照物； b.此方法准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。 3、内标法。选择样品中不含有的纯物质作为内标物加入待测样

品中，以待测组分和内标物的响应信号（即峰面积大小）对比，对待测组分定量的方法。 优点：a.是一种比较准确的定量方法； b.定量结果与进样量重复性无关（在色谱柱不超载范围内）； c.只需要内标物与被测物出峰，达到一定的分离度即可； d.常用于样品的GC定量检测以及微量成分含量检测； 缺点：配置较麻烦；内标物需要跟待测组分在同样条件下出峰，且分离度较好，所以选择合适的内标物比较困难。

制剂分析 外标法,内标法与混标法

书P83例7（内标法）：本品每1g含樟脑164mg，P86例8（外标法），P86例9本品每1g含黄芪甲苷为0.2mg，供试品制备取样量为1g.（对数方程外标两点法）可参考P231-233，6个验证内容。 小儿热速清口服液中黄芩苷的含量测定(外标一点法)： （1）对照品溶液的制备：取黄芩苷对照品约10mg，精密称定，置200ml量瓶中，加50%甲醇适量，置热水浴中振摇使溶解，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，即得。（实际浓度为0.0504mg/ml) （2）供试品溶液的制备：精密量取本品0.5ml，置D101大孔吸附树脂柱（内径约1.5cm，柱高10cm）上，用70ml水，以流量1.5ml/min洗涤，继续用40%乙醇洗脱，弃去7~9ml，收集续洗脱液，置50ml量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。 （3）标准曲线的绘制：精密吸取浓度为0.0504mg/ml的黄芩苷对照品溶液1.0ml，2.0ml，5.0ml，8.0ml，10.0ml，分别置10ml的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述对照液10ul注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量X（ug/ml）对峰面积Y进行回归处理，得回归方程Y=25.540x-0.1061（r=1.0000），结果见表1，表明黄芩苷进样量5.04~50.4ug/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，如图。 表1 黄芩苷对照品的线性关系考察 进样量(ug/ml) 峰面积回归方程相关系数 5.04 128.7 10.08 257.5 25.20 643.1 Y=25.540x-0.1061 r=1.0000 40.32 1029.6 50.40 1287.3 （4）专属性试验：在与样品测定完全相同的条件下，分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液及阴性对照液各10ul，进样分析，观察色谱图。如图2，阴性无干扰，说明该实验方法的专属性较强。

内标法和外标法的区别

内标法 目录 简介 内标法internal standard method 是色谱分析中一种比较准确的定量方法，尤其在没有标准物对照时，此方法更显其优越性。内标法是将一定重量的纯物质作为内标物（参见内标物条）加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按下列公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量： 按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。用含对照品和内标物的对照溶液所得色谱峰响应值，按下式算出 校正因子 （f）： f= (As/ms)/(Ar/mr) 其中As和Ar分别为内标物和对照品的峰面积或峰高，ms和mr分别为加入内标物和对照品的量。 再取各品种项下含有内标物的待测组分溶液进样，记录色谱图，再根据含内标物的待测组分溶液色谱峰响应值，计算含量（mi）：mi=f×Ai/(As/ms) 其中Ai和As分别为供试品和内标物的峰面积或峰高，ms为加入内标物的量。必要时，再根据稀释倍数、取样量和标示量折算成为标示量的百分含量，或根据稀释倍数和取样量折算成百分含量。 注意事项 当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的待测组分溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取

采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的已知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化合物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化合物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。 使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。 外标法 外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。 外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正因子求算法。 校正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，在从校正曲线查出样品的含量。 校正因子求算法时将标样多次分析后得到的响应信号与其含量求出它的绝 对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量

[讨论]内标法与外标法的应用

[讨论]内标法与外标法的应用 内标法：选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，跟据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对映内标物质加入量所进行含量测定方法。 内标法的优点：色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；缺点：选择合适的内标物质比教困难。 外标法：又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。外标法的优点：简单，适和大量样品分析。缺点：每次色谱条件很难相同，容易出现误差。 请问大家在做含量测定时依照什么原则来选定方法的？ 我们一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析，因提取步骤烦琐，都采用内标法进行校正，但如果仪器稳定、方法的重现性好，也可使用外标法，国外体内药物分析用外标法的也有不少，但本人认为最好使用内标法。 实际样品检测用外标法的更多。原因： 1.内标物难获得，特别是同位素标记的有相近行为的内标物； 2.操作步骤多、计算烦琐 如在新药报批中使用内标物，则需报送内标物的结构确证资料，在报生产的同时还要报送此内标物对照品。所以现在连SDA的专家都不推荐使用内标法。 最初使用内标是因为进样器进样不准确，采用内标可以校正进样误差。现在的HPLC用定量环进样准确度很高，加了内标有时候因为操作的误差反而降低准确度。在药物质量检验中，如果是原料药，或者制剂的成份不很多，用外标法即可，不一定非要用内标法，而且现在越来越多的标准都放弃了用内标法。 对于体内药物分析，分析方法的误差反而不是那么的重要，而在样品处理的过程中引入的误差要引起足够的重视，所以，一般在处理过程中加入内标以校正误差。这个时候，回收率的高低又不是绝对的要求很高，虽然要求绝对回收率在70%或者80%以上，但是，有时候低一些也无所谓，关键是回收率的稳定性，测定的重现性。 欢迎行家指点：） -------------------------------------------------------------------------------- 却是如此，我刚刚做完体内药物分析，内标法却是比较麻烦 -------------------------------------------------------------------------------- 个人认为体内分析应该用内标法，否则结果不准确。 -------------------------------------------------------------------------------- 但药典中一些原料药和制剂用的还是内标法 -------------------------------------------------------------------------------- 一般内标法能够消除进样量不准造成的系统误差，在采用自动进样器的前提下，这两种方法的精密度差别并不大。但是，建立内标法色谱条件明显要麻烦些，所以在采用自动进样器的仪器上，尽可以采用外标法进行测定。 药典中采用内标法进行测定的往往是一些老的品种，现在一般的趋势是采用外标法测定。实际上，内标法中需要对两个色谱峰进行积分同样也会引起误差增大的 -------------------------------------------------------------------------------- 体内药物分析，特别是需要提取步骤的，加入内标可消除提取过程带来的偶然误差，内标一定要在提取前加入到样品中并要混合均匀后再加入提取液，如此操作使提取的系统误差大大

仪器分析作业题外标法内标法

一、外标一点法 【含量测定】芍药苷 照高效液相色谱法（附录Ⅵ D)测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇／L 磷酸二氢钾溶液(40：65)为流动相；检测波长为230nm 。理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000。 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 含的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品粗粉约，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml ，称定重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。 本品含芍药苷(C 23H 28O 11)不得少于％。 解：设测得对照品溶液和供试品溶液峰面积为A 对=550000 A 样=7800 已知对照品溶液浓度C 对=ml ml /mg 0071.0ml /mg 5.0550000 7800)(===）（对对样样C A A C m g 5.177l 101000 m l 25l 10m l /m g 0071.0V C m =?? ?==μμ样样样 供试品中芍药苷的含量 X%= %5.35%1001000 g 5.0m g 5.177=?? 药典规定药材含芍药苷(C 23H 28O 11)不得少于％，供试品中芍药苷的含量为%，故供试品药材合格。

二、外标两点法 【含量测定】 黄芪甲苷 照高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(32：68)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 含的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品中粉约4g ，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml ，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4小时，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml ，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml ，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml ，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml 使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为，柱高为12cm)，以水50ml 洗脱，弃去水液，再用40％乙醇30ml 洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇80ml 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。 本品按干燥品计算，含黄芪甲苷(C 41H 68O 14)不得少于％。 解：设测得对照品溶液色谱峰面积分别为A 1=259457 A 2=523039，测得供试品溶液色谱峰面积A 3=2983。 已知对照品浓度C 对=ml ，对照品进样量 g 5mg 005.0l 10ml /mg 5.0m 1μμ==?= g 10mg 01.0l 20ml /mg 5.0m 2μμ==?= 根据对照品峰面积和进样量可得如下图所示方程即y=+5x-4125，得a=，b=5

通则0512高效液相色谱法

高效液相色谱法： 系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测， 由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。 色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。 超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、 高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱： 以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱： 用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶 和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。 （2）检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器， 其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器， 其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关； 蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器， 对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一 定范围内呈线性关系， 但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。 紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外－可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求； 采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。 蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相

高效液相色谱使用方法

高效液相色谱使用方法 一、开机 1、开机前准备：流动相使用前必须过0.45um的滤膜（有机相的流动相必须为色谱纯；水相必须用新鲜注射用水，不能使用超过3天的注射用水，以防止长菌或长藻类）；把流动相放入溶剂瓶中。A瓶：为水相B瓶：为有机相。 2、打开电脑，选Win 2000，进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标，放大CAG Boodp server小图标，出现窗口，5min内打开液相各部件电源开关，等待1100广播信息后，表示通讯成功连接，关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标，仪器自检，进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成： ——最上方为命令栏，依次为File，Run Control，Instrumen…等； ——命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等； ——中部为工作站各部件的工作流程示意图；依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告； ——中下部为动态监测信号； ——右下部为色谱工作参数：进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法： 从“Method”菜单中选择“New method”，出现DEF-LC.M，从“Method”菜单中选择“Edit entire method”，选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项，单击OK，进入下一画面。 2、方法信息： 在“Method Comments”中加入方法的信息，如方法的用途等。单击OK，进入下一画面。 3、泵参数设定：

气相色谱中的内标法或外标法(精)

谈谈内标准品（内标物质） 传统上在教科书中都会很模糊的告诉学生内标准的选择方式,例如说要选安定性好;与分析物性质要相近;在分析的基质中不能出现等,现在我对这些个" 选择方式"没有太大的兴趣,因为这个大家都知道,那现在就从另一个角度的来看看内标准品的选择还有哪些需要注意的. 1. 只选一个内标准品? 当然, 如果你的分析目标物就只有一个, 在正常的状况下,内标准"应该"也只会有一个才对! 但是如果你的分析是多成份的,那就必须十分小心地看待在一个分析方法内标准品的选择, 如果分析物的在层析图中是平均分布在各处, 那你就必须看看你的检测方法中是否有规定内标物与分析物之间的滞留时间差范围是多少,依此规定来选择内标,但是如果并没有规定,最好也是选择一个以上的内标来使用,因为即使化学性质不会差太多,但在沸点方面却会有满大的差异, 内标与分析物的沸点差异过大,在GC的注射口中就无法把因为discrimibation（分辨）所造成的误差校正回来. 如果你的分析物是性质相差颇大的 (例如说同时含有醇,酸...,那别怀疑一定是要使用一个以上的内标准品,如果多个物种再加上多成份,那就很复杂了. 最低的限度也要依照分析物的沸点高低来使用多个不同的内标准品. 在美国环保署的检验方法USEPA 8270C,是一个检测半挥发性的污染物的规范,前后列了不下一百种的分析物,就使用了六个不同的内标准品作为校正的依据,来照顾到各个不同沸点的分析物!! 滥用药物分析大概是最严谨的了,即使是结构性质极相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析时为求准确,都是以各自的D同位素取代的标准品作为内标. 2.基质中一定不能存在? 这个问题当然是肯定的, 不然定量结果会很不稳定或者是很凄惨. 但是有些时候你根本不知道哪些东西在分析样品的基质中不会存在! 这时候怎么办? 找以往的文献看看别人是用甚么,这是一个方法, 但要注意的是文献不一定就是对的! 使用分析物的氢同位素(D取代物,是最妥当的,但问

内标法与外标法

内标法与外标法 一、内标法 什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。 在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值? 影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。 由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。 化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好； 2、内标物和样品组分之间发生反应， 3、内标物纯度可变等。 对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定， 在制作内标标准曲线时应注意什么? 在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。 二、外标法

高效液相色谱习题及参考答案

高效液相色谱习题及参考答案 一、单项选择题 1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。 A、分配色谱法 B、排阻色谱法 C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法 2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。 A、检测器 B、记录器 C、色谱柱 D、进样器 3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？ A、0.5μm B、0.45m C、0.6μm D、0.55μm 4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？ A、改变流动相的种类或柱子 B、改变固定相的种类或柱长 C、改变固定相的种类和流动相的种类 D、改变填料的粒度和柱长 5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（） A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43） C、正庚烷/异丙醇（93/7） D、乙腈/水（1.5/98.5） 6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。 A、紫外检测器 B、荧光检测器 C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（）范围内。 A 、10～30cm

B、20～50m C 、1～2m D、2～5m 8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（） A、组分与流动相 B、组分与固定相 C、组分与流动相和固定相 D、组分与组分 9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（）的操作 A、改变柱长 B、改变填料粒度 C、改变流动相或固定相种类 D、改变流动相的流速 10. 液相色谱中通用型检测器是（） A、紫外吸收检测器 B、示差折光检测器 C、热导池检测器 D、氢焰检测器 11. 在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器 A、荧光检测器 B、示差折光检测器 C、电导检测器 D、紫外吸收检测器 12. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（） A、提高柱温 B、降低板高 C、降低流动相流速 D、减小填料粒度 13. 在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（） A、改变固定相种类 B、改变流动相流速 C、改变流动相配比

气相色谱中的内标法或外标法

气相色谱中的内标法或外标法 谈谈内标准品(内标物质) 传统上在教科书中都会很模糊的告诉学生内标准的选择方式,例如说要选安定性好;与分析物性质要相近;在分析的基质中不能出现等,现在我对这些个" 选择方式"没有太大的兴趣,因为这个大家都知道,那现在就从另一个角度的来看看内标准品的选择还有哪些需要注意的. 1. 只选一个内标准品? 当然, 如果你的分析目标物就只有一个, 在正常的状况下,内标准"应该"也只会有一个才对! 但是如果你的分析是多成份的,那就必须十分小心地看待在一个分析方法内标准品的选择, 如果分析物的在层析图中是平均分布在各处, 那你就必须看看你的检测方法中是否有规定内标物与分析物之间的滞留时间差范围是多少,依此规定来选择内标,但是如果并没有规定,最好也是选择一个以上的内标来使用,因为即使化学性质不会差太多,但在沸点方面却会有满大的差异, 内标与分析物的沸点差异过大,在GC的注射口中就无法把因为discrimibation(分辨)所造成的误差校正回来. 如果你的分析物是性质相差颇大的 (例如说同时含有醇,酸...),那别怀疑一定是要使用一个以上的内标准品,如果多个物种再加上多成份,那就很复杂了. 最低的限度也要依照分析物的沸点高低来使用多个不同的内标准品. 在美国环保署的检验方法USEPA 8270C,是一个检测半挥发性的污染物的规范,前后列了不下一百种的分析物,就使用了六个不同的内标准品作为校正的依据,来照顾到各个不同沸点的分析物!! 滥用药物分析大概是最严谨的了,即使是结构性质极相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析时为求准确,都是以各自的D同位素取代的标准品作为内标.

高效液相色谱法的计算方法

高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。 （2) 分离度（R)

色谱定量分析,外标法和内标法如何进行选择

色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择 色谱定量分析，外标法和内标法如何进行选择色谱分析的重要作用之一是对样品定量。而色谱法定量的依据是：组分的重量或在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。常见定量分析方法分为面积归一化法、内标法、外标法、标准曲线法等。大家常常容易傻傻分不清楚的莫过于内标法、外标法了。 以内标法为例，选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数，用内标法公式计算即可。 其实，从定义上来区分的话，外标法就是用标准品的峰面积或峰高与其对应的浓度做一条标准曲线，测出样品的峰面积或峰高，在标准曲线上查出其对应的浓度，这是最常用的一种定量方法； 内标法是对应外标法说的，内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。 外标法需要用样品和标准品对比，但是有时我们很难保证样品和标准品进的体积是一样的，毕竟要有误差，这时候就用内标法，就是在外标法的基础上,在样品和标准品里在加入一种物质，通过加入物质的峰面积或峰高的变化,就可以看出我们标准品和样品进样体积的差别，但同时会引进加入物质的秤量误差。所以一般用外标法来定量，如果进样体积很难掌握，就用内标法，可以消除进样体积的误差。 外标法 外标法（标准曲线法、直接比较法）首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。 具体作法是：用标准样品配制成不同浓度的标准系列，在与欲测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正法，即直接比较法定量。单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法的误差较大。因此规定，y=ax+b（b的绝对值应不大于100%响应值是y的2%）。 标准曲线法的优点：绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了，计算时可直接从标准工作曲线上读出含量，这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间，在此段时间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正，以确定该标准工作曲线是否还可使用。

高效液相色谱法标准操作规程

范围：原料、产品 职责：检验室对本规程的实施负责 正文： 1.原理 ——高效液相色谱法是将具一定性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 ——高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。 2.操作前的准备 2.1流动相的制备用高纯度的试剂配制流动相，必要时照紫外分光光度法进行溶剂检查，应符合要求；水应为新鲜制备的高纯水。凡规定PH值的流动相、应使用精密PH计进行调节。配制好流动相应通过适宜的0.45μm滤膜滤过，用前脱气，应配制足量的流动相及时待用。 2.2供试溶液的配制供试品用规定溶剂配制成供试溶液定量测定时，对照品溶液和样品供试溶液均应分别配制2份。供试溶液在注入色谱仪前，一般应经适宜的0.45μm滤膜滤过。必要时在配制供试溶液前，样品需经提取净化。以免对色谱系统产生污染或对色谱干扰。 3.系统适用性试验 ——按各品种项下要指法训练对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。 3.1色谱柱理论板数（n）在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t R （以 分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（W h/2），按n=5.54(t R / W h/2 )2计 算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。 3.2分离度定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： 2（t R2- t R1 ） R= W 1+W 2 式中t R2 为相邻两峰中后一峰的保留时间； t R1 为相邻两峰中前一峰的保留时间；

内标法及外标法方法、原理、优缺点

An internal standard should be used when performing MS quantitation. An appropriate internal standard will control for extraction, HPLC injection and ionization variability. In a complex matrix it is not uncommon for two different standard levels in SRM integrated plots, at the lower end of the standard curve, to give nearly an identical response. It is only when an internal standard is used that the two points can be differentiated. Some researchers attempt to prepare standard curves and run samples without an internal standard and find moderate success. Often without an internal standard % RSDs of replicates can be as high as 20%. Using an internal standard the % RSDs can be brought down to approximately 2%. We run triplicates at each level of our standard curve. How do I choose an internal standard? The best internal standard is an isotopically labeled version of the molecule you want to quantify. An isotopically labeled internal standard will have a similar extraction recovery, ionization response in ESI mass spectrometry, and a similar chromatographic retention time. If you are performing non-clinical PK quantitation it may be difficult to justify such a standard since a special synthesis of an isotopically labeled standard can be expensive and time consuming. Often if you are working with medicinal chemists they will have a library of compound analogs that can be used as internal standards. These analogs were made in the evolution of the compound to be tested and will be similar to the compound to be quantified and more importantly will be slightly different by parent mass. Try to avoid using de-methylated (-14) or hydroxylated (+16) analogs as internal standards since these are the most common mass shifts observed in naturally occuring metabolites of the parent compound. A common internal standard is a chlorinated version of the parent molecule. A chlorinated version of the parent molecule will commonly have a similar chromatographic retention time which is an important characteristic of an internal standard. We have found that one of the most important characteristics of an internal standard is that it co-elutes with the compound to be quantified.

外标法与内标法的比较

外标法 仪器分析常用的方法之一，是比较法的一种。与内标法相比，外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。 外标法在操作和计算上可分为校正曲线法和用校正因子求算法。 校正曲线法是用已知不同含量的标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，也就是校正曲线。定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，在从校正曲线查出样品的含量。 校正因子求算法时将标样多次分析后得到的响应信号与其含量求出它的绝对校正因子，再根据公式求出待测样品中的含量。 内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。选择内标物有4个要求： 1.内标物应是该试样中不存在的纯物质； 2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离； 3.加入内标物的量应接近于被测组分； 4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。 内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。 内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。