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DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因

DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因
DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因

DD-PCR筛选皮罗卡平致痫大鼠海马差异表达基因1

王成 游自立 夏晴 熊涛 夏阳 尧德中

电子科技大学生命科学与技术学院 成都 (610054)

E-mail: youzili@https://www.wendangku.net/doc/119321519.html,

摘要:为了研究皮罗卡平(Pilocarpine)致痫大鼠海马神经细胞丢失,苔藓纤维出芽在癫痫中的分子机制,以癫痫持续状态7天大鼠海马为材料,应用mRNA差异显示技术(DD-PCR)筛选差异表达基因。结果发现13个差异表达基因,其中7个基因在Pilocarpine致痫组高表达,6个基因在Pilocarpine致痫组低表达。这些差异表达基因可能在癫痫发生中起重要作用。

关键词:癫痫;海马;DD-PCR;皮罗卡品

1.引言

癫痫为人类常见神经系统疾病,一般人群中的年患病率为 0.5-7‰[1,2],其中颞叶癫痫为最常见的一类[3]。实验动物模型中,大鼠Pilocarpine癫痫模型在临床及病理特征均类似于人类颞叶癫痫,是一种理想的颞叶癫痫模型[4]。Pilocarpine致痫后,癫痫大鼠海马CA1、CA3区和齿状回神经纤维均发生苔藓样异常出芽以及神经元丢失[5,6],这些病变对颞叶癫痫的产生及发展起着至关重要的作用[7]。但癫痫大鼠海马神经元丢失及神经纤维苔藓样出芽的分子机制至今尚不清楚。本实验利用mRNA差异显示技术(DD-PCR)对大鼠海马神经元丢失及神经纤维苔藓样出芽的分子机制进行初步分析。

2.材料与方法

2.1实验动物分组及癫痫模型制作

健康雄性成年SD大鼠16只(由四川省医学科学院实验动物研究所提供),体重180-220g,随机分组,对照组6只,实验组10只。实验组按3meq/kg腹腔注射氯化锂,20小时后以30mg/kg剂量腹腔注射盐酸皮罗卡品(Fluka公司),对照组大鼠注射等量生理盐水。实验组大鼠注射皮罗卡品约15分钟后出现癫痫持续状态(status epilepicus, SE),在SE 60分钟后按4mg/kg腹腔注射地西泮以中止癫痫持续状态。选取癫痫发作程度在Racine Ⅳ级以上者饲养7天,7天后断头处死剥离出海马,进行RNA提取。

2.2 RNA提取

用Trizol (Molecular research center, inc)提取大鼠海马总RNA,然后用RQ1 RNase-free DNase (Promega)去除总RNA中的DNA。紫外分光光度计测定总RNA的浓度,其中各样品的

1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金(项目编号:20020614004)、国家自然科学基金(项目编号:30570474)资助。

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OD260/OD280均大于2.0。

2.3 mRNA差异显示

cDNA第一链的合成按照RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI Fermentas)进行,取4μg总RNA与2μg锚定引物(分别为T15A, T15C 和T15G),用DEPC处理水补至12μl,70℃孵育5 min。然后分别加入4μl 5×反转录缓冲液、1μl Ribolock TM Ribonulease inhibitor 和2μl 10mM dNTP ,37℃孵育5 min后加入1μl RevertAid TM M-MuLV reverse transcriptase,42℃孵育60 min。最后70℃温浴10 min以终止反应。

取2μl反转录产物进行DD-PCR,在25μl体系中含有2μl cDNA,2μM 3’锚定引物与5’随机引物(序列见表1),200 μM dNTPs及2U Taq DNA聚合酶。反应程序如下:94℃预变性4 min, 94℃变性1 min,34℃退火4 min,72℃延伸1.5 min进行4个循环,然后94℃变性1 min,38℃退火2 min,72℃延伸1.5 min进行40个循环,最后72℃延伸10 min。

PCR结束后取10μl PCR产物进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(含7mol/L尿素),500V 恒压电泳约4h,当二甲苯氰抵达胶底时结束电泳并进行银染。

表1.DD-PCR引物序列

锚定引物随机引物

M1: T15A M2: T15C M3: T15G

S1: CTTTCTACCC S2: GGAACCAATC S3: TCGATACAGG S4: TCGGTCATAG S5: GGTACTAAGG S6: CTGCTTGATG S7: GTTTTCGCAG S8: GATCAAGTCC S9: GATCTAACCG S10: GATCATAGCG S11: GGAAGCAGCT S12: GCCATGCACG S13: GTCACGGACG S14: GAGCTATGGC S15: AGCCTGTGTC

2.4差异条带再扩增、克隆及测序

压碎与浸泡法回收PCR差异片段[8],差异片段再扩增时使用相同的引物组与PCR反应条件,仅将dNTPs浓度提高一倍。PCR反应程序为:94℃预变性4 min,94℃变性1 min,38℃退火2 min,72℃延伸1.5 min进行40个循环,72℃延伸10 min。再扩增PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离,并用胶回收试剂盒(申能博彩)纯化后与pUCm-T载体(申能博彩)连接,重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取白色克隆,提取质粒进行PCR及酶切鉴定,并对阳性克隆进行测序。测序结果与Genbank数据库(NCBI)进行同源性比较。

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3.结果

3.1银染mRNA差异显示

DD-PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染后出现34条差异条带。将差异片段回收再扩增后进行克隆并测序。测序结果与Genbank数据库进行同源性比较发现12条差异表达ESTs在Genbank中存在高同源性基因,无同源性基因的差异表达ESTs中存在一条带PolyA 尾巴的差异片段,应为某未知基因的3’端,其核酸序列见图1。该13条差异表达片段的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图2。

图2.mRNA差异显示电泳结果

1,3,5,7,9,11,13,15为对照组样品;2,4,6,8,10,12,14,16为试验组样品。

箭头标识处为对照组与实验组差异显示条带。

图1. 差异片段EPR13核酸序列

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3.2差异表达序列分析

在本实验中,实验组(Li-Pilocarpine 致痫组)与对照组相比,其大脑海马区众多基因有不同程度地差异表达。与对照组相比,实验组有些基因是高表达,有些基因是低表达,详见表2。

表2. Li-Pilocarpine 致痫大鼠海马差异表达ESTs分析

差异片段编号同源基因同源性

(%)

基因库序号表达量

EPR1 EPR2 EPR3 EPR4 EPR5 EPR6 EPR7 EPR8 EPR9 EPR10 EPR11 EPR12 EPR13

Fbxo38_predicted

ATPase synthase subunit 6

GATA binding protein 3

Dstonin

Glutamate receptor 1

Psmd11_predicted

Timm23

App

NG5 protein

Calmodulin 1

NGF-IA

PAF-AH beta

未知

100

99

93

93

88

100

100

100

99

100

98

99

XM_225885

AF504920

NM_008091

NM_133833

NM_008165

XM_220754

NM_019352

NM_019288

BC089986

NM_031969

J04154

BC072510

降低

升高

升高

升高

升高

升高

升高

升高

降低

降低

降低

降低

降低

注:EPR为Epilepsy relative EST

4.讨论

自1992年Liang和Pardee[9] 建立mRNA差异显示技术(DD-PCR)以来,此方法不断进行改进并被大家广泛采用。本实验利用DD-PCR结合银染法染色,经济、快速,而且不需昂贵设备。

大鼠Pilocarpine癫痫模型是一种理想颞叶癫痫模型。Pilocarpine致痫后,用Neo-Timm染色发现癫痫持续状态后第四天即有海马齿状颗粒细胞轴突内分子层苔藓纤维出芽,随后海马神经元开始缺失,第100天达到平台期[6]。但神经元丢失,苔藓纤维出芽,新的神经回路的形成以及伴随其中的神经发生和生长的分子机制仍然不能被彻底的解释清楚。所以本实验以癫痫持续状态后7天大鼠海马为材料,应用mRNA差异显示技术筛选差异表达基因,试图初步了解海马神经细胞丢失,苔藓纤维出芽,新的神经回路的形成的分子机制。

差异表达片段测序结果与Genbank数据库进行同源性比较发现12个差异表达基因。其中ATPase synthase subunit 6(包含cytochrome oxidase subunit III和NADH dehydrogenase subunit III),Glutamate receptor 1,App,Calmodulin 1,NGF-IA 5个基因已有文献报道与癫痫相关。而Fbxo38_predicted,Dstonin,Psmd11_predicted,Timm23,NG5 protein,PAF-AH

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beta,GATA binding protein 3等7个基因尚无与癫痫相关报道。

参考文献

[1]Ure JA, Perassolo M. Update on the pathophysiology of the epilepsies. J NeurolSci 2000, 177: 1-17

[2]Jacobs MP, Fischbach GD, Davis MR, et al. Future directions for epilepsy research. Neurology 2001,

57:1536-1542

[3]Brown TR, Holmes GL. Handbook of epilepsy, 2nd Ed. Lippincott William and Wilkins, Philadelphia,

2000(P5)

[4]Clifford DB, Olney LW, Maniotis A, et al. The functional anatomy and pathology of lithium-pilocarpine and

high-dose pilocarpine seizures]. Neuroscience,1987,23:953-968

[5]Lehmann TN, Gabriel S, Eilers A, et al. Fluorescent tracer in pilocarpine-treated rats shows widespread

aberrant hippocampal neuronal connectivity. Eur J Neurosci 2001 Jul;14(1):83-95

[6]Mello LEAM, Cavalheiro EA, Tan AM, et al. Circuit mechanisms of seizures in the pilocarpine model of

chronic epilepsy: cell loss and mossy fiber sprouting. Epilepsia,1993, 36:985-995

[7]Zhang X, Cui SS, Wallace AE, et al. Relations between brain pathology and temporal lobe epilepsy. J Neurosci.

2002 Jul 15;22(14):6052-61

[8]Sambrook J, Russell DW. 黄培堂等译. 分子克隆实验指南,3nd Ed. 北京:科学出版社,2002.8 P426-429

[9]Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by the polymerase chian reaction.

Science,1992,257:967~971

Screening of differential expression genes with DD-PCR in

hippocampus of pilocarpine-induced epileptic rats

Wang Cheng, You Zili, Xia qing, Xiong Tao, Xia Yang, Yao Dezhong School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology of

China, Chengdu, 610054

Abstract

To investigate the molecular mechanisms of neuronal loss and mossy fiber sprouting in hippocampus of pilocarpine-induced epileptic rats, we used the differential display-polymerase chain reaction (DD-PCR) protocol to screen the differential expression genes. The hippocampus both from status epilepicus rats and control rats were dissected and then total RNAs were isolated. It was showed that there are 13 genes differentially expressed in the seventh day of experimental rats, with 7 elevated genes and 6 reduced genes. Their roles in the development of epileptic rat are being explored.

Keywords: Epilepsy, Hippocampus, DD-PCR, Pilocarpine

作者简介:王成,男,电子科技大学生物物理学2004级硕士研究生。

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药理学--青霉素

青霉素 综述: 青霉素类抗生素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称,由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁,而人类只有细胞膜无细胞壁,故对人类的毒性较小,除能引起严重的过敏反应外,在一般用量下,其毒性不甚明显,但它不能耐受耐药菌株(如耐药金葡)所产生的酶,易被其破坏,且其抗菌谱较窄,主要对革兰氏阳性菌有效。青霉素G有钾盐、钠盐之分,钾盐不仅不能直接静注,静脉滴注时,也要仔细计算钾离子量,以免注入人体形成高血钾而抑制心脏功能,造成死亡。 青霉素类抗生素的毒性很小,是化疗指数最大的抗生素。但其青霉素类抗生素常见的过敏反应在各种药物中居首位,发生率最高可达5%~10%,为皮肤反应,表现皮疹、血管性水肿,最严重者为过敏性休克,多在注射后数分钟内发生,症状为呼吸困难、发绀、血压下降、昏迷、肢体强直,最后惊厥,抢救不及时可造成死亡。各种给药途径或应用各种制剂都能引起过敏性休克,但以注射用药的发生率最高。过敏反应的发生与药物剂量大小无关。对本品高度过敏者,虽极微量亦能引起休克。注入体内可致癫痫样发作。大剂量长时间注射对中枢神经系统有毒性(如引起抽搐、昏迷等),停药或降低剂量可以恢复。 分类: 按其特点可分为: 青霉素G类:如青霉素G钾、青霉素G钠、长效西林等。 青霉素V类:(别名:苯氧甲基青霉素、6-苯氧乙酰胺基青霉烷酸) 如青霉素V钾等(包括有多种剂型)。 耐酶青霉素:如苯唑青霉素(新青Ⅱ号)、氯唑青霉素等。 广谱青霉素:如氨苄青霉素、羟氨苄青霉素等。 抗绿脓杆菌的广谱青霉素:如羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、呋苄青霉素等。 氮咪青霉素:如美西林及其酯匹美西林等,其特点为较耐酶,对某些阴性杆菌有效,但对绿脓杆菌效差。 药理作用: 内服易被胃酸和消化酶破坏。肌注或皮下注射后吸收较快,15~30min达血药峰浓度。青霉素在体内半衰期较短,主要以原形从尿中排出。 青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。青霉素的结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似,可与后者竞争转肽酶,阻碍粘肽的形成,造成细胞壁的缺损,使细菌失去细胞壁的渗透屏障,对细菌起到杀灭作用。 对革兰阳性球菌及革兰阳性杆菌、螺旋体、梭状芽孢杆菌、放线菌以及部分拟杆菌有抗菌作用。 青霉素对溶血性链球菌等链球菌属,肺炎链球菌和不产青霉素酶的葡萄球菌具有良好抗菌作用。对肠球菌有中等度抗菌作用,淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、白喉棒状杆菌、炭疽芽孢杆菌、牛型放线菌、念珠状链杆菌、李斯特菌、钩端螺旋体和梅毒螺旋体对本品敏感。本品对流感嗜血杆菌和百日咳鲍特氏菌亦具一定抗菌活性,其他革兰阴性需氧或兼性厌氧菌对本品敏感性差.本品对梭状芽孢杆菌属、消化链球菌、厌氧菌以及产黑色素拟杆菌等具良好抗菌作用,对脆弱拟杆

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变,只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出的新方法不断出现,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA)。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象,一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法,仅检测第5-8外显子即可发现85%以上的p53基因突变。由于该法简便快速,特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法(HA) HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100%。

大鼠 海马 电生理学杂记

神经系统由大量的神经元构成。这些神经元之间在结构上并没有原生质相连,仅互相接触, 其接触的部位称为突触 细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分,又可分为树突和轴突。 树突棘是树突表面的棘状突起,也就是形成突触的部位 一般认为,NMDA受体主要分布在神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元,NMDA受体主要 分布在树突棘头的突触后膜,且主要分布在突触后致密区(postsynaptic density, PSD) 突触可塑性:突触在形态和传递效能上的改变 突触后致密区(PSD):在电镜下所见的突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的物质,见 于cns中所有树突棘突触的突触后膜上。主要功能是细胞粘附性的调节,受体集聚的控制和 受体功能的调节。 旷场试验:用来观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为 反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为,以尿便次数反应其紧张度。 开场实验,open field test,这个测的是5min内,动物在一个开阔环境中的行为学变化,我 们用一个强光打在开场中央,开场有方形和圆形两种。圆形是一个大缸,白色的,具体尺寸 我忘记了。需要用的指标是:跨格数、站立数、排便数和梳理数(也就是理毛次数),前两 个指标为主。这个实验可以用中央场次数作为焦虑样行为的观察指标。 运动能力(locomotion, open field test 主要是评价动物的焦虑状态,它主要以动物进入中央区的时间百分率来评价焦虑状态,它也可以度等。 物在一个开放的新的地方会很小心,rodent动物喜暗而避明的特性会让自己躲在暗处,也会 对开阔地方有探索行为(好奇心),同时又有害怕紧张担心和焦虑心理,具有一定的新奇性 同时又具有一定的害怕。如果动物焦虑少,停留在中间等位置时间长久一些,不然反之。比 较这些特性可以比较动物的焦虑程度。具有抗焦虑作用的药物会让动物有更多的对开阔地方 有探索行为,焦虑紧张的动物更喜欢停留在开场的边缘和暗处。 LTP定义:给突触前纤维一个短暂的高频刺激后,突触传递效率和强度增加几倍且能持续数 小时至几天保持这种增强的现象。按LTP的时程分①PTP,强直后增强,一般5分钟后衰减; ②STP,短时程增强,持续半小时左右;③,LTP长时程增强,持续一小时以上 CaMKII这个蛋白是个很特殊的蛋白,在脑内含量非常高,大约占总蛋白量的1-2%。在突触 部位的含量很高,并且是PSD(postsynaptic density)主要蛋白。但这个蛋白最特殊之处是 其具有自身调节能力,仿佛自己本身就是一个具有学习记忆的功能。 因为把随着神经等器官、组织的兴奋所产生的动作电位作为其活动指标是最容易记录的现 象,所以常常用记录动作电位来深入研究神经系统等的机能。 高频刺激可引发突触后细胞的持久增强反应——最初被称为“持久增强作用”(

青霉素与人类健康

第25卷 增刊大学化学2010年4月 青霉素与人类健康 刘磊 许家喜 (北京化工大学理学院有机化学系化工资源有效利用国家重点实验室 北京100029) 摘要 青霉素是一类广泛应用的重要抗生素,在与细菌作斗争和保护人类健康中起重要作 用。本文主要介绍青霉素的发现、发展、结构和分类,以及青霉素的作用机制、用量和使用方法、过 敏反应机制等。 19世纪和20世纪初,霍乱、疟疾、肺炎、肺结核、鼠疫等疾病是人类面临的最大威胁。那时候的人只要得了这些疾病,就像接到了死神的通知书一样,只能慢慢地等待生命的结束。20世纪,欧洲曾爆发了一次大鼠疫,整个欧洲大陆竟有1500万人丧生。直到1928年,随着青霉素的发现,这些威胁才彻底消失。 1 青霉素的发现及其发展 1.1 青霉素的发现 1928年9月初,苏格兰细菌学家亚历山大?弗莱明(A lexander Fle m ing)博士结束休假回到自己位于伦敦圣玛丽医院地下室的实验室,他按照习惯,一回到实验室就去观察工作台上盛有培养液的培养皿。这次,一只已经发霉长毛的培养皿引起了他的注意,望着这只长着蓝绿毛的培养皿,他惊奇地发现绿毛周围的葡萄球菌都消失了。他意识到这些葡萄球菌的消失可能与这些绿色的青霉有关。于是他把青霉的培养液滴到葡萄球菌中,几个小时后发现青霉附近的葡萄球菌都被杀死了。经过仔细研究,他发现,原来青霉生长时会释放出一种物质,这种物质可以很好地抑制和杀死葡萄球菌。弗莱明就把这种物质命名为“盘尼西林(penicillin)”,即青霉素[1]。但是,由于缺乏化学知识,他并没有得到纯净的盘尼西林,他的发现在当时也没有引起他人的重视。 1938~1939年,澳大利亚病理学家弗洛里(Howard W alter Fl orey)正在研究微生物产生的抗生物质,他对弗莱明发现的青霉素产生了浓厚的兴趣。幸运的是,弗洛里得到了德国化学家钱恩(Ernst Boris Chain)和英国生物化学家希特利(Nor man Heatley)的帮助。他们共同提取纯化青霉素,得到了纯净的青霉素[2]。1940年的首次人体实验发现青霉素的疗效非常好,而且用量很少,副作用很低。青霉素的发现揭开了人类抗菌史的新篇章,弗莱明、弗洛里和钱恩因此获得了1945年诺贝尔生理和医学奖。二战期间,出现了大量伤员,为了防止伤员伤口感染及其他疾病,药厂开始大量生产青霉素来挽救数以万计的生命。 1.2 青霉素的发展 1942年3月14日,默克公司首次使用自己生产的青霉素治愈了一位由链球菌引起败血病的病人[3]。当时使用了世界上生产的青霉素总量的一半来治疗这位病人。到1942年6月,

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变 一、教学目的与要求: (1)了解基因突变的类型和性质、特征 (2)掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 (3)理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点: 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] (1)通过出示基因结构变化的示意图,加深学生对基因突变内涵的理解。 (2)课堂教学中不断提出问题,让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2.教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析,使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错,基因中个别碱基的变化,就会造成性状改变。 3.教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源? [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别,联系实际举例。 三、教学方法设计: 四、教具或教学手段:多媒体课件 五、教学过程与板书设计:

第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变:指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变:指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变:A a 显性突变:a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变,为“诱发突变” 形态突变型—可见突变:指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率:指生物体在每一世代中发生突变的机率,或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如:氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的,有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症;尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症;酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究进展

电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的 研究进展 (作者: _________单位:____________ 邮编:___________ ) 【摘要】目前,电针对脑缺血模型大鼠海马细胞影响的研究报道很多,对海马与学习记忆关系的研究已成为国内研究的重 点。本文就电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作简要综述。 【关键词】电针海马物质 海马的生理功能目前仍在探讨之中.大量的动物模型研究表明,海马与学习记忆有关。当脑缺血等致海马受损时,可引起学习记忆功能的严重障碍。电针刺特定穴位可影响脑功能障碍大鼠海马物质的表达。现就目前电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作一综述。 1电针对海马细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1.1 Bel ]2是功能最为明确的细胞凋亡拮抗基因Bcl[2蛋白基本生物学功能为延长细胞的生命期限、增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性。Bax与Bcl]2作用相反,能够促进凋亡,Bcl〕2表达水平较高时,形成Bcl[2/Bcl[2同源二聚体,抑制细胞凋亡;Bax表达水平较高时,形成

Bax/Bax同源二聚体,加速细胞凋亡;BcL2和Bax水平相当 时,则形成Bcl[2/Bax异源二聚体,终止细胞凋亡。近年的研究提示 Bcl[2与Bax调节细胞凋亡,不仅取决于自身表达的高低,还与 Bax/Bcl_2比率有关,当比率增大时,细胞趋于凋亡[1 ]o caspase ]3 激活是触发凋亡的关键(有“分子开关”之称是凋亡的最终执行蛋白。Bcl]2家族基因在调节线粒体通透性上发挥重要作用,Bcl]2或其他 抗凋亡Bcl_2家族成员下调,或促凋亡Bcl_2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位,均导致线粒体通透性增加,使细胞色素C 从线粒体释放入胞浆,与Apaf”、dADP形成复合体,再与胞浆中的caspase ]9前体形成凋亡小体,导致caspase[9被裂解激活,随后再裂解caspase家族其他成员包括caspase[3,引发凋亡。赵建新等[2] 报告电针刺激脑缺血小鼠“肾俞”膈腧”百会;各观察时点均可上调小鼠海马细胞Bcl[2表达,下调Bax表达,降低凋亡率。故电针可起到抑制凋亡、保护神经元的作用电针可显著上调内源性海马Bcl[2表达,降低Bax表达,有可能进一步抑制caspase [3的激活,或影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用,有待今后动物实验验证。Noxa为BH3only 亚家族成员]3],脑缺血研究发现,Noxa在脑缺血引起的细胞凋亡中起重要作用[4 ]。朱燕珍等]5]报告,电针刺激血管性痴呆模型大鼠“大椎百会:海马CA1区的Noxa阳性细胞数增加,Caspase ]3 阳性细胞数增加,提示Noxa调节的线粒体凋亡途径促进血管性痴呆的发展;电针治疗抑制

基因突变的检测方法(完整资料).doc

此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变,只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且 由PCR衍生出的新方法不断出现,目前已达二十余种,自动化 程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA)。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象, 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过

基因文库中目的基因的筛选

基因文库中目的基因的筛选 克隆基因的方法有很多,根据研究基础的不同,可以使用以下的方法克隆目的基因: 1. PCR或RT-PCR法 2. 从基因文库中分离基因 3. 从cDNA文库中分离基因 4. 转座子标签法 5. 图位克隆法 6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法 7. 人工合成法 本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。 获的目的克隆的方法有两种 1)目的基因的直接选择 2)从基因文库中筛选 称为鸟枪射击法,建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆,从中筛选目的克隆。 一、直接选择 直接选择的基因比较少,如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因,在R6-5质粒上含有四种抗性基因:kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物,kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中,连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝,其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。 1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因,编码色氨酸合成

酶,一个突变系不能合成色氨酸,只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA,然后酶切,连接产生大量重组DNA分子,其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞,大部分转化子是缺陷型的,携带trpA的重组子将是野生型的,可以在基本培养基上生长。 1.2 标记援救的范围和限制 存在两个限制因素: 1)必须存在着目的基因的突变品系 2)需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言,标记援救适用于微生物的合成酶,可以在基本培养上选择。

基因突变检测多少钱检测方法是什么

基因突变检测多少钱检测方法是什么 一代测序法(Sanger法): 科学家Sanger,于1977年建立,他本人也因此而获得了诺贝尔奖。该技术至今已用 三十多年,现在已相当成熟完善。人类基因组计划的测序工作就是使用该项技术完成的, 现在***的仪器是美国ABI公司的***3730型全自动遗传分析仪,是经过国际和国家认证的仪器,可重复性达到100%,是亲子鉴定和法医鉴定的专用仪器。该方法是目前基因检测的国际金标准。缺点是通量小,适合少量样本,可进行个性化位点检测,成本极高,比芯片 或高通量检测高100倍。 Taqman法: 准确性好,适合于大量样本、少量位点,价格贵,缺点是不能读出序列,不太直观。 质谱法: 准确性较好,缺点只能读出质量数据,不能读出序列,对于缺失和插入突变无法读出,但这种突变更加可怕,适合于大量样本、多位点(最多能检测25个位点),所以可能会 出现少量假阳性和假阴性。 二代基因检测芯片法: 适合于超多位点,大量样品检测和科研参考,每个样本做几百个位点和做几千个位点 的检测成本,相差无几,最大优点是成本低廉,一个位点的价格只相当于一代测序价格的1%,缺点是出来的大量数据,可信度不高。 我们都知道“是药三分毒”,癌症患者的过度治疗会造成患者的器脏损伤,甚至化疗 整个过程费钱费力却“不讨好”,所以进行在进行治疗之前先进行基因测序检测,会让靶 向药物治疗事倍功半。 肺癌的靶向药基因检测,现在很多公司都可以做,医院基本上也是外送公司做,看你 检测几个几个基因,一般不会超过7200,一般检测就是EGFR,融合基因ALK,ROS1,C-MET,中源协和基因检测。 一般的,基因检测是通过血液、其他体液、或细胞对DNA进行检测的技术。 基因检测可以诊断疾病,也可以用于疾病风险的预测。疾病诊断是用基因检测技术检 测引起遗传性疾病的突变基因。目前应用最广泛的基因检测是新生儿遗传性疾病的检测、 遗传疾病的诊断和某些常见病的辅助诊断。目前有1000多种遗传性疾病可以通过基因检 测技术做出诊断。

基因突变习题

1 、基因突变常发生在细胞周期的 A :分裂间期 B :分裂期前期 C :分裂期后期 D :在分裂期的各个时期都有可能 请选择答案: A:B:C:D: 2 、下列基因突变叙述中正确的是[ ] ①基因突变包括自然突变和诱发突变 ②在DNA复制中,碱基排列顺序发生差异,从而改变了遗传信息,产生基因突变 ③基因突变一般对生物是有害的,但是,也有的基因突变是有利的 ④基因自由组合使生物产生新基因 A :A.①②③④ B :B.①②③ C :C.①②④ D :D.②③④ 请选择答案: A:B:C:D: 3 、在下列几种育种方法中,可以改变原有基因分子结构的育种方法是 A :杂交育种 B :诱变育种 C :单倍体育种 D :多倍体育种 请选择答案: A:B:C:D: 4 、通过人工诱变培育的新类型是 A :无籽番茄 B :矮秆抗锈病小麦 C :无籽西瓜 D :青霉素高产菌株 请选择答案: A:B:C:D: 5 、下列叙述中,不属于诱变育种优点的是 A :可以提高变异的频率 B :育种年限显著缩短 C :大幅度改良某些性状 D :需大量处理供试材料 请选择答案: A:B:C:D:

6 、下列人类疾病中不是由基因突变引起的是 A :白化病 B :血友病 C :侏儒症 D :镰刀型盆血症 请选择答案: A:B:C:D: 7 、下列各项中可能产生新基因的是 A :用离体花药培养玉米植株 B :用秋水仙素得到三倍体西瓜 C :通过杂交培养抗病小麦品种 D :用X射线处理青霉素菌种 请选择答案: A:B:C:D: 8 、若一对夫妇所生育子女中,性状差异甚多,这种变异主要来自 A :基因突变 B :基因重组 C :环境影响 D :染色体变异 请选择答案: A:B:C:D: 9 、杂交育种依据的主要遗传学原理是 A :染色体变异 B :基因连锁互换 C :基因自由组合 D :基因突变 请选择答案: A:B:C:D: 10 、进行无性生殖的生物,可遗传的变异来源是 A :基因重组和基因突变 B :基因重组、基因突变、染色体变异 C :基因突变、染色体变异 D :基因重组、染色体变异 请选择答案: A:B:C:D: 11 、在育种实验中,将纸袋套在花上的目的是 A :保持开花的温度和水分 B :防止花粉成熟后散失 C :防止自花传粉 D :防止外来花粉的干扰 请选择答案: A:B:C:D: 12 、

P53基因突变检测方法

2、试剂和耗材) GIAGEN,德国QIAamp?DNA Blood Mini Kit ()Platiinim?Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, 11304-102 Nuclease-Free Water (Promega,P 1195) d NTP Mix (Promega,P 151B) PCR引物:北京博迈德科技有限公司合成 DL10000 DNA Marker(TAKARA,大连宝生物)DNA分子定量标准:技术Bioer 产物回收纯化试剂盒(BioSpiii Gel Extraction kit,日本PCR有限公司)公司) Axygen, 200-1000 ul 吸头(美国110.5?10 u、2?20 u k 20-200 □、管EP、 仪.器3 ;Taimon1600R凝胶成像系统分析仪(上海天龙公司)Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机(Eppendorf公司,德国)公司,美国)Allegra 6R离心机(Beckman-Coulter应涡旋混合器(北京北德科学仪器厂)MVS-1公司,德国) 1000 u 150 口1、200 ul、(Eppendorf^ 口1 移液器、10 U 1、NEWAIR 公司,美国)1【级生物安全柜NU425-400E (拓速冷冻离心机(BECKMAN COULTER 公司,美国)X-15R 公司德国)仪(Eppendorf Eppendorf Masteicycter PCR 公司,美国)(Bio-Rad电泳仪:Universal 024BR电热恒温水浴器(北京来亨科贸有限责任公司)240全自动凝胶成像系统(中国)凝胶成像分析系统:Tocan 测序仪:GenomeLab CEQ/GeXP (BECKMAN COULTER 公司,美国)20 u k 200 ul和1000 ul加样器(吉尔森公司,法国)旋涡震荡器(Scientific Industries公司,美国) 二、实验方法 1、样品采集,送检和保存 乙二胺四乙酸(EDTA) -3K抗凝管采集HIV和HEV合并感染者外周静脉血,于24h内测定CD4+T淋巴细胞计?数,抗凝血经常规离心分离全血中间层,分装后-80°C冻存用于P53基因变异的测定。 2、血浆样本DNA的提取 取200 P1全血中间层于1.5ml无菌EP管中,加入20 口1蛋白酶K;再加入200 ul AL缓冲液,涡旋振荡15秒,56°C孵育10分钟;瞬时离心EP管,加入200 u 1 无

教你辨析标记基因和报告基因

教你辨析标记基因和报告基因 一、标记基因和报告基因的概念 标记基因(marker gene),是一种已知功能或已知序列的基因,能够起着特异性标记的作用。标记基因是选择标记基因的简称,是指其编码产物能够使转化的细胞、组织具有对抗生素等的抗性,或者使转化细胞、组织具有代谢的优越性。在培养基中加入抗生素等选择试剂的条件下,非转化的细胞死亡或生长受到抑制,而转化的细胞能够继续存活,从而将转化的细胞、组织从大量的细胞或组织中筛选出来的一类基因。在基因工程意义上来说,它是重组DNA载体的重要标记,通常用来检验转化成功与否;在基因定位意义上来说,它是对目的基因进行标志的工具,通常用来检测目的基因在细胞中的定位。 报告基因(reporter gene),是指其编码产物能够被快速地测定,常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官,并检测其表达活性的一类特殊用途的基因,主要用于判断目的基因是否成功导入到受体细胞,并在其中表达。故当报告基因被用来区分转化和非转化细胞、组织、器官时,也可将其称为标记基因。报告基因不仅能作为标记基因,此外,报告基因还能用于研究基因的表达调控,检测启动子的活性,发现新的启动子,观察报告基因和目的基因的融合蛋白在细胞内的位置等。 二、标记基因和报告基因的区别与联系 二者的联系在于:报告基因都可以看做是标记基因。报告基因也有标记的作用,标记目的基因是否成功 转化的作用,但是它们又有着各自的特点。 标记基因通常用来检验重组DNA载体转化成功与否,或者检测目的基因在植物细胞或组织中的定位。常用的标记基因是一些抗生素抗性基因,如卡那霉素抗性基因、潮霉素标记基因等。 而作为报告基因,在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件:1)已被克隆和全序列已测定;2)表达产物在受体细胞中不存在,即无背景,在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物;3)表达产物唯一,对受体细胞无毒,并且能进行定量测定。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一,检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前,利用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变,只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是突变研究中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的发展,目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出的新方法不断出现,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism,SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis,HA)。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象,一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%,片段大于400bp时,检出率仅为50%左右,该法可能会存在1%的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的准确位点,还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法,仅检测第5-8外显子即可发现85%以上的p53基因突变。由于该法简便快速,特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法(HA) HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似,所不同的是SSCP分离的是单链DNA,HA法分离的是双链DNA,也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用,两者结合使用,可使突变检出率提高到近100%。 突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR)本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras基因第12密码子的BstNI位点,第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增,而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE) DGGE法分析PCR 产物,如果突变发生在最先解链的DNA区域,检出率可达100%,检测片段可达1kb,最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时,DNA发生部分解链,电泳适移率下降,当解链的DNA链中有一个碱基改变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程

抑郁模型大鼠海马内环境的研究

抑郁模型大鼠海马内环境的研究 发表时间:2011-07-13T16:28:59.267Z 来源:《中外健康文摘》2011年第16期供稿作者:郑晓霓1 单德红2 [导读] 海马神经元所处的细胞外液属于机体内环境,其成分和理化特性相对稳定是神经元发挥功能的前提。 郑晓霓1 单德红2 (1辽宁省沈阳市沈和区第二中医院110015;2辽宁省沈阳市中医药大学基础医学院110032)【中图分类号】R74【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2011)16-0144-02 【摘要】目的研究海马内环境稳态在抑郁症中的作用。方法20只雌性Wistar大鼠分为对照组、模型组。ELISA法检测血清皮质醇、雌二醇,光镜和电镜观察海马CA3区形态学变化,免疫组化法检测海马脑源性神经生长因子和血管内皮生长因子表达。结果与对照组比较,模型组皮质醇水平显著升高,雌二醇水平明显下降,海马CA3区神经元损伤严重,脑源性神经生长因子和血管内皮生长因子表达明显降低。结论抑郁状态下,海马内环境稳态被破坏。【关键词】抑郁症海马内环境稳态脑源性神经生长因子血管内皮生长因子【Abstract】 Objective: To study the action of hippocampal internal enviroment in deprssion. Methods: 20 femal wistar rats were divided into the control, model group. Serum cortisol and estradiol were measured with ELISA. Hippocampal CA3 morphology were observed by light and electron miroscope. BDNF and VEGF expressions were detected by immunohistochemistry. Results: compared with those in the control, in the model group, the serum cortisol level increased obviously, serum estradiol level decreased significantly, and the CA3 neurons had severious structure damage, and the expressions of BDNF and VEGF decreased markedly. Conclusion: The homeostasis of hippocampal internal enviroment is disrupted in depression. 【Key words】 depression hippocampal internal enviroment homeostasis brain-derived neurotrophtic factor vascular endothelial growth factor 海马内环境指海马神经元的细胞外液,其理化性质和各种成分应保持相对稳定的状态,即稳态。海马内环境的理化特性包括温度、渗透压、酸碱度等,成分有各种离子、激素、递质、细胞因子等。海马内环境稳太破坏均会损伤海马功能和结构,进而影响行为、情绪和内脏功能。现代医学认为海马损伤在抑郁症发病中起重要作用[1-2],但抑郁状态下,海马内环境出现何种变化目前尚没有系统研究,这就是本课题的研究目标,而本文主要对海马内环境中相关成分进行初步观察。 1 材料和方法 1.1实验动物的选取和分组健康Wistar雌性大鼠,清洁级,体重226±20g,中国医科大学动物实验中心提供,合格证号:医大动物合格证SCXK(辽)2008-0005。适应性饲养1周后,选择行为学得分相近的20只大鼠,随机分为对照组、抑郁症模型组(模型组),每组10只。室温20℃~25℃,湿度40%~50%。 1.2抑郁症模型的建立模型组大鼠建立慢性不可预见性应激模型,即在21d内随机施加电击足底(36V交流电,5min)、冰水游泳(4℃,5min)、摇晃(1min)、夹尾(1min)、禁水(24h)、禁食(24h)等刺激,每种刺激4次。 1.3血清雌二醇和皮质醇检测在实验的d22,2组大鼠均腹腔注射20%氨基甲酸乙酯(0.4mL/100g)麻醉后,腹主动脉取血,离心后取血清,低温冻存。采用ELISA方法检测皮质醇和雌二醇(Estradiol,E2),此项工作由沈阳军区总医院内分泌实验室完成。 1.4海马组织学观察首先是HE染色:取完成1.3后2只大鼠,立即断头取双侧海马,置于10%甲醛中固定,石蜡切片,HE染色,观察海马CA3区神经元的形态学变化。其次电镜观察:取完成1.3后的2只大鼠,升主动脉插管,150ml生理盐水快速冲去血液,快速灌入4℃ 2.5%戊二醛固定液,取双侧海马,修块,再于戊二醛中固定2h,PBS反复清洗后,再经1%锇酸固定2h,双蒸水冲洗,梯度乙醇脱水,临界点干燥,离子溅射真空渡膜,扫描电镜下观察超微结构。 1.5脑源性神经生长因子和血管内皮生长因子表达取完成1.3的6只大鼠开胸,升主动脉插管,生理盐水快速冲去血液,取双侧海马,4%多聚甲醛固定4~6h,30%蔗糖溶液沉底。做海马石蜡冠状切片,片厚25μm,隔4片取1片,采用免疫组化SABC法检测脑源性神经生长因子(Brain-derived neurotrophtic factor,BDNF)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor ,VEGF)表达,相关抗体和试剂盒均购于武汉博±德试剂公司,阴性对照选用PBS。利用BI-2000医学图像分析系统,测定海马CA3区BDNF和VEGF表达的平均灰度值。 1.6数据处理数据以x-±s表示,采用SPSS13.0中ANOVA检验进行统计学处理。 2 实验结果 实验过程中没有实验动物死亡及脱失现象。 2.1海马形态学变化 光镜下,对照组CA3区有大量致密锥体细胞,排列整齐,细胞完整,边缘清晰;模型组细胞层次减少、稀疏、排列紊乱,大量细胞坏死。电镜下,对照组细胞器丰富,轮廓清晰,细胞核呈圆形,核膜清晰光滑完整,核染色质分布均匀;模型组细胞器减少,线粒体空泡化,细胞核变小,不规则,且核膜增厚,核周电子密度降低。 2.2海马内环境相关成分变化 与对照组比较,模型组皮质醇显著升高,E2明显下降。BDNF和VEGF免疫阳性反应产物呈棕黄色,前者分布神经元胞浆内,后者主要分布于血管内皮细胞内。对照组BDNF和VEGF表达较多,模型组较少,二者灰度值均升高。具体数据见表1。表1 各组海马内环境相关成分的变化 注:与对照组比较:a P<0.05, b P<0.01

肿瘤基因突变检测

肿瘤基因突变检测 癌症是一类难以预防的疾病,中晚期癌症治愈的可能性又很小,而早期癌症的治愈率可达65%以上,有些肿瘤可达90%以上,因此,战胜癌症的关键是早期发现癌症。由于癌症早期常无特殊症状,甚至毫无症状,故癌症的早期发现、早期诊断主要是通过定期健康体检和人群筛查完成。目前筛查癌症的方法主要是通过化验血肿瘤指标及B超、CT、MRI、PET-CT 等检查,但这些方法的敏感性和特异性均不高,发现有异常时往往已是中晚期。 17种常见高发肿瘤,包括乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colorectalcancer)、子宫癌(endometrial cancer)、脑胶质瘤(glioma)、白血病(leukemia)、肺癌(lungcancer)、淋巴癌(lymphoma)、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、黑色素癌(melanoma)、间皮瘤(mesothelioma) 、多性骨髓瘤(multiple myeloma) 、卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer) 、真性红细胞增多(polycythemia vera) 、前列腺癌(prostatecancer) 、肾细胞癌(renal cell cancer)和恶性内瘤(sarcoma),其发病机制涉及与多种肿瘤发生共同相关的肿瘤易感基因群介导的分子改变,参与了肿瘤发生的早期分子事件。系统寻找和探讨它们在肿瘤发生发展过程中的遗传学变异,对阐明肿瘤早期发生机制及寻找肿瘤早期预警、早期诊断和早期治疗的分子靶标都具有重要的现实意义。利用高通量分子测序技术平台,可同时开展多个肿瘤基因突变检测项目,如EGFR、K-RAS 、N-RAS、B-RAF、PI3K 、p53、p16、BRCA1、

基因工程选择题

1.因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( ) (a)A.Kornberg (b)W.Gilbert (c)P.Berg (d)B.McClintock 2.第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8 3.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有( )不太恰当。 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 4.Ⅱ型限制性内切核酸酶:( ) (a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 (b)仅有内切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供 (c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性 (e)仅有外切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供 5.下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( ) (a)限制酶是外切酶而不是内切酶 (b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割 (c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的 (d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA,产生黏末端 (e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端 6.第一个被分离的Ⅱ类酶是:( ) (a)EcoK (b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB 7.在下列进行DNA部分酶切的条件中,控制那一项最

好?( ) (a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度 8.在下列试剂中,那一种可以螯合Ca2+离子?( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA 9.在下列工具酶中,那一种可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31核酸酶 10.限制性内切核酸酶可以特异性地识别:( ) (a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA的特定碱基序列 (c)特定的三联密码(d)以上都正确 11.下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中,正确一项的是( )。 (a)Sau3A I (b)E.coRI (c)hind III (d)Sau 3A1 12.限制性内切核酸酶的星号活性是指:( ) (a)在非常规条件下,识别和切割序列发生变化的活性。 (b)活性大大提高 (c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同 13.下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( ) (a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂 (c)含有非Mg2+的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低 14.关于宿主控制的限制修饰现象的本质,下列描述中只有( )不太恰当 (a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成 (b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶 (c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰 (d)不同的宿主系统具有不同的限制-修饰系统 15.在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )

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