夏布酶法后整理条件的优化

第２８卷第３期２００７年３月

纺织学报

Ｊｏ啪ａｌｏｆ７ｒｅｘｔｉｌｅＲｅｓｅａｒｃｈ

Ｖ０１．２８Ｎｏ．３

Ｍａｒ．２００７

文章编号：０２５３．９７２１（２００７）０３．００“一０４

夏布酶法后整理条件的优化

彭源德１，唐守伟１，杨喜爱１，严理１，沈建新２，付五兵２，熊和平１（１．中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙４１０００６；２．湖南尤特尔生化有限公司，湖南岳阳４１４００９）

摘要为了确定夏布酶法后整理的工艺流程和技术参数，在利用高效木聚糖酶和纤维素酶等复合酶进行夏布后整理的基础上，研究酶的用量、浴比、温度、起始ｐＨ值和处理时间等因子对夏布酶法后整理的影响。结果表明夏布酶法后整理的适宜条件为：木聚糖酶用量（对夏布）Ｏ．５％，纤维素酶用量（对夏布）Ｏ．５％～２％，浴比１：１５，温度５０℃，起始ｐＨ值４．５。５．ｏ，时间１ｈ；夏布酶法后整理中，纤维素酶浓度对整理效果的影响最大，起始ｐＨ值次之，浴比的影响最小。

关键词夏布；后整理；木聚糖酶；纤维素酶

中图分类号：偈１９５．５文献标识码：Ａ

ｏｐｔｉＩＩｌｉｚ觚ｏｎｏｆｅ眦ｙｍａｔｉｃ６Ｉｌｉｓｌｌｉｎｇｃｏ础ｔｉｏ璐ｏｆｈ舳ｄ－ｍａｄｅｒ锄ｉｅｃｌｏｔｈ

ＰＥＮＧＹｕａｎｄｅｌ，ＴＡＮＧｓｈｏｕｗｅｉｌ，ＹＡＮＧｘｉ７ａｉｌ，ＹＡＮＬｉｌ，ｓＨＥＮＪｉａＩｌ】（ｉｎ２，Ｆｕｗｕｂｉｎ９２，ｘＩｏＮＧＨｅｐｉｎ９１（１．ｍ硪ｔ姚矿曰∞￡硒ｅｒＣｎＤｐｓ，劬ｉｎ黜Ａ∞如ｒ可０，Ａｇ庇沈啪Ｚ５ｃ据，黜ｓ，ｃ胁，拶地，五ｋＭｎ４１０００６，劬ｉＭ；

２．月ｈＭｎ＾锄ｃｅｎｔ“可口幻ｃｋｍ溉Ｚ（ⅣＣ鳓一ｃｏ．，删．，地ｅ，竹愕，月ｈＭｎ４１４００９，吼ｉ船）

ＡｂｓｔｒａｃｔＦｏｒｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｐｍｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃｆｉｎｉｓｈｉｎｇｏｆｔｈｅｈａｎｄ—ｍａｄｅｍｍｉｅｃｌｏｔｈ，ｈｉｇｈｅｍｃｉｅｎｃｙｍｉｘｔｕｒｅｏｆｘｙｌａｎａｓｅａＩｌｄｃｅｌｌｕｌａｓｅｗａｓｅｍｐｌｏｙｅｄｉｎｔｈｅｅｎｚ）ｒｍｅｆｉｎｉｓｈｉｎｇｏｆｔｈｅ

ｃｌｏｔｈ．卟ｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｎｚｙｒｒｌｅｄｏｓａ窘ｅ，ｂａｔｈ瑚土ｉｏ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨＶａｌｕｅａｎｄｄｕｒａ上ｉｏｎｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｎｔｈｅｆｉｎｉｓｈｉｎｇｒｅｓｕｌｔｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｉｔｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｅｎｚｙｍ砒ｉｃｆｉｎｉｓｈｉｎｇｏｆｔｈｅｈａｎｄ．ｍａｄｅｒａｍｉｅｃｌｏｔｈａｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：０．５％ｘｙｌａＩｌａｓｅ，０．５％～２％ｃｅｌｌｕｌａｓｅ，ｂａｔｈｒａｔｉｏ，１：１５，ｐＨｖａｌｕｅａｔｔｈｅ瑚ｇｅｏｆ４．５～５．０，ａｎｄ恤ａｔｉｎｇａｔ５０℃ｆｏｒｌｈｏｕｒ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｉｎｎｕｅｎｃｉｎｇｔｈｅｆｉｎｉｓ｝ｌｉｎｇ，ｃｅＵｕｌａｓｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｓｉｎｔｈｅｆｉｒｓｔｐｌａｃｅ，ａＩｌｄｆ０１１０ｗｅｄｂｙｏｒｉ百ｎａｌｐＨｖａｌｕｅ，ｔｈｅｌａｓｔｉｓｂａｔｈｒａｔｉｏ．

ＫｅｙｗＯｒｄｓｒａＩＩｌｉｅｃｌｏｔｈ；ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ；ｘｙｌａｎａｓｅ；ｃｅｌｌｕｌａｓｅ

夏布是用苎麻手工纺织而成的平纹布，是制作衣料、刺绣、饰品、蚊帐的上等材料。目前使用浸濯漂洗方法（主要包括清水漂白、日光漂洗、露漂、石灰水漂、炭熏、牛粪浸渍等）生产的夏布是未经脱胶的原麻制品，布上有胶质、红根、斑疵等杂物，为此，国内广泛开展了苎麻织物的酶法处理技术研究¨。１２｜，并取得了一定的进展。

本文在用高效木聚糖酶和纤维素酶等复合酶进行夏布后整理的基础上，通过研究夏布酶法后整理的影响因子，确定夏布酶法后整理的最佳工艺流程和参数，为加速研究夏布酶法后整理技术提供科学依据，以解决我国夏布存在的半纤维素、果胶、木质素、淀粉等含量高，品种颜色单一，刚性强，毛羽多，刺痒感强，不柔软，色泽不光洁，不利于产品的增值和深度开发等关键问题。

１试验部分

１．１材料

夏布（产自四川隆昌县）；ＣＭｃ（ｓｉｇｍａｃ一５６７８）、木聚糖、聚半乳糖醛酸、无水葡萄糖、柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲溶液、氢氧化钠溶液、盐酸、硫酸、３，５一二硝

收稿日期：２００６一０６—２０修回日期：２００６一１０—２９

基金项目：国家９４８项目（２００３．ｚ５２）

作者简介：彭源德（１９６５一），男，副研究员，学士。主要从事农产品生物加工的研究。熊和平，通讯作者，Ｅ．ｍａｊｌ：一ｉｅｘｈｐ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｃｓ．ｈｎ．ｃｎ。

万方数据

酶切注意事项

酶切 DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。 DNA酶切及凝胶电泳 一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC ↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'

DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。 构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。 在酶切图谱制作过程中，为了获得条带清晰的电泳图谱，一

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化 摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ｒｅｍｉ）技术介导的红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素b 作为抗性筛选标记，ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ、ｐｃｂ１００３、ｐａｎ７－１作为转化质粒，采用ｒｅｍｉ技术转化红曲霉。结果表明，用ｒｅｍｉ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ和ｐｃｂ１００３适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ｒｅｍｉ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍｌ时，每微克质粒可获得的潮霉素ｂ抗性转化子为２８００～３２００个；ｈｉｎｄⅲ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ｕ；在质粒用量为８μｇ／１００μｌ时转化率最高。 关键词：红曲霉（ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（remi） ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｍｏ ｎａｓｃｕｓ anka ｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍ ｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ｒｅｍｉ），ｕｓｉｎｇｔｈｅｈｐｈｇｅｎｅａｓｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒａｎｄｐｂｃ－ｈｙｇｒｏ，ｐｃｂ１００３ａｎｄｐａｎ７－１ａｓｖｅｃｔｏｒ，ｔｈｅｆｕｎｇｕｓ

ｍ．ａｎｋａｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏｂｅｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｙｒｅｍｉ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓｔｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｓｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｗｈｅｎｕｓｉｎｇｐｂｃ－ｈｙｇｒｏａｎｄｐｃｂ１００３ａｓｖｅｃｔｏｒｓ．ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒａｔｅｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｎｏｍａｔｔｅｒｉｆｖｅｃｔｏｒｓｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｏｒｎｏｔ．ａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒｒｅｓｕｌｔｅｄｉｎｒｅｄｕｃｉｎｇｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１×１０７～１×１０８ｍｌｗｅｒｅｆｉｔｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｍ．ａｎｋａ，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｗａｓ２８００～３２００ｉｎｄ．／μｇｖｅｃｔｏｒｄｎａ．ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｈｉｎｄｉｉｉａｎｄｖｅｃｔｏｒｄｏｓｅｗａｓ１０5～１２０ｕａｎｄ８μｇ／１００μｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

产酶条件优化方案

滤纸条降解试验 吸取纤维素降解菌种子液1ml接种到装有50ml赫奇逊培养液的250ml三角瓶中，瓶中放置1c m×6cm的新华Ⅰ号滤纸条，同时设置不加菌液的滤纸条作为对照，每个处理3个重复。置于30℃恒温摇床，200r/min振荡培养5d，观察各瓶中滤纸条溃烂情况。 赫奇逊培养液：KH2PO4 1.0g MgSO4·7H2O 0.3g CaCl2 0.1g NaCl 0.1g FeCl3 0.01g NaNO3 2.5g pH7.2～7.3 蒸馏水1000ml 纤维素酶活的测定 1CMC酶活测定 取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟，上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL，加入柠檬酸缓冲液1ml，再加入0.8%的羧甲基纤维素钠溶液 1.5mL，震荡摇匀，将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min，保温完成后取出试管，加入2mL DNS显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热5min，使DNS显色剂与还原糖充分反应，5min后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm处的OD值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。 2FPA酶活测定 取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟，上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL，加入柠檬酸缓冲液1ml，再加入滤纸(1cm ×6cm) 一条，震荡摇匀，将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min，保温完成后取出试管，加入2mL DNS显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热5min，使DNS显色剂与还原糖充分反应，5min后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm处的OD值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。 3Avicel cellulase (Avicelase) 500 uL of enzyme mixed with 1mL of Avicel (1%, w/v) for determining the Avicelase activity. 详细见给你的那篇文献 通过以上两种方法，测得复筛得到的酶活高的菌株每8 h的粗酶酶活产酶曲线，测到72h。确定酶活达到最大的最适时间。 产酶条件优化

脂肪酶产生菌发酵条件的优化

绵阳师范学院 本科生毕业论文（设计） 题目脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化专业生物技术 院部生命科学与技术学院 学号0811420218 姓名杜长蔓 指导教师李俊刚 答辩时间2012年5月 论文工作时间：2011 年7 月至2012 年5 月

脂肪酶产生菌M-6-2发酵条件的优化 学生：杜长蔓 指导老师：李俊刚 摘要：本文对绵阳师范学院微生物实验室筛选和鉴定的产脂肪酶细菌 M-6-2的生长动力学和产酶动力学进行了研究；通过单因素实验和正交试验，对脂肪酶产生菌M-6-2 摇床发酵产脂肪酶的培养基组成和培养条件进行优化，得出较佳的产酶培养基组成配方为：1.5%淀粉+0.5%酵母膏为碳源、4.5%豆饼粉 +1.5%硝酸铵为最佳的氮源、0.05%磷酸氢二钠和0.15%硫酸镁；最优的发酵条件为：初始pH7.5，接种量1.5 %，装液量20ml/250ml，发酵温度35℃，在转速180r/min 下，培养16h，经过优化后发酵液脂肪酶酶活力最高可达到15.60 U/ml,较优化前提高了49.57%。脂肪酶产生菌M-6-2与国内文献报道的产脂肪酶细菌相比产酶活力高。对该菌株发酵条件进行优化后，为生产性试验打下了基础。 关键词：脂肪酶产生菌M-6-2；脂肪酶；发酵条件；优化；正交试验；

Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditions Undergraduate: Du Changman Supervisor: Li Jun Gang Abstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kinetics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 ° C, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzyme production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test. Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions； optimization ；orthogonal test

产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

陇东大学 学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 生命科学与技术学院 08生物技术班 作者： 指导教师： 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化 何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍

(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000) 摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化 Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the enzyme production conditions （College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China） Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Y east extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃. Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization 0引言 蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

双酶切连接反应常见问题分析

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程

限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007） 1、目的及适用范围 利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。 2、主要试剂及仪器 微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer 3、操作步骤 按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。 反应物体积（μL） 灭菌水3 DNA40 10× Buffer K 5 EcoR I1 BamH I1 总体积50 4、问题向导 4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。 4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。 21

酶切反应条件的优化

当建立内切酶酶切反应体系时有几个关键因素需要考虑。比如如何在正确的反应体系中，加入适量的DNA、内切酶和缓冲液，就可以获得最佳酶切效果。根据定义，在50μl体系中，1单位的限制性内切酶可以在60分钟内完全切割1μg的底物DNA。上述酶、DNA与总反应体积的比值可以做为建立反应体系的参考数据。但是，目前大多数科研人员会遵循下表中所列的标准反应条件，使用5－10倍的过量酶切割DNA，这样有利于克服由于DNA来源不同、质量和纯度不同而造成的实验失败。 “标准”反应体系 内切酶 ?从冰箱取出后请一直置于冰上。 ?酶最后加入到反应体系中。 ?加入酶之前将反应混合物混匀，可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，然后在离心机中快速离心。切忌振荡混匀！ ?当切割超螺旋质粒和琼脂糖包埋DNA时，通常需要超过1unit/μg的酶量以达到完全酶切。DNA ?避免酚、氯仿、酒精、EDTA、变性剂或过多盐离子的污染。 ?甲基化的DNA会抑制某些酶的切割效率。 缓冲液 ?使用终浓度为1X的缓冲液。 ?根据实验需要加入终浓度为100μg/ml的BSA（1:100稀释）。 ?在不需要BSA即可达到最佳活性的酶切反应中如果加入BSA也不会影响酶切效果。 反应总体积 ?建议在50μl反应体系中消化1μg底物DNA。 ?为避免星号活性，甘油浓度应<5%。 ?加入内切酶（贮存于50%甘油中）的量应不超过总体积的10%。 ?使用以下技术，内切酶的反应条件可能未达到最佳反应条件：克隆、基因分型、突变检测、基因定位、探针制备、测序和甲基化检测等。 ?内切酶贮存液中的添加物（如：甘油和盐）和底物溶液中尚存的残余物（如：盐、EDTA 或乙醇）会导致小体积反应体系出现问题。NEB提供了一系列高保真内切酶（方便建立反应体系。下述为小体积反应体系反应指南。 酶切反应体系的选择

限制性内切酶的一般原则和建议!

限制性内切酶的一般原则和建议! 1．如何做酶切反应？ 该问题看似什么简单： DNA中加上酶，然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中，我们不断听到：切不动，装不上。问题在什么地方？能系列生产限制性内切酶的公司国际上，就那么几个，位列前 3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题，但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂（会使酶变性或产生星号货性），不能含有干扰酶活性的污染物质，不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低，对Mg的浓度影响较小)；同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用，特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意：酶通常是最后加。所有4) 反应体积需要根据实验目的定，常规的酶切一般要维持在10-50ul，酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题：浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量，模板用量，反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后，需要用TIP小心混匀几次，short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度，但是 Sma I 的最适合温度是25度，37度时酶仍表现出活性，但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应，如Taq I的最适温度为65度，37度保温，效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应，或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%，也就是说10ul的体系，酶的用量不要超过1ul。 10) 是否和如何终止反应？酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段：加入高浓度的EDTA；65度或80度热处理20-30分钟；部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高，热处理灭活不一定完全，需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化；电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2．如果遇到酶切不动或切不完全，该怎么办？ 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定，我们多次接到这样的问题：1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全？从下面几个因素去考虑： 1) 酶是否有活性：酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板，也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的，虽然识别位点相同，但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式，通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感，还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降，这种情况是很少发生。我们公

【开题报告】酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化

开题报告 食品质量与安全 酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化 一、选题的背景与意义 胶原蛋白，主要存在于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白。由于胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而其被广泛的应用于化工、食品、医学、生物材料以及农业等诸多领域。因此，胶原蛋白的提取一直是研究的热点。 目前国际上已开发出许多胶原保健品和功能性胶原生物材料。相对于我国，其在胶原蛋白的基础研究上已经具有一些优势并拥有一定的国际专利，而且部分已经投入市场，形成一定的市场规模。而我国的高质量胶原蛋白基础研究还有差距，有关这方面的核心专利技术不多。 但就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有丰富胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头）利用的附加值很低。这样既浪费资源又污染环境，利用这些废弃物生成胶原蛋白实现资源的合理和有价值的利用，实现经济和社会效益的双赢。 本实验的以牛肉制品的下脚料——牛皮为原料，利用酶解法提取胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 基本内容： 1、对牛皮成分的测定：主要测其水分、脂肪、粗蛋白、胶原蛋白等。 2、酶制剂的选择和复合：选择两种胶原蛋白提取率比较高的酶，然后按一定比例进行复合试 验。 3、研究不同实验条件对胶原蛋白提取率的影响：通过对加酶量、水解pH、水解温度、水解 时间、固液比等因素进行单因素试验，并在此基础上进行正交试验得出优化的工艺条件。拟解决的问题： 1、如何选择合适的比例对两种单酶进行复合。 2、如何提高胶原蛋白的提取率。 三、研究的方法与技术路线： 研究的方法： 1、牛皮成分测定：水分测定采用直接干燥法；脂肪测定采用索式提取法；蛋白质测定采用凯 式定氮法；胶原蛋白的含量测定采用羟脯氨酸法

产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

大庆师范学院 本科生毕业论文 蛋白酶产生菌培养条件的条件优化 院(部)、专业生命科学学院生物技术 研究方向微生物学 学生姓名朱琳 学号200901122598 指导教师姓名张亦婷 2013年06月01日

摘要 采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。 关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化

Abstract The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃. Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization

双酶切连接反应

【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为个小时足已。3，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间350 U/μl 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度. 2 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干 3对照的设立： 为验证双酶切是否成功,可做如下对照: A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设4个: A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功, 当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下. B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒 C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误. 阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况. 4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。

酶切反应注意事项

1、DNA纯度 一般而言，纯度高的DNA（即混入的蛋白质、RNA或多糖类物质较少）容易被限制性内切酶消化，基因重组是严重洪的所有酶促反应都有类似共性，因此应尽量提高DNA纯度。若DNA不能被限制性内切核酸酶切割，应对DNA样品进行酚抽提、乙醇沉淀等操作，以提高DNA纯度。下列因素影响DNA纯度： (1)DNA样品中常常杂有RNA，虽然它的存在不影响酶的反应速度，但RNA可和酶蛋白 发生非特异性结合而减少酶的有效浓度，使酶解不彻底。另外，RNA在凝胶电泳中 呈现的区带会掩盖该区带范围内的DNA片段的呈现，干扰DNA片段的观察。 (2)一般来说，少量蛋白质的污染对DNA酶解的影响不大，但如果杂有核酸酶等蛋白质， 就会干扰酶切反应，并影响酶解产物。有一类蛋白质叫结合蛋白，他能与DNA发生 非特异结合，不仅封闭DNA上的识别序列而影响酶切反应，而且DNA与蛋白质结 合物在凝胶电泳上迁移甚慢，从而改变DNA片段在电泳图谱中的位置，影响DNA 片段的定性分析。 (3)样品中杂有其他DNA，如制备的质粒DNA中含有染色体DNA片段等，它们不影响 酶解作用，但干扰酶解产物电泳图谱并影响以后的重组连接反应。 (4)DNA样品中的其他杂志，如Hg2+、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等，这些杂 质常常是制备过程中不慎带进的，它们影响酶切速度，甚至改变识别特异性，出现 酶的第二活性。 2、DNA甲基化 限制性内切核酸酶的识别序列若被修饰酶产生了修饰反应（如甲基化酶的甲基化反应），则该DNA不能被限制酶再切割。甲基化酶是大多数大肠杆菌菌株中都存在 的酶系之一，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶两大类。Dam甲基化酶在5’GATC3’ 的A上甲基化，dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’的C上甲基化。若出现甲基 化影响，则应使用甲基化酶缺陷菌株（dcm或dam），或使用不受甲基化酶影响的限 制性内切核酸酶，如MboI和Sau3A是同裂酶，因MboI受甲基化影响程度大，则宜 使用几乎不受甲基化酶影响的Sau3A。 3、星号活力 又称第二活力，是指该改变了酶切反应条件后特异序列识别特性降低的一种现象。 由于识别特异性降低，可能对原识别序列相似的序列也产生切割反应。如EcoRI的典型识别序列为GAATTC，条件改变后，其识别序列由原来的六核苷酸降为四核苷酸AATT。 高浓度甘油、高PH、低离子强度、β-巯基乙醇、DMSO、Mn2+等的存在可能导致酶产生星号活力。厂家提供的酶一般存放在50%甘油溶液中，若酶量站反应体系的1/10以上，将可能导致星号活力。小的反应体系若长时间在恒温水浴锅中进行酶切反应，因Eppendorf管里的内外温差将导致水分蒸发，蒸气凝结在盖子上而使反应体积缩小非常明显，将改变反应体系的组成，而容易产生星号活力，因此长时间进行酶切反应，宜使用空气恒温箱为保温设备，可避免水分蒸发和凝结。 4、终止限制性内切核酸酶反应的方法 (1)加EDT A以Mg2+,使酶失去辅助因子而终止酶切反应； (2)65℃下保温5-10min而使酶失活。但是有些酶在此温度下仍有活性，这种酶就不能 用高温失活方法来终止酶切反应； (3)加SDS至终浓度0.1%或加尿素至0.5mol/L，使酶蛋白解聚变形； (4)用等体积酚抽提酶解产物，这种方法使酶活性丧志最彻底，灭火后的样品用乙醇沉 淀法回收DNA；

酶催化反应研究进展

1 绪论 酶作为生物催化剂，具有专一性、高效性、反应条件温和等优点，是一种具有特殊三维空间构象的蛋白质，它们在体内几乎参与了所有的转变过程, 催化生物分子的转化。同时, 它们也催化许多体内存在的物质发生变化, 使人体正常的新陈代谢得以运行。因此受到人们的普遍关注。近年来, 特别是随着生化技术的进展, 酶催化反应越来越多地被有机化学家作为一种手段应用于有机合成, 特别是催化不对称合成反应。光学活性化合物或天然产物的合成, 已应用于医药、农药、食品添加剂、香料、日用化学品等精细有机合成领域。酶催化不会污染环境, 经济可行, 符合绿色化学的方向, 具有广阔的前景。 2 酶催化与有机合成反应 对于酶催化反应在有机合成中的应用, 有机合成工作者做了大量工作。随着科技进步的日新月异, 酶催化反应越来越多地被有机化学家作为一种手段用于 有机合成特别是不对称合成反应, 进行光学活性化合物或天然产物的合成时, 能为天然或非天然产物的合成提供丰富的手性源, 其应用前景将是难以估量的。2.1 不同反应体系中的酶促反应 2.1.1 有机介质中的酶促反应 酶在有机介质中不但能保持其活性，还表现出一些特殊性质，并具有如下优越性：有利于疏水性底物的反应；产物和酶易于回收；可改变反应平衡移动的方向；可控制底物专一性；可防止由水引起的副反应；可扩大反应pH值的适应性；可提高酶稳定性；可避免微生物污染等。在保证必需含水量；选择合适的酶及酶形式；选择合适的溶剂；选择最佳pH值；选择合适的反应体系的条件下，则在有机介质中酶可显示很高的催化活性。目前在有机介质中已成功用酶进行了氧化、、脱氢、脱氨、还原、羟基化、甲基化、环氧化、酯化、酰胺化、磷酸化、开环反应、异构化、侧链切除、缩合及卤化等反应。 过去人们认为酶在有机介质不稳定，但研究发现大多数酶在低水有机介质中比在水介质中更稳定。一是表现在热稳定性提高。在有机介质中，在不同温度下保温脉酶，发现热处理导致酶活性增加，而且酶在温度远超过其在水溶液中最适

酶切

DNA的酶切实验 采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。酶切可以是单酶切也可以是双酶切。单酶切操作比较简单，但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同（主要是盐离子浓度不同）或反应温度不同，这时可以采用如下措施解决：1）先用一种酶切，然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切；2）先进行低盐要求的酶酶切，然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切；3）使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行，尽量避免星号活力。一材料、试剂和仪器： 1 材料：质粒DNA 2 试剂：限制性内切酶、ddH2O 3 仪器：微量移液枪，离心机，水浴锅，电泳仪，紫外透射观测仪 实验程序： I. .单酶切： II. 双酶切： 注：酶切的选择原则一般是尽量扩大酶切体系，这样抑制因素得以稀释；基因组DNA或质粒DNA酶的用量较一般DNA大，一般为1μg/10U;所加酶的体积不能超过酶切总体积的1/10，否则甘油浓度会超过5%，会产生星号活力；对难切的质粒或基因组DNA应延长反应时间4—5hr, 甚至过夜。灭火限制性内切酶活性可以采用加热灭活，乙醇沉淀，酚/氯仿抽提，添加EDTA或SDS等方法，具体每一种酶可能有些方法不能完全灭活，这一点需要注意。 二. 结果与分析： 假若一种酶在环状质粒DNA中只有一个酶切位点, 且酶切彻底，紫外灯下检测电泳结果, 则单酶切应为一条带, 而双酶切则为两条带。如果条带数目多于理论值,那么有可能是酶切不完全。如果酶切结果与酶切前的质粒条带一样（超螺旋、线性和开环三条带），则说明质粒完全没有被切开。 图4 重组质粒HindIII XbaI双酶切琼脂糖凝胶电泳分析

酶切体系中不可忽视的13个实验要素

摘要: 本文展示了建立一个标准的酶切体系需要注意的13个要素，例如怎么去选择正确的酶，DNA甲基化问题，缓冲液，反应体积，反应时间和温度，终止反应，对照反应，稳定性，贮存条件等等。一、建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。通常，一个50l的反应体系中，1l 的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应。 一、建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间;如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间(不超过16小时)也可完全反应。 二、选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44(256)个碱基中切割一次;而一个识别6个碱基的酶将平均在每46(4096)碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的(3''或5''突出端)，也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive ends And Recleavable Blunt Ends一文。 三、酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中(在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合)。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之"切割质粒dna"和"包埋法切割DNA"。 四、DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。 五、缓冲液 对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。 六、反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶