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细菌计数

细菌计数试验方案

1 菌种

葡萄球菌菌株(分离奶牛乳房炎奶样),由本实验室筛选保藏.

2 培养基

平板培养基:普通营养琼脂.

液体培养基:普通肉汤.

3 仪器和器具

分光光度计;摇床;试管;移液器;青霉素瓶.

4 方法

4.1 接种:

将菌接种于平板培养基上,37℃培养24 h后,在试管中加入10ml液体培养基选取平板培养单个菌落2-3个进行接种,接种后37℃、震摇培养.

4.2 离心:

将液体培养的细菌部分无菌分装离心管,3000rpm离心10分钟,弃上清,沉淀用生理盐水/PBS重悬,适当调整浓度,进行OD值测定;另外一部分液体培养细菌进行活菌计数用。4.3 菌体最适吸收波长测定:

以生理盐水/PBS做对照调零,取适当稀释浓度菌液,对其进行Uv波长(300-900nm)扫描测定OD值(表1),据此确定其最大光吸收波长并用于以后各步OD值的测定.

表1 细菌不同波长扫描的光吸收值

波长/nm 300 350 400 450 460 470 480 490 500 550 600 OD值

4.4 菌体生长曲线测定:

取盛有10mL普通肉汤的试管13个,分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、22、24h。用移液器分别准确吸取20μL菌液加入已编号的13个试管中,于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出,立即按上述步骤离心,进行OD值测定,同时进行作平板计数。(表2)

4.4.1 平板计数:

将每一时间菌液再梯度稀释(根据菌种而定,一般至lO-4、lO-5、lO-6、lO-7),分别吸取0.5

mL涂平板(三个平行),取平均数进行活菌的准确计数。

4.4.2 OD值测定:

将生理盐水/PBS倾倒入比色杯中,选用最适吸收波长分光光度计上调节零点,作为空白对照,并对不同时间培养液从0h起依次进行测定,对浓度大的菌悬液用生理盐水/PBS适当稀释后测定,使其OD值在0.10.~0.65以内,经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数,才是培养液实际的OD值。

表2 生长曲线光吸收测定值

时间(h) 0 1.5 3 4 6 8 10 12 14 16 20 22 24 OD值

活菌数

4.4.3 绘制曲线找出细菌的生长繁殖的4个时期:迟缓期,对数期,稳定期,衰亡期。

4.5 利用OD值估测细菌活菌数:

根据菌体生长曲线,找出菌体对数生长期,测定在对数生长期细菌活菌数。选对数期OD值在0.9-1之间的菌液作为原菌液样品,将此液分别作1:1.0、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2.0六个稀释度稀释,分别测定其OD值,与此同时分别将此六个稀释度的菌液进行准确的细菌平板计数.记录OD值和相应的计数结果。(表3)

表3 细菌或菌数与OD值关系

稀释度生理盐水1:1.0 1:1.2 1:1.4 1:1.6 1:1.8 1:2.0 OD值

活菌数

根据比耳定律,溶液的浓度过高或过低,均能影响测量结果的准确性,固此选择OD值在0.2—1之间的范围确保结果回归方程r均大于0.95.从而证明了在此光度的范围内,细菌菌液的吸光度与细菌活菌数之间呈强相关性。