国自然 面上项目标书范例
申请代码H1606
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国家自然科学基金
申请书
(2010版)
资助类别：面上项目
亚类说明：
附注说明：
项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?
申请人：电话：
依托单位：
通讯地址：
邮政编码：266021 单位电话：
电子邮箱：
申报日期： 2010年2月26日
国家自然科学基金委员会
基本信息yoKWT/OQ
申请人信息姓名性别男
出生
年月
1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月） 8 电话电子邮箱
传真国别或地区中国
个人通讯地址
工作单位
主要研究领域肿瘤分子生物学
依托单位信息名称
联系人电子邮箱电话网站地址
合作研究单位信息
单位名称复旦大学
[在此录入修改]
项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?
资助类别面上项目亚类说明
附注说明
申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤
基地类别
研究年限2011年1月— 2013年12月研究属性基础研究
申请经费35.0000万元
摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。本课题设计首先通过GST pulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系。本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有国际先进性。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。
关键词(用分号分开，最多5个)肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移
经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）
一.研究经费28.7500
1.科研业务费7.6000
（1）测试/计算/分析费 2.1000 DNA测序，生物信息分析，统计分析（2）能源/动力费
（3）会议费/差旅费 1.0000 参加学术会议3-4人次
（4）出版物/文献/信息传播费 3.0000 文献检索，发表论文，专利申请
（5）其他 1.5000 成果鉴定
2.实验材料费21.1500
（1）原材料/试剂/药品购置费17.1500 各种试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材
（2）其他 4.0000 动物饲养，临床调研
3.仪器设备费0.0000
（1）购置
（2）试制
4.实验室改装费
5.协作费
二.国际合作与交流费 1.5000
1.项目组成员出国合作交流
2.境外专家来华合作交流 1.5000 邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流
三.劳务费 3.0000研究生加班补贴
四.管理费 1.75005%管理费
合计35.0000
与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费
其他经费资助（含部门匹配）
其他经费来源合计0.0000
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一、立项依据与研究内容：
（一）项目的立项依据
原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。
E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。
E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[ 4-5 ]。有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。
E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14 ]。那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。
为了解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与
E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin 并调节细胞迁移呢？
Pyk2(proline rich tyrosine kinase 2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明， Pyk2在59%的肝癌组织中表达上调， Pyk2高表达与肝癌组织体积、Edmonson分级
呈正相关， Pyk2表达越高病人预后越差。动物实验显示在侵袭边缘的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达。肝癌细胞株转染Pyk2后，其迁移功能增强；而用裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[19-20]。
Pyk2调节肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，Pyk2提高
c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[19-20]；也有报道Pyk2与 PECAM-1（血小板/内皮细胞粘附分子，与E-cadherin
一样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[21]；还有报道RhoC通过激活Pyk2促进前列腺癌转移[18]以及与SOCS3、Cyr61有关等 [22-23]。总而言之，目前Pyk2调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚。
Pyk2与E-cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。我们继续应用酵母双杂交反复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明二者相互作用是可靠的（具体结果见研究基础）。那么，现在的问题是二者在体内状态下是否结合？结合后的调节机制是什么？二者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞
迁移以及影响肿瘤转移？
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，我们的前期工作发现E-cadherin与Pyk2的激酶部分结合，因此有两种可能性。一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。我们认为第一种可能性较大。有文献报道，Pyk2能磷酸化
VE-cadherin（E-cadherin同源家族成员）并且抑制其与Catenin，P120等形成复合体[24-25]。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该也有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，从而导致肿瘤细胞侵袭性下降。申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性[26]，申请人做这方面工作时曾取E-cadherin做对比参照，结果发现抑制Pyk2激酶活性不是很明显（本数据未发表），因此不支持第二种可能性。二者具体如何调节还需要进一步实验来证实。
本课题的设计主要是为了解答上述问题。首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能相互作用以及调节机制；其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性。本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接相互作用，并且确定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。许多新型抗癌药物如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶为治
疗靶点，取得非常好的疗效。本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。
参考文献：
[1] He J, Gu D, Wu X, et al. Major causes of death among men and women in China. N Engl J Med
2005;353:1124–34.
[2] 吴孟超，廖美琳，陆嘉德常见恶性肿瘤治疗进展上海科技教育出版社2007
[3] Bryant DM, Stow JL. The ins and outs of E-cadherin trafficking. Trends Cell Biol. 2004
Aug;14(8):427-34
[4] Wells A, Yates C, Shepard CR. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting
transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis.
2008;25(6):621-8. Epub 2008 Jul 4
[5] Salon C, Lantuejoul S, Eymin B, et al. The E-cadherin-beta-catenin complex and its implication in lung
cancer progression and prognosis. Future Oncol. 2005 Oct;1(5):649-60
[6] Howard EW, Camm KD, Wong YC, et al. E-cadherin upregulation as a therapeutic goal in cancer
treatment. Mini Rev Med Chem. 2008 May;8(5):496-518.
[7] Guo C, Liu QG, Yang W, et al. Relation among p130Cas, E-cadherin and beta-catenin expression,
clinicopathologic significance and prognosis in human hepatocellular carcinoma. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2008 Oct;7(5):490-6.
[8] Zhai B, Yan HX, Liu SQ, et al. Reduced expression of E-cadherin/catenin complex in hepatocellular
carcinomas. World J Gastroenterol. 2008 Oct 7;14(37):5665-73.
[9] Fransvea E, Angelotti U, Antonaci S, et al. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates
E-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 2008 May;47(5):1557-66.
[10] Osada T, Sakamoto M, Ino Y, et al. E-cadherin is involved in the intrahepatic metastasis of
hepatocellular carcinoma. Hepatology. 1996 Dec;24(6):1460-7
[11] Auerkari EI. Methylation of tumor suppressor genes p16(INK4a), p27(Kip1) and E-cadherin in
carcinogenesis. Oral Oncol. 2006 Jan;42(1):5-13.
[12] Wei Y, Van Nhieu JT, Prigent S, et al. Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma:
Correlations with genetic alterations, β-catenin expression, and clinical features Hepatology 2002 Sep;36(3):692-701
[13] Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may
contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:29
[14] Fujita Y, Krause G, Scheffner M,Hakai, et al. Hakai, a c-Cbl-like protein, ubiquitinates and induces
endocytosis of the E-cadherin complex. Nat Cell Biol. 2002 Mar;4(3):222-31.
[15] McLachlan R W, Yap A S. Not so simple: the complexity of phosphotyrosine signaling at cadherin
adhesive contacts. J Mol Med 2007 85:545-554.
[16] Avraham H, Park SY, Schinkmann K, et al. RAFTK/Pyk2-mediated cellular signalling. Cell Signal.
2000 Mar;12(3):123-33.
[17] Behmoaram E, Bijian K, Jie S, et al. Focal adhesion kinase-related proline-rich tyrosine kinase 2 and
focal adhesion kinase are co-overexpressed in early-stage and invasive ErbB-2-positive breast cancer and cooperate for breast cancer cell tumorigenesis and invasiveness. Am J Pathol. 2008 Nov;173(5):1540-50.
[18] Iiizumi M, Bandyopadhyay S, Pai SK, et al. RhoC promotes metastasis via activation of the Pyk2
pathway in prostate cancer. Cancer Res. 2008 Sep 15;68(18):7613-20.
[19] Sun CK, Man K, Ng KT, et al. Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) promotes proliferation and
invasiveness of hepatocellular carcinoma cells through c-Src/ERK activation. Carcinogenesis. 2008 Nov;29(11):2096-105.
[20] Sun CK, Ng KT, Sun BS, et al. The significance of proline-rich tyrosine kinase2 (Pyk2) on
hepatocellular carcinoma progression and recurrence. Br J Cancer. 2007 Jul 2;97(1):50-7.
[21] Zhang X, Xu LH, Yu Q. Cell aggregation induces phosphorylation of PECAM-1 and Pyk2 and
promotes tumor cell anchorage-independent growth. Mol Cancer. 2010 Jan 14;9:7
[22] Zhang S, Guo D, Jiang L, et al. SOCS3 inhibiting migration of A549 cells correlates with PYK2
signaling in vitro. BMC Cancer. 2008;8:150.
[23] Vitale G, Gentilini D, Abbruzzese A, et al. Pyk2 and Cyr61 at the cross-road of cAMP-dependent
signalling in invasiveness and neuroendocrine differentiation of prostate cancer. Cancer Biol Ther.
2009;8
[24] Turowski P, Martinelli R, Crawford R, et al. Phosphorylation of vascular endothelial cadherin controls
lymphocyte emigration. J Cell Sci. 2008 Jan 1;121(Pt 1):29-37.
[25] Potter MD, Barbero S, Cheresh DA. Tyrosine phosphorylation of VE-cadherin prevents binding of
p120- and beta-catenin and maintains the cellular mesenchymal state. J Biol Chem. 2005 Sep 9;280(36):31906-12.
[26] Jian Chen, Lu Y, Meng S, et al. alpha- and gamma-Protocadherins Negatively Regulate PYK2. J Biol
Chem. 2009 Jan 30;284(5):2880-90
（二）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。
１.主要研究内容
1）确定E-cadherin与Pyk2体外、体内相互作用、作用位点以及调节关系。
A．取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。
B.选取二者表达量都适中的肝癌组织，行内源性免疫共沉淀，证明在体内二者也相互作用。
C.应用免疫荧光技术和蔗糖密度梯度超速离心方法分析细胞组分的方法确定E-cadherin与Pyk2在细胞中共定位。
D.应用磷酸化实验，确定E-cadherin是否是Pyk2的底物，应用定点突变的方法，确定酪氨酸的磷酸化位点。（同时再次确证E-cadherin能否影响Pyk2激酶活性。）2）从细胞水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响细胞迁移。
A.筛选Pyk2稳定表达细胞株，然后应用Transwell细胞迁移实验观察过表达Pyk2的细胞其迁移性、侵袭性的变化，检测过表达Pyk2时E-cadherin的磷酸化状态和蛋白水平的变化，确定Pyk2对E-cadherin磷酸化状态的调节影响细胞迁移。
B.取高转移肝癌细胞株MHCC97-H 、HCCLM3 (购自上海中山医院肝癌研究所)，应用RNAi技术沉默Pyk2的表达，观察细胞迁移性、侵袭性的变化，检测相应状态下E-cadherin的磷酸化状态和表达水平的变化。从相反方向确定Pyk2的表达抑制后对E-cadherin磷酸化状态的调节，以及这种调节对细胞迁移的影响。
3）从动物模型水平确定Pyk2对E-cadherin的调节影响肿瘤转移。
应用Pyk2稳定表达细胞株接种裸鼠，观察裸鼠肿瘤肺转移肝转移情况，分析Pyk2的过表达对E-cadherin磷酸化状态的调节关系，以及与肿瘤转移的相关性。
4）从肝癌病人标本中寻找Pyk2与E-cadherin磷酸化状态的相关性，以及与肿瘤转移的的相关性。
收集肝癌标本，应用免疫组化和Western等方法确定Pyk2的表达水平的变化与E-cadherin磷酸化状态和蛋白水平的相关性，以及二者与肿瘤转移的相关性。
２.研究目标
1）确定Pyk2结合E-cadherin相互作用的结构域及磷酸化位点，并阐明其调节机制。
2）确定Pyk2与E-cadherin的调节可影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。
３.拟解决的关键科学问题
E-cadherin酪氨酸残基的磷酸化导致其被降解，增加细胞侵袭性。本课题能够确定酪氨酸激酶Pyk2能否磷酸化E-cadherin，Pyk2与E-cadherin的调节是否是调节肿
瘤细胞转移的新的分子机制。
（三）拟采取的研究方案及可行性分析。
１.研究方法
GST-pull down，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定表达细胞株的筛选，RNAi抑制Pyk2表达，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。
２.关键技术说明：
1）磷酸化实验
首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参照，以纯化的GST-E-cadherin 蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin，则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察是否可以影响Pyk2的激酶活性。
2）细胞迁移实验
首先分别用空载体PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的C段，为Pyk2的失活突变体），用G418筛选出稳定表达细胞株。并检测稳定表达细胞株Pyk2蛋白表达量的不同。
然后应用稳定表达细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验，比较细胞迁移率的变化；检测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋白表达量的关系。同时取相应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
3）裸鼠成瘤肿瘤转移实验
取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星期左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移情况和肺转移情况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白表达量的不同以及与肿瘤转移的关系。同时取相应肿瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化，确定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
4）蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀
取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检测。如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中，则提示我们二者在细胞内是共定位的。
取上述二者的表达较多的组分，用Pyk2单抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作对照），
然后用E-cadherin 单抗杂交检测E-cadherin 是否能与Pyk2共沉淀下来。相反方向则是：用E-cadherin 单抗免疫沉淀E-cadherin （免疫球蛋白作对照），然后用Pyk2单抗杂交检测Pyk2是否能与E-cadherin 共沉淀下来。
３.技术路线（见下图）
1. 左侧部分：取E-cadherin 与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、
GST-Pull Down 以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位；磷酸化实验确定E-cadherin 是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸化E-cadherin 的分子机制。
2. 中间部分：通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型确定：Pyk2
通过磷酸化E-cadherin 影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。
3. 右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western 等方法检测
E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析二者表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。
4. 最下面部分为汇总数据，总结分析。
4.可行性分析
1） 前期实验已经从酵母双杂交、GST-Pull Down 、免疫共沉淀等证实了定点突变，GST-pull down ，免疫共沉淀等方法验证确定相互作用的结构域以及位点 荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证在细胞以及肿瘤组织中共定位 收集肝癌病人标本和临床资料 免疫组化、Western 等方法检测E-cadherin 蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。 磷酸化实验确定E-cadherin 是否是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点 细胞迁移实验:测Pyk2蛋白过表达和RNAi 抑制时与E-cadherin 磷酸化水平、细胞迁移的关系。 筛选稳定表达Pyk2肝癌细胞株，检测Pyk2蛋白表达量与E-cadherin 磷酸化水平的关系。 裸鼠成瘤转移实验:Pyk2蛋白表
达量、E-cadherin 磷酸化水平与
肿瘤转移的关系。 汇总分析数据：揭示Pyk2磷酸化E-cadherin 机制；揭示Pyk2通过磷酸化E-cadherin 影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。
E-cadherin与Pyk2相互作用(见研究基础部分)，而且二者功能上密切相关。E-cadherin 作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触抑制方面具有作用。而Pyk2能通过各种信号途径参与调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，二者在功能上是有互相作用基础的。
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，且前期实验结果提示Pyk2激酶区域结合E-cadherin，因此有两种可能，一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其与Catenin、P120等形成复合体，从而影响细胞迁移。
E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该就有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证实Pyk2磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2过表达，检测E-cadherin磷酸化增强，蛋白量减少，导致细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi抑制Pyk2的表达，则出现相反的结果，E-cadherin磷酸化减弱，蛋白量增加，导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少。事实是否如此，需要实验来证明。
申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin 抑制Pyk2的活性，在肿瘤条件下，由于其他原因E-cadherin减少或消失，而不能抑制Pyk2活性，导致Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要改变为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物，观察E-cadherin对Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后筛选E-cadherin过表达、功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白表达量及磷酸化水平相关性。但是申请人在完成γ- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参照，结果发现E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。
从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。
2）本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件。本课题组的成员对所需要的技术方法都很熟练，且都有相应的工作基础，可以在各个方面进行协作。
3）本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都具备。
（四）本课题的特色与创新之处
1.本课题通过酵母双杂交新发现一个与E-cadherin相互作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的相互作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，具有国际先进性和独创性。（有报道二者的表达量与肿瘤转移的关系，但是二者直接相互作用未见报道。）
2. 本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于
E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此具有独创性和先进性。（五）年度研究计划及预期研究结果
1.年度研究计划
2011.01-2011.12 磷酸化实验确定二者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互作用可靠，同时确定二者结合的结构域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度
超速离心，荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位。同时收
集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。
2012.01-2012.12细胞迁移实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测Pyk2的表达与E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，确定其调节机制。
同时完成E-cadherin/Pyk2的表达以及磷酸化状态与肝癌的分期、转
移、预后、复发等临床指标的相关性分析。
2013.01-2013.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
2.预期研究结果
1)确定Pyk2能够磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的结构域以及磷酸化位点。
2)确定Pyk2通过磷酸化E-cadherin，从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。
3)确定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及二者的表达与肝癌转移的相关性。
4)在国外学术期刊上发表SCI论文2-4篇，其中影响因子大于5的有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。
5)培养研究生2-3名。
二、研究基础与工作条件
（一）研究基础
第一步：为了研究肝癌转移的机制，首先选取E-cadherin（胞内段，以下实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交，寻找与E-cadherin相互作用的蛋白。我们先选取的是LACZ系统蓝白斑筛选，但是因为背景高而放弃。后来选取CytoTRAP系统，背景明显减低，测序后有意义的基因有31个。其中有4个为Pyk2片段。通过克隆Pyk2基因全长验证，确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的（图1）。（同时验证Pyk2的同源蛋白
FAK与E-cadherin相互作用为可疑弱阳性）。
图1 酵母双杂交（CytoTRAP系统）验证Pyk2与E-cadherin相互作用
pMyr-Lamin为阴性对照，pMyr-SB为阳性对照，E-Cad为E-Cadherin缩写，以下图示与此相同。Psos-E-Cad为诱饵蛋白。CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不相互作用在25℃时可以生长，而在37℃则不能生长,如阴性对照pMyr-Lamin所示。两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都能生长,如阳性对照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2与阳性对照相似。
第二步：原核表达E-cadherin和His-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证二者是直接结合，我们分别细菌中表达纯化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全长非常难纯化，得不到纯化的蛋白。我们表达纯化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown实验结果证实Pyk2的激酶部分能够与E-cadherin直接结合（图2）。
泳道 1 2 3
图2 原核表达E-cadherin和His-Pyk2激酶部分进行GST-Pulldown。
分别原核表达GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin 分别与相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用his抗体Western检测，结果显示His-Pyk2激酶部分能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），泳道1上图是纯化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作为检测标准。
第三步：原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。我们转染Myc-Pyk2于SYF细胞（SYF细胞株是酪氨酸激酶c-Src, Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成纤维细胞建成的细胞系，用这个细胞株可以排除Src等其他非受体型酪氨酸激酶的干扰。），实验结果发现GST-E-cadherin可以与真核表达的Myc-Pyk2全长结合，而GST作为对照不能与之结合（图3）。
泳道 1 2 3
图3 原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。
转染Myc-Pyk2于SYF细胞，裂解细胞取上清，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的细胞上清混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用Myc抗体Western检测，结果显示Myc-Pyk2能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），上图泳道1是细胞裂解液上清，检测到Myc-Pyk2蛋白作为Pulldown的参照。
第四步：我们在SYF细胞株中应用外源性免疫共沉淀技术验证，即Flag
-E-cadherin和Myc-Pyk2共转染SYF细胞，结果证明二者仍然是相互作用的（图4）。
泳道 1 2 3 4 5 6
图4 Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2免疫共沉淀结果
三组SYF细胞分别转染Myc-Pyk2、Flag -E-cadherin和共转（泳道1，2，3），左侧Input：Western检测蛋白表达量；右侧IP（泳道4，5，6），下图（泳道5，6）检测用Flag抗体沉淀下来的Flag -E-cadherin，结果发现Myc-Pyk2能被Flag -E-cadherin沉淀下来（上图泳道6），而对照不能（上图泳道4，5））。
上述实验都重复三次以上确保可重复性。这些数据让我们相信二者的相互作用是比较可靠的。本课题是申请者在原工作基础上的继续和深入。申请者一直专注于肿瘤信号通路的研究，尤其是肝癌的转移方面。因此对本课题的背景和技术都非常熟悉。参加人员都有良好的科研背景以及相关方面的特长。因此，我们具有完成本课题的切实可行的、扎实的工作基础。
（二）工作条件
本课题组所在学校的附属医院具有病例收集的良好条件，同时学校领导非常支持，本校及合作单位拥有国家重点实验室，具有设备完善而先进的的分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学、组织病理技术等实验平台。课题组的成员也具有团结协作创新的精神、求实的科学态度，多名成员已发表SCI论文，为本项研究工作提供有利的人力资源。
（三）申请人和项目组主要成员简历
三、其他附件清单
医学伦理委员会审批件。
解除保护
签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章)
[
申请人：依托单位：青岛大学
项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?
资助类别：面上项目亚类说明：
附注说明：
申请人承诺：
我保证申请书内容的真实性。如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。
签字：
项目组主要成员承诺：
我保证有关申报内容的真实性。如果获得资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。
依托单位及合作研究单位承诺：
已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。
依托单位公章合作研究单位公章1 合作研究单位公章2 日期：日期：日期：
国家自然基金标书评分标准
国家自然基金标书申报体会 申报体会一： 一、要抓住一个“新”字 1、题目要新颖：题目是很关键的东西，要从题目上吸引人，从题目上体现出你研究的“新”来。 （1）现在的研究热点。前五年，只要涉及到纳米技术的，国家自然科学基金委全部给予资助，或多或少。分析原因有二：一是这是新出现的，我们国内还是空白，需要从各个方面来加强；二是这方面的标书少，中标率高。 （2）别人可能没有听过的名词。2001年吧，有个学者的标书是“数字细胞”，一下就把人吸引住了，最后这个课题拿了一百多万；其实就是用仪器记录细胞信号，将细胞内的电活动用数字的形式表现出来了。随后出现了数字外科等等。 提到的这两点是给大家一个启发，在项目的题目上也要下工夫。 2、内容要新颖：这是标书的关键，要有自己新的idea。从研究的内容、研究的方法和技术路线上都要体现新，那就需要申报者多动脑筋，多下工夫。 二、要“勤” 1、勤的第一个方面就是标书要多写，国家级的，省级的都要积极的写。在写的实践过程中不断的提高自己的能力，不要不怕中不了不敢写，也不要因为写了没有中就不写了，只有写了才有机会中，如果不写，是觉得没有机会的。当然这还涉及到一个心理的问题，如果你能完成一份完整的标书，心理上的一个障碍就可能消除。当你再动手开始写的时候你就会说标书我曾经写过，对它的各个步骤不生疏，写起来也就得心应手了，但是这个过程一定要经历。 2、勤的第二个方面就是早点准备，在上次申报完以后就开始准备下一年度的题目。要给自己足够的时间来写，来检查标书中存在的问题。修改一年的标书和修改一个月的标书的质量是有很大的差距的。 3、勤的第三个方面就是平时要多做些研究工作，对于自己的实验结果要多总结，多发表文章。因为国家自然基金要看你的工作基础，这个工作基础并不只是你现在有基金项目，而更重要的是看你在你自己的研究领域内长期做的工作是否与本次申报的内容有相关性，研究方向和内容上的相关性，实验方法和技术手段上的相关性。如果在这个学科有许多的文章，那中标机会就大大增加了。
公司投标书万能范本
投标书范本 X X X X X X公司标书 项目名称：X X X X X X X X 年月日
注：需按下列顺序装订投标文件 一、投标书封面格式 投标书 项目名称： 投标单位： 投标单位全权代表： 投标单位：（公章） _______年___月___日 二、投标书格式 投标书 致：________________公司（招标方） 根据贵方为_________________项目招标采购货物及服务的投标文件 _________________（招标编号），全权代表_______________（全名）___________（职务）经投标方正式授权并代表依据中华人民共和国法律在 ______________________________（注册地址）注册的投标方_______________（投标方名称）提交下述文件正本一份和副本一式_______份。 （1）开标一览表； （2）投标价格表； （3）货物简要说明一览表； （4）按投标须知要求提供的全部文件；
（5）资格证明文件； （6）其它：________________________________。 投标方、全权代表宣布同意如下： （1）按照招标文件中的一切内容，提供符合要求的设计和_______________产品。 （2）投标方将按招标文件的规定、要求及投标方文件的每一项要求或承诺，按期、按质、按量履行合同责任和义务。 （3）投标方已详细审查全部招标文件，包括修改文件（如需要修改）以及全部参考资料和有关附件，我们完全理解并同意这些内容。投标方同意提供按照贵方可能要求的与其投标有关的一切数据或资料，并保证提供的投标文件均真实、完整，不存在任何虚假事项，投标方完全理解不一定要接受最低价格的投标或受到的任何投标。并自行承担与投标及相关过程中涉及的全部费用、风险、损失。 （4）投标方已于__________年____月____日依据招标文件到制定银行账户缴纳保证金。 （5）投标自开标日期有效期为___________个自然日。 （6）与本投标有关的一切正式往来通讯请寄： 地址： 邮编： 电话： 传真： 投标方全权代表姓名、职务： 投标方名称（公章）： 法定代表人签字：_______________ 日期：______年___月___日 全权代表签字：_________________ 三、开标一览表
国自然 面上项目标书范例
. H1606 申请代码 受理部门收件日期 受理编号解除保护 国家自然科学基金书申 请)0(210版 资助类别：面上项目亚类说明：附注说明： 促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合项目名称： Pyk2E-cadherin? 并磷酸化申请人：电话： 依托单位：通讯地址： 266021 邮政编码：单位电话：电子邮箱： 月2年申报日期： 201026日 国家自然科学基金委员会'. . 基本信息yoKWT/OQ
'. . 经费申请表（金额单位：万元）
'. . 查看报告正文撰写提纲报告正文一、立项依据与研究内容： （一）项目的立项依据 原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进[2]。一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin 家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120[3]。等形成复合体发挥上述功能 [ 4-5 ]。有人认为提高E-cadherin的表E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[6]。与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌达可以成为肿瘤治疗的一个方向的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出[7-9]。有人报道缺乏E-cadherin现转移表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin 在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的[10]。作用E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基[11]以及E-cadherin因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默蛋白被磷酸化后水解[12-13]。因此最大的可能性是等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与[14 ]。那么有多少酪氨酸激酶参与泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解（一种E3Hakai 这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin 磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。
技术标书范本
投标声明函 项目投标书 投标单位： 投标单位授权代表（签字）： 致： 我方收到贵方的招标文件后，经过详细研究，我方正式授权下属签字人代表投标人参加该项目招标活动并投标。为此，我方郑重声明以下几点，并付法律责任。 1、我方愿意按照招标文件中的一切要求，提供招标物资及技术服务。 2、如果我方的投标书被接受，我方将履行招标文件中规定的每一项要 求，按期、按质、按量完成交货任务。 3、我们同意招标文件中的规定，本标书有效期为开标后45天。 4、我方同意招标文件规定交纳投标保证金，遵守贵招标代理人的有关招 标各项规定。 5、我方愿意按《合同法》的规定履行自己的全部责任。 6、所有有关本标书的函电，请按下列地址联系。 单位：邮编： 地址：联系人： 电话：E-mail：
授权委托书 XXXX公司： 根据贵公司海上钻井平台固定式气体报警仪工程改造项目招投标文件规定，我公司授权委托为本项目的全权代表，授权其代表我公司在本项目中参加招投标会议并负责投标文件的签署，项目的洽谈、合同的签订及履行与该项目有关的一切事宜。 本授权书自出具之日起生效。 附：全权代理人信息
企业简介公司基本信息表
公司历史业绩
公司主要技术装备及人员 公司主要科研设备 序号类型性能指标数量生产厂家出厂日期 1 计算机P4/2.4 2 2 DELL 2005.2 2 工作站160G 2 SUN 2005.5 3 绘图仪150*89 2 HP 2004.2 4 一体机打印/复印/传真8 夏普、东芝2003.6 5 投影机数字高清 4 索尼2004.6 6 界面张力仪0.02/0.04 1 德国Motec 2006.3 投标人代表签字：_________ 售后技术服务承诺函 一、系统在投运一年内出现质量问题或系统问题，我方将免费更换设备，并恢复正常生产，对于超过保质期的问题（非人为造成的），我方将及时维修或提供配件。 二、我方保证在用户提出的时间内保质保量完成系统的调试工作、人员培训等均不收费。 三、我方派往用户现场的工作人员保证遵守纪律，服从用户的指挥、听从现场调度。 四、安装调试前，我方将向用户技术人员交底，讲解、示范调试，如果因我方技术人员交代不清出现的违章操作，由我方负责。 五、我方在场人员有权处理出现的一切技术问题，保证用户在规定的时间里解决问题。 六、我方保证在用户要求解决问题的最短时间内到达现场，一般为24小时，最长为48小时。
国自然 面上项目标书范例
申请代码H1606 受理部门 收件日期 受理编号 解除保护 国家自然科学基金 申请书 (2010版) 资助类别：面上项目 亚类说明： 附注说明： 项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin? 申请人：电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码：266021 单位电话： 电子邮箱： 申报日期： 2010年2月26日 国家自然科学基金委员会
基本信息yoKWT/OQ 申请人信息姓名性别男 出生 年月 1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月） 8 电话电子邮箱 传真国别或地区中国 个人通讯地址 工作单位 主要研究领域肿瘤分子生物学 依托单位信息名称 联系人电子邮箱电话网站地址 合作研究单位信息 单位名称复旦大学 [在此录入修改] 项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin? 资助类别面上项目亚类说明 附注说明 申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤 基地类别 研究年限2011年1月— 2013年12月研究属性基础研究 申请经费35.0000万元 摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。本课题设计首先通过GST pulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系。本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有国际先进性。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。 关键词(用分号分开，最多5个)肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移
国家自然科学基金NSFC申请标书写作全攻略
国家自然科学基金(NSFC)申请标书写作全攻略 指导思想篇 1、追求卓越，在知识上要绝对专业，果断反对侥幸心理。 2、相信NSFC申请是公平的，大家靠实力竞争，必须花大力气写标书；假如你认为NSFC 只有关系，你就不用继承往下看了。 3、NSFC是一个系统工程，需要花很多时间和精力，而不仅仅是几页标书，是聪明沉淀的结晶。 4、不要把NSFC看的高不可及，你要相信自己的创意，哪怕你只是一名一年级硕士 5、机会主义是有的，但我们没有什麽其它的资本，只能消灭标书里一切可能的失败因素，加上完美的选题和课题设计，彻底征服评委，不给评委任何黑掉你的机会。 6、基金申请不同于实际研究课题设计，必须把个人爱好与NSFC兴趣结合一致，投其所好。 选题立项篇 1、基金成败要害还是选题要好，提前半年，刚入行的提前一年进行课题搜索 2、老板指定的题未必是好题，最好自己选题，如何立项应该是研究生学习最重要的一课，毕业后你会发现，没有人会指点你什麽课题有价值了，在中国学术的沙漠里，只剩下你自己了。 3、好课题是对学科深刻理解的条件下产生的，大量翻阅文献吧，汲取知识的同时千万别忘了思索，你发现别人存在漏洞的时候，好课题就离你不远了。 4、选题最好以问题为导向，不要以技术为导向，找到问题了，课题就找到了。而拿着新技术去找能解决的问题，效果多数不好，但还是大有人在，比如RNAi。 5、解放思想，发散思维，多方法多学科交叉，一般都会比较受人青睐，轻易申请到基金，但不能为了交叉而强行交叉。 6、创新性新技术、新理论的课题要有一定的理论与技术基础，最好有工作基础，没有你也要东拼西凑，这是在中国，NSFC好像讨厌空中楼阁 7、临床课题研究最好别选临床应用方向，而选应用基础研究。 8、选择自己认识，有工作基础的领域，别跨越太远。你是在谝钱，记住了，你不装的象个行家，NSFC是不会给钱的。 9、重要科学问题的切入点正确，切忌过宽、过大，只要体现一定的新意和研究价值就行了，能得诺贝尔奖的课题NSFC是不给钱的。 10、没有人做过的课题不能做为立项的依据，但NSFC资助的项目必须是国际上没人做过的，而不是海内空白。当然，如果国际上有同类结果，你不说，地球上的中国人也许也不知道，但一旦被识破，你死定了。 11、如果是捕获科研前沿性的课题，最好设计周密，尤其是目的和结果的一致性、可获得性和可预期性，通过课题实施所获得的结果必须能充分支持与研究目标相一致的结论。12、热点课题不一定是好课题，热点上的人也很热。但在还没热起来的热点，一定是一个好课题，标书评审滞后半年呢，比如最开始的一批SARS课题。有时也不防设计一些非热点但是对与科研有价值的课题，发挥出奇不意的效果。 13、临床课题可以是当前没有好办法治疗的疾病，急需解决的临床问题，而在国际上检索的文献只有几篇的那种。 14、本人不主张以最新的重量级文献做指导，你会发现，很多人跟你的想法惊人的一致。有人特殊反对跟风。
工程投标书范本
工程投标书范本一、投标书封面格式
二、投标书格式 投标书 致：______________________________ 根据贵方为____________________________项目招标采购货物及服务的投标邀请 _________________________________ （招标编号），签字代表______________________（全名、职务）经正式授权并代表投标人____________________（投标方名称、地址）提交下述文件正本一份和副本一式_______份。（1）开标一览表 （2）投标价格表 （3）货物简要说明一览表 （4）按投标须知第14、15条要求提供的全部文件 （5）资格证明文件 （6）投标保证金，金额为人民币____________________元。 据此函，签字代表宣布同意如下： 1．所附投标报价表中规定的应提供和交付的货物投标总价为人民币_________________元。2．投标人将按招标文件的规定履行合同责任和义务。 3．投标人已详细审查全部招标文件，包括修改文件（如需要修改）以及全部参考资料和有关附件。我们完全理解并同意放弃对这方面有不明及误解的权利。 4．其投标自开标日期有效期为____________________个日历日。 5．如果在规定的开标日期后，投标人在投标有效期内撤回投标，其投标保证金将被贵方没收。6．投标人同意提供按照贵方可能要求的与其投标有关的一切数据或资料，完全理解不一定要接受最低价格的投标或受到的任何投标。 7．与本投标有关的一切正式往来通讯请寄： 地址：___________________________________ 邮编： ___________________________________ 电话：___________________________________ 传真： ___________________________________ 投标人代表性名、职务：_________________________________ 投标人名称（公章）：_________________________________ 日期：______年___月___ 日 全权代表签字：_________________
软件项目招标书范例
一、项目名称河南省农村中小学现代远程教育工程试点工作教学资源库和备课系统项目. 二、项目概述 2004－2005年度河南省农村中小学现代远程教育工程试点工作是国家信息化的重要组成部分，将为河南省农村中小学按照三种模式进行配备,本次项目所招教学资源库和备课系统为模式的配套应用软件。 三、软件技术要求 教学资源库: 教学资源库应具有较强的政治性、科学性、实用性、针对性和时效性。要体现国家意志，符合国家的有关法律、法规和政策，贯彻党的教育方针，体现基础教育的性质、任务和培养目标，符合国家颁布的课程标准的各项要求。1．基本要求与功能 教师能够利用教学资源库通过网络进行备课、资料查询、参与教师培训等工作；能够通过网络组织、指导学生进行自主学习、协作学习和研究性学习等学习活动。 （1）内容符合教育需要，能够适应课程改革资源内容应以教育部《基础教育课程改革纲要（试行）》为指导，与各学科课程标准（教学大纲）和教材相适应。资源内容应是课程内容的延伸和补充，能够有效地解决教学中的重点、难点问题，为教师的教学设计和学生的学习提供充分、适用的多媒体资料；满足教师的教学、进修和学生自主学习、研究性学习、协作学习等学习方式的需求。 教学资源库内容应通过省级及以上教育行政部门组织的有关审定。
（2）资源应具有良好的开放性和规范性 资源开发必须符合教育部信息技术标准化委员会颁布的《基础教育教学资源元数据规范》等相关资源建设标准，以保证资源信息描述清晰，保证实现优质资源的共建与共享，使资源具有很强的开放性和规范性。符合科学、系统的资源分类方式；每个知识点下的资源均应包括备课资料、多媒体素材、能力训练三方面资源；资源分类细目包括且不限于教学目标、教学建议、教案示例、扩展资料、各类多媒体素材、习题、探究活动等类型。 （3）资源更新及时、形式丰富、容量大 要求紧密跟踪基础教育课程改革，兼顾各版本教材，满足各教学环节的需求；资源可持续追加，素材实用、新颖，且内容可添加和更新。 资源形式应包含文本、图片、动画、音频、视频、课件等多种媒体形式，特别应以动画、视频类素材为主，但视频资料内容不得是简单大头像形式。其中图片素材每幅容量一般不应小于150KB，视频素材不应是简单大头像形式，且清晰度一般以不出现模糊、马赛克现象为标准。 资源内容要涵盖初中各年级所有学科，资源库的总容量应达到80G以上。（4）教师自己创建的素材可加入到系统资源库中进行共享。 2．技术要求： （1）教学资源库的设计与要求 ①软件总体设计基于广域网络环境。 ②适用Windows和Linux操作系统，具有安全性、稳定性、高性能、高负载能力。 ③基于B/S系统框架，采用动态网页技术开发。
国家自然基金标书
国家自然基金标书内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
资助类别：_________________________________________________ 亚类说明：_________________________________________________ 附注说明：_________________________________________________ 项目名称：_________________________________________________ 申请人：____________________电话：_______________________依托单位：_________________________________________________ 通讯地址：_________________________________________________ 邮政编码：____________________单位电话：___________________电子邮箱：_________________________________________________ 申报日期：_________________________________________________ 国家自然科学基金委员会
基本信息
项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人）
国家自然科学基金项目资金预算表（定额补助） 项目名称： 项目负责人：金额单位：万元
投标书格式范本
正本 湖北中烟工业有限责任公司武汉卷烟厂废旧物资销售采购商库建设项目 投标文件 投标人：（盖单位章） 法定代表人或其委托人：（签字） 日期：年月日
格式一投标承诺函 致（招标人）： 我方决定参加贵方组织的招投标活动，对在项目的整个招投标过程中作出如 下承诺： 1、在投标、开标、评标、定标、公示、中标及合同签订等过程中，不向招标相关工作 人员行贿或者提供其他不正当利益，不提供虚假材料，不采取不正当手段诋毁、排挤其他投标人，不与招投标的各方（包括招标人、其他投标人及与项目相关的其他当事人）恶意串通投标。 2、对招标人提供的与本次招标涉及的相关资料、信息等给予保密，保证不予外泄。遵 纪、守法，遵守招标文件对廉政、保密方面的要求。 3、无论能否成为本次招标的中标人，均承诺按本项目中标价执行与贵方已签订的合同。 4、招投标文件中的其他要求。如违背以上承诺，我公司愿意接受被取消投标资格的处 罚； 特此承诺 投标人：（盖章） 法定代表人或委托代理人：（签字或签章） 日期：年月日
格式二法定代表人身份证明或法人授权委托书 （一）法定代表人身份证明 投标人名称：单位性质：地址： 成立时间：年月日 经营期限： 姓名：性别：年龄：职务：系（投标人名称）的法定代表人。特此证明。 附：法定代表人身份证复印件 投标人：（盖单位章） 法定代表人：（签字） 身份证号码： 日期：年月日
（二）授权委托书 本人（姓名）系（投标人名称）的法定代表人，现委托（姓名）为我方代理人。代理人根据授权，以我方名义签署、澄清、说明、补正、递交、撤回、 修改（项目名称）标段投标文件、签订合同和处理有关 事宜，其法律后果由我方承担。 委托期限：。代理人无转委托权。 附：法定代表人、代理人身份证复印件。 投标人：（盖单位章） 法定代表人：（签字） 身份证号码： 委托代理人：（签字） 身份证号码： 日期：年月日
软件项目标书范本.doc
中国外汇交易中心数据仓库一期项目建议第二册技术部分 安讯软件（上海）有限公司 2008年5月4日
目录 1项目目标 (1) 2技术解决方案 (2) 2.1系统总体架构 (2) 2.1.1逻辑架构 (2) 2.1.1.1功能层面（上侧面） (2) 2.1.1.2非功能层面（右侧面） (3) 2.1.2设计层面 (3) 2.1.2.1ETL数据抽取 (3) 2.1.2.2报表设计 (3) 2.1.2.3报表展现 (3) 2.1.2.4报表应用 (3) 2.1.3物理架构 (3) 2.1.4数据架构 (5) 2.2系统技术实现方案 (6) 2.2.1总体技术实现方案 (6) 2.2.2高效的ETL处理 (7) 2.2.2.1ETL总体处理流程 (7) 2.2.2.2数据仓库模型设计 (9) 2.2.3数据质量管理 (10) 2.2.3.1数据仓库对数据质量的要求 (10) 2.2.3.2数据质量改进目标 (10) 2.2.3.3数据质量改进方法 (10) 2.2.4报表平台设计 (11) 2.2.4.1灵活的报表查询 (12) 2.2.4.2先进的报表开发模式 (12) 2.2.4.3高效的报表消费 (12) 2.2.4.4老系统统计报表移植 (12) 2.2.5认证管理 (13) 2.2.6系统可靠性及可扩展性 (13)
2.2.7非功能性设计 (14) 2.2.7.1性能需求 (14) 2.2.7.2 灾备设计 (15) 2.2.7.3可获性设计 (17) 2.2.7.4 易用性设计 (17) 2.2.7.5 安全性设计 (18) 3项目管理 (19) 3.1沟通管理 (19) 3.1.1项目会议制度 (19) 3.1.1.1定期会议 (20) 3.1.1.2不定期会议 (20) 3.1.2项目状态周报制度 (21) 3.1.3沟通手段 (21) 3.2配置管理 (22) 3.2.1配置管理原则 (22) 3.2.2配置库管理 (22) 3.3变更管理 (22) 3.3.1发起变更 (22) 3.3.2评估变更 (23) 3.3.3审批变更 (23) 3.3.4执行变更 (23) 3.3.5变更执行评估 (23) 3.4质量管理 (24) 3.4.1质量规划 (24) 3.4.2质量保证 (25) 3.4.3质量检查 (26) 4工期进度 (26) 5附录 (27)
广告公司标书范本
××广告公司 标书项目名称：××经济开发区三面高立柱
2010年12月24日 目录 封面 (1) 目录 (2) 第一章投标函 (5) 投标函 (6) 投标函附表……………………………………………… 7 法定代表人证明书 (8) 投标企业资质证明及财务状况材料 (9) 营业执照……………………………………………… 10 税务登记证 (11) 投标报价表 (12) 关于投标报价的说明 (13) 第二章综合说明 (14) 承建该工程的指导思想 (15) 承建该工程的有利条件及优势 (16) 服务回访及保修政策 (18) 承诺书 (19)
工程质量承诺书 (20) 竣工验收承诺书 (21) 工程质量保修期承诺书 (22) 承担风险承诺书 (23) 不拖欠施工人员工资承诺书 (24) 工程质量保修书 (25) 第三章投标函附表 (27) 项目管理机构配备情况表 (28) 拟为本合同工程投入的主要机械设备表 (29) 项目部管理人员分工及职责 (31) 第四章施工组织设计建议书 (32) 工程概况 (33) 编制依据及编制范围 (34) 主要经济技术指标 (35) 施工准备 (37) 机械设备、原材料及人员进场 (40) 施工方案及技术措施 (41) 保证措施 (43) 质量保证措施 (44) 安全保证措施 (47) 工期保证措施 (49) 节约投资降低成本主要技术措施 (51)
防止质量通病措施 (52) 文明施工主要措施 (53) 雨雪季施工技术措施 (54) 第五章资格审查申请 (55) 资格审查申请书封面 (56) 资格审查申请书 (57) 资格审查申请书： 投标申请人一般情况表 (59) 近两年工程营业额数据表 (60) 近一年已完工程及目前在建工程一览表 (61) 财务状况表 (62) 投标企业简介 (63)
项目投标书(范本)标书范本
项目投标书（范本）标书范本 【范本】项目投标书 项目投标书（范本） 标书总目录 第一部分：投标书................................................ 一、投标书................................................ 二、投标申请单位概况................................. 三、授权书................................................... 四、投标报价................................................ 五、报价说明与建议.................................... 六、优惠条件............................................. 第二部分：综合说明................................. 一、承建该工程的指导思想及目标.................. 二、承建该工程的有利条件及优势.................. 三、工程工期目标及保证措施........................ 四、工程质量目标及保证措施........................
...... 第三部分：施工组织设计.................................... 一、工程概况................................................ 二、施工方案概述.......................................... 三、编制施工进度和劳力计划........................ 四、保证工程工期的具体措施........................ 五、施工程序与质量控制要点........................ 六、保证工程质量的具体措施..................... 七、安全文明施工的规定和措施.................. 八、附图附表............................................. 第四部分：标书附件.......................................... 一、资质证明................................................ 二、企业相关制度.......................................... 三、证书及工程图片.......................................
投标书格式范例
附件一投标书格式范例（投标书内容可根据实际需要进行删减） 投标书/项目投标书/XX项目投标书 第一部分基本文件 (一)公司类型、资历 ◆A公司在行业内有较大的知名度，在行业内声誉良好，技术领先，管理水平较高，分公司遍布全国。 ◆有多年的相关行业相关项目的成功运作经历，经验丰富 (二)团队组成 (三)方案特点 ?成本最低化 ?效率最高化 ?利润最大化
充分满足客户需求，实现共赢 (四)业务运作模式 充分发挥领导的作用，以全员参与为基础，利用先进的物流设施设备，监控系统及信息系统，保证业务运作的流畅性。 第二部分技术文件 (一)项目概况 由于本公司技术领先，管理水平高，设备先进，能够灵活利用外部资源，最大限度满足客户的需求。 (二)项目能达到的技术指标（送货准确率、货物送达平均时间等） 使用监控系统全程监控，实现无差错的送货率，货物送达及时；(三)运输监控软件 拥有先进的监控软件，全程监控。 (四)主要运输工具及配置 租用大型货车2辆，中型货车12辆 (五)运输计划 在1~10月，采用租2辆大型货车和2辆中型货车的方式配送。到A,B两个分销商分别采用1辆大型和1辆中型货车。 在11~12月，采用租10辆中型货车的方式配送。到A,B两个分销商分别采用5辆中型货车。 (六)运输流程 仓库——A经销商
仓库——B经销商 (七)运输工作量 在1~10月，大型车每个月送一次，共10次，一共6000箱；中型车每月送一次，共10次，一共4000箱； 在11~12月，中型车每月送一次，共2次，一共40000箱。 第三部分附件 (一)操作流程 (二)其他说明文件 第四部分商务文件（本部分单独密封列出，于开标日上交并开启） (一)部分及整体价格 1~10月运输成本为18.66万元 11~12月运输成本为7.32万元 维护费一年10万元 总成本共35.98万元 以40%的利润比为基础得出的总运营成本为50.372万元 我公司最后决定报价80万元 (二)服务费及其他费用收费标准 (三)其他需要说明的商务问题 我公司可提供分期付款的方式，首付40万，余下款额分期偿还; 若贵公司愿与我公司长期合作，形成战略合作伙伴关系，我方
2016公司招投标书优秀模板范例
正本 xxx公司（招标单位）投标项目名称 投标文件 （商务标书） 项目名称： 投标单位： xxxx年xx月
商务标书目录 1)投标函 2)开标一览表 3)投标货物数量、价格表 4)投标企业营业执照副本或复印件 5)|法人授权书 6)企业情况简介 7)产品设计，生产制造许可证的复印件 8)质量体系认证书复印件 9)企业设计，制造，检验的主要现行标准 10)产品样本或说明书等技术资料，获奖产品的 证明复印件 11)近三年来企业业绩及生产经验的有效说明， 包括生产能力及装备的简要情况。
投标函 招标单位名称： 按照贵方招标书第xxxxx号，xxx公司授权xxx 为全权代表，参加贵方组织的xxxxx设备采购招标的有关活动，并对该工程设备进行投标，为此： 1、提供投标须知规定的全部投标文件： a、商务标书：正本壹份，副本伍份； b、技术标书：正本壹份，副本伍份； 2、投标货物的总投标价为人民币xxx 元整（￥xxx万元）。 3、保证遵守招标文件中的有关规定和收费标准。 4、完全接受招标文件中的合同条件。 5、保证忠实地执行双方所签定的经济合同，并承担合同规定的责任 义务。 6、愿意向贵方提供任何与该项投标有关的数据、情况和技术资料。 7、本投标自开标之日起90天有效。 8、与投标有关的一切往来通讯请寄： 地址： 邮编：联系人： ：传真： 投标单位：（公章） 全权代表：（签字） xx年xx月xx 日
投标货物数量、价格表 单位:万元（含税） 投标单位全称：（盖章）xxxxxx 全权代表:（签章） 年月日
法人代表授权书 xxxx： xxxxxxxxx 法定代表人xxxx 授权xxxxx 为全权代表，参加贵公司组织的xxxxxxx采购的招标活动，全权处理招标活动中的一切事宜。 招标单位全称：（公章）xxxxx 法定代表人：（签字） 年月日 附全权代表情况表
项目投标书(范本)标书范本
项目投标书（范本）标书范本 标书总目录 第一部分：投标书………………………………………… 一、投标书………………………………………… 二、投标申请单位概况…………………………… 三、授权书…………………………………………… 四、投标报价………………………………………… 五、报价说明与建议……………………………… 六、优惠条件……………………………………… 第二部分：综合说明…………………………… 一、承建该工程的指导思想及目标……………… 二、承建该工程的有利条件及优势………………
三、工程工期目标及保证措施…………………… 四、工程质量目标及保证措施………………………… 第三部分：施工组织……………………………… 一、工程概况………………………………………… 二、施工方案概述…………………………………… 三、编制施工进度和劳力…………………… 四、保证工程工期的具体措施…………………… 五、施工程序与质量控制要点…………………… 六、保证工程质量的具体措施………………… 七、安全文明施工的规定和措施………………
八、附图附表……………………………………… 第四部分：标书附件…………………………………… 一、资质证明………………………………………… 二、企业相关制度…………………………………… 三、证书及工程图片………………………………… 一、投标书 （招标人名称）： 各位领导、各位专家、各位评委： 首先，感谢贵单位对我公司的信任，使我公司有机会参与贵单位的投标，我们深感荣幸并表示真诚的谢意。 我公司仔细研究了贵单位工程的招标文件及有关资料，同时对施工现场及周围环境进行了调查了解，经过反复论证、认真分析，愿意
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正本 xxx公司（招标单位） 投标项目名称 投标文件 （商务标书） 项目名称： 投标单位：
xxxx年xx月 商务标书目录 1)投标函 2)开标一览表 3)投标货物数量、价格表 4)投标企业营业执照副本或复印件 5)|法人授权书 6)企业情况简介 7)产品设计，生产制造许可证的复印件 8)质量体系认证书复印件 9)企业设计，制造，检验的主要现行标准 10)产品样本或说明书等技术资料，获奖产品的证明复印 件 11)近三年来企业业绩及生产经验的有效说明，包括生产 能力及装备的简要情况。
投标函 招标单位名称： 按照贵方招标书第xxxxx号，xxx公司授权 xxx 为全权代表，参加贵方组织的xxxxx设备采购招标的有关活动，并对该工程设备进行投标，为此： 1、提供投标须知规定的全部投标文件： a、商务标书：正本壹份，副本伍份； b、技术标书：正本壹份，副本伍份； 2、投标货物的总投标价为人民币 xxx 元整（￥xxx万元）。 3、保证遵守招标文件中的有关规定和收费标准。 4、完全接受招标文件中的合同条件。 5、保证忠实地执行双方所签定的经济合同，并承担合同规定的责任义 务。 6、愿意向贵方提供任何与该项投标有关的数据、情况和技术资料。 7、本投标自开标之日起90天内有效。 8、与投标有关的一切往来通讯请寄： 地址：
邮编：联系人： 电话：传真： 投标单位：（公章） 全权代表：（签字） xx年xx月xx 日 投标货物数量、价格表 单位:万元（含税）
国家自然科学基金标书写作全攻略 成功范例 份
国家自然科学基金标书写作全攻略+成功范例1份 指导思想篇 1、追求卓越，在知识上要绝对专业，坚决反对侥幸心理。 2、相信NSFC申请是公平的，大家靠实力竞争，必须花大力气写标书；如果你认为NSFC 只有关系，你就不用继续往下看了。 3、NSFC是一个系统工程，需要花很多时间和精力，而不仅仅是几页标书，是智慧沉淀的 结晶。 4、不要把NSFC看的高不可及，你要相信自己的创意，哪怕你只是一名一年级硕士 5、机会主义是有的，但我们没有什麽其它的资本，只能消灭标书里一切可能的失败因素， 加上完美的选题和课题设计，彻底征服评委，不给评委任何黑掉你的机会。 6、基金申请不同于实际研究课题设计，必须把个人兴趣与NSFC兴趣结合一致，投其所好。 选题立项篇 1、基金成败关键还是选题要好，提前半年，刚入行的提前一年进行课题搜索 2、老板指定的题未必是好题，最好自己选题，如何立项应该是研究生学习最重要的一课， 毕业后你会发现，没有人会指点你什麽课题有价值了，在中国学术的沙漠里，只剩下你自己了。 3、好课题是对学科深刻理解的条件下产生的，大量翻阅文献吧，汲取知识的同时千万别忘 了思考，你发现别人存在漏洞的时候，好课题就离你不远了。 4、选题最好以问题为导向，不要以技术为导向，找到问题了，课题就找到了。而拿着新技 术去找能解决的问题，效果多数不好，但还是大有人在，比如RNAi。 5、解放思想，发散思维，多方法多学科交叉，一般都会比较受人青睐，容易申请到基金， 但不能为了交叉而强行交叉。 6、创新性新技术、新理论的课题要有一定的理论与技术基础，最好有工作基础，没有你也要东拼西凑，这是在中国，NSFC似乎讨厌空中楼阁 7、临床课题研究最好别选临床应用方向，而选应用基础研究。 8、选择自己熟悉，有工作基础的领域，别跨越太远。你是在谝钱，记住了，你不装的象个 行家，NSFC是不会给钱的。 9、重要科学问题的切入点准确，切忌过宽、过大，只要体现一定的新意和研究价值就行了， 能得诺贝尔奖的课题NSFC是不给钱的。 10、没有人做过的课题不能做为立项的依据，但NSFC资助的项目必须是国际上没人做过的，而不是国内空白。当然，如果国际上有同类结果，你不说，地球上的中国人也许也不知 道，但一旦被识破，你死定了。 11、如果是捕捉科研前沿性的课题，最好设计周密，尤其是目的和结果的一致性、可获得 性和可预期性，通过课题实施所获得的结果必须能充分支持与研究目标相一致的结论。 12、热点课题不一定是好课题，热点上的人也很热。但在还没热起来的热点，一定是一个 好课题，标书评审滞后半年呢，比如最开始的一批SARS课题。有时也不防设计一些非热点 但是对与科研有价值的课题，发挥出奇不意的效果。 13、临床课题可以是当前没有好办法治疗的疾病，急需解决的临床问题，而在国际上检索 的文献只有几篇的那种。 14、本人不主张以最新的重量级文献做指导，你会发现，很多人跟你的想法惊人的一致。 有人特别反对跟风。
2020国家自然科学基金标书模板
报告正文 参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。请勿删除或改动下述提纲标题及括号中的文字。 （一）立项依据与研究内容（建议8000字以内）： 1．项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）； 2．项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题（此部分为重点阐述内容）； 3．拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）； 4．本项目的特色与创新之处； 5．年度研究计划及预期研究结果（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）。 （二）研究基础与工作条件 1．研究基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）； 2．工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门重点实验室等研究基地的计划与落实情况）； 3．正在承担的与本项目相关的科研项目情况（申请人正在承担的与本项目相关的科研项目情况，包括国家自然科学基金的项目和国
家其他科技计划项目，要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）； 4．完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）。 （三）其他需要说明的问题 1. 申请人同年申请不同类型的国家自然科学基金项目情况（列明同年申请的其他项目的项目类型、项目名称信息，并说明与本项目之间的区别与联系）。 2. 具有高级专业技术职务（职称）的申请人是否存在同年申请或者参与申请国家自然科学基金项目的单位不一致的情况；如存在上述情况，列明所涉及人员的姓名，申请或参与申请的其他项目的项目类型、项目名称、单位名称、上述人员在该项目中是申请人还是参与者，并说明单位不一致原因。 3. 具有高级专业技术职务（职称）的申请人是否存在与正在承担的国家自然科学基金项目的单位不一致的情况；如存在上述情况，列明所涉及人员的姓名，正在承担项目的批准号、项目类型、项目名称、单位名称、起止年月，并说明单位不一致原因。 4. 其他。