土壤DNA 纯化难点——腐殖质
土壤DNA 纯化难点——腐殖质
土壤，是由一层层厚度各异的矿物质成分所组成大自然主体。土壤和母质层的区别表现在于形态、物理特性、化学特性以及矿物学特性等方面。由于地壳、水蒸气、大气和生物圈的相互作用，土层有别于母质层。它是矿物和有机物的混合组成部分，存在着固体，气体和液体状态。疏松的土壤微粒组合起来，形成充满间隙的土壤的形式。这些孔隙中含有溶解溶液（液体）和空气（气体），因此，土壤通常被视为有多种状态。
提取土壤中微生物、动植物遗体等的DNA是在分子水平上研究生态、环境保护与修复及菌种筛选等的基础。土壤的成分包括矿物质、粘土等无机物、植物及植物的遗体、腐殖物质等土壤有机物以及在土壤中存在的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究，从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。
在整个提取的过程中，腐殖质是最大的干扰因素。腐殖质是已死的生物体在土壤中经微生物分解而形成的有机物质，含有植物生长发育所需要的一些元素，能改善土壤，增加肥力。主要方法是帮助增加可以让空气和水进入的空隙，也同样产生植物必须的氮，硫，钾和磷。动植物残体在微生物作用下形成简单化合物的同时又重新合成复杂的高分子化合物。但是由于腐殖物质的性质与DNA十分相似，从土壤中提取的DNA的同时也会将将腐殖质等物质一起纯化，因而采用一般的DNA提取方法很难除去腐殖物质等抑制因子，再加上这些腐殖物质会抑制聚合酶链式反应（PCR）及限制性酶切等，因此，彻底去除腐殖物质等抑制因子是整个操作过程中的重点，也是难点。
目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指将土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，间接法使用的已经很少了。
目前市面上对于去除腐殖质工艺做的最好的试剂盒，就是MPbio公司的土壤DNA提取试剂盒，该试剂盒能够有效去除土壤样本中的腐殖质，极大提高目标DNA的提取浓度，很多土壤相关工作人员都选用该试剂盒。不过优秀的产品也会有短板，MP试剂盒在有效去除腐殖质的过程中难免会造成目标DNA的损失，操作过程略显繁琐，同时作为一个进口的产品，价格因素可以说是该产品最大的短板。
杭州新景生物试剂开发有限公司作为新手福音，业界良心，经过一系列的研究，终于开发了一种高效的去腐殖酸缓冲液，最大限度的去除土壤样本中的腐殖质，保留目标DNA，结合硅胶柱纯化的技术，得到高纯度的土壤微生物DNA。
我们的操作方法和一般的提取土壤DNA试剂盒有所不同，先要进行样本的前处理，将土壤样本经过去腐缓冲液洗涤，然后进行DNA提取得到高纯度且不含腐殖酸的土壤DNA。我们可以将多达500 mg的土壤样本放入含有陶瓷颗粒的2.0 ml试管中，首先使用去腐缓冲液洗涤，离心去上清后使用高效裂解液裂解所有土壤生物，包括之前难以裂解的种类，如真细菌孢子和芽孢、革兰氏阳性菌、酵母、藻类、线虫和真菌。离心后取上清与结合液结合，过硅胶柱进行DNA纯化即可得到高纯度DNA。
实验室将MP的试剂盒和公司的试剂盒做了一个平行实验，验证了新产品的结果。
土壤腐殖质与腐植酸的区别与关系
土壤腐殖质与腐植酸的区别与关系 “土壤腐殖质”。土壤有机质的主要部分。是黑色的无定形的有机胶体。腐殖质是具有酸性、含氮量很高的胶体状的高分子有机化合物。腐殖质在土壤中，在一定条件下缓慢地分解，释放出以氮和硫为主的养分来供给植物吸收，同时放出二氧化碳加强植物的光合作用。 土壤有机质在微生物作用下形成的复杂而较稳定的大分子有机化合物。腐殖质是土壤有机质的主要组成部分，一般占有机质总量的50～70％。腐殖质的主要组成元素为碳、氢、氧、氮、硫、磷等。 腐殖质并非单一的有机化合物，而是在组成、结构及性质上既有共性又有差别的一系列有机化合物的混合物，其中以胡敏酸与富里酸为主。 胡敏酸是一类能溶于碱溶液而被酸溶液所沉淀的腐殖质物质，其分子量比富里酸大，分子组成中各元素的百分含量分别是：C50～60，H2.8～6.6，O 31～40，N2.6～6.0。胡敏酸比富里酸的酸度小，呈微酸性，吸收容量较高，它的一价盐类溶于水，二价和三价盐类不溶于水，这对土壤养分的保持及土壤结构的形成都具有意义。 富里酸是一类既溶于碱溶液又溶于酸溶液的腐殖质物质，其分子量比胡敏酸小，分子组成中各元素的百分含量分别是：C40～52，H4～6，O 40～48，N2～6。富里酸呈强酸性，移动性大，吸收性比胡敏酸低，它的一价、二价、三价盐类均溶于水，因此富里酸对促进矿物的分解和养分的释放具有重要作用。 腐殖质在土壤中可以呈游离的腐殖酸和腐殖酸盐类状态存在，也可以呈凝胶状与矿质粘粒紧密结合，成为重要的胶体物质。腐殖质不仅是土壤养分的主要来源，而且对土壤的物理、化学、生物学性质都有重要影响，是土壤肥力指标之一。 腐植酸（Humic Acid，简写HA） 腐植酸（Humic Acid，简写HA）是动植物遗骸，主要是植物的遗骸，经过微生物的分解和转化，以及一系列的化学过程和积累起来的一类有机物质。它是由芳香族及其多种官能团构成的高分子有机酸，具有良好的生理活性和吸收、络合、交换等功能。它广泛存在于土壤、湖泊、河流、海洋以及泥炭（又称草炭）、褐煤、风化煤中。按自然界分类，它可以分为三类，即土壤腐植酸、水体腐植酸和煤炭腐植酸。九十年代初，用发酵法，通过接种，可提取生化腐植酸或生化黄腐酸等有机酸物质。 我国腐植酸有组织的研究始于五十年代末，主要是从泥炭利用开始的。六十年代，全国掀起了利用腐植酸肥料和改良土壤的热潮，声势很大。真正受到国家重视和推动则是七十年代中期以后。当时，国务院副总理王震同志还亲自抓，国务院先后于1974年和1979年两次以国发110号和200号文件，全面推动了我国腐植酸的综合开发和利用。八十年代，随着全国腐植酸事业的不断发展，国家经贸委于1987年批准成立了“中国腐植酸工业协会”，负责统一组织和协调全国的腐植酸工作。一些腐植酸资源贮量大的省、市，还纳入了政府工作序列，为此专门成立了腐植酸办公室。 我国腐植酸资源非常丰富，它储量大，分布广，品位好。据有关资料统计，有泥炭124．8亿吨，居世界第四位；褐煤1265亿吨，还有大量的风化煤。在利用生物工程方面，进一步筛选优良菌种，加快开发定向菌种，这样，研制生化腐植酸或生化黄腐酸类产品的资源利用就会无穷无尽。
腐殖质的研究
腐殖质的研究 腐殖质是在自然环境中广泛存在的，在微生物作用下而形成的复杂而较稳定的大分子有机化合物。腐殖质是土壤有机质的主要组成部分，一般占有机质总量的50～70％。腐殖质的主要组成元素为碳、氢、氧、氮、硫、磷等。腐殖质并非单一的有机化合物，而是在组成、结构及性质上既有共性又有差别的一系列有机化合物的混合物，根据其性质不同可分为腐殖酸、富里酸和胡敏素，其中以腐殖酸与富里酸为主。腐殖酸是一类能溶于碱溶液而不溶于酸溶液的腐殖质物质，其分子量比富里酸大，分子组成中各元素的百分含量分别是：C50～60，H2.8～6.6，O 31～40，N2.6～6.0。腐殖酸比富里酸的酸度小，呈微酸性，吸收容量较高。富里酸是一类既溶于碱溶液又溶于酸溶液的腐殖质物质，其分子量比腐殖酸小，分子组成中各元素的百分含量分别是：C40～52，H4～6，O 40～48，N2～6。富里酸呈强酸性，移动性大，吸收性比腐殖酸低。这三种级分的腐殖质结构相似，只是分子量、元素含量、官能团等有所差别。其中，腐殖酸含量最高，也是研究最广泛的一类腐殖质。由于腐殖质比表面积大、结构复杂、带有多种活性基团，如羧基、醇羟基、酚羟基、羰基和甲氧基等，其中以羧基和酚羟基最重要,据测定,在pH 5.0时,有80%的Fe3+和强酸性的羧基和酚羟基形成螯合物[1]腐殖质对一些重金属的吸附特性及机理已有不少研究,腐殖酸对金属的氧化态具有还原作用,而且其机理比较复杂[2-4]。铁、锰、铝氧化物与腐殖酸相互作用的主要机理包括阴离子交换、表面配位交换、酚羟基相互作用、熵效应、氢键以及阳离子键桥等多个方面,其中铁、锰、铝氧化物表面羟基与有机质(如胡敏酸)之间的配位交换机理已被许多学者认同。 本论文研究了所提取的腐殖酸与金属离子的相互作用，并采用透析的方法在真空手套箱中测定了Fe(Ⅱ，Ⅲ)元素在不同pH、不同浓度下与腐殖酸的络合常数，之后又研究了HA与菱铁矿、黄铁矿、Fe2O3的吸附作用。最后则在HA中加入大量FeSO4形成沉淀，进一步处理后用穆斯堡尔仪器检测了与腐殖酸络合的铁离子的存在形态。 穆斯堡尔谱学是在核下射线无反冲共振吸收效应基础上发展起来的一门谱学。穆斯堡尔效应为下射线发射和吸收能够以无反冲方式发生,共振线非常窄,能直接的分辨超精细相互作用。穆斯堡尔效应自1957年德国年轻的物理学工作者
土壤修复改良项目可行性研究报告
土壤修复改良项目可行性 研究报告 1、建设内容........................... 2、项目建设的必要性................... 3、项目建设主要效益................... 4、公司简介........................... 5、项目建设规划及技术支持............. 6、项目负责任务分工及管理、保障机制... 7、申请省级财政补助主要用途........... 8、预期建设任务及安排.................
一、建设内容 针对长期以来严重影响耕地质量的农业废弃物资源化利用、无害化处理水平不高，化学投入品使用不科学、不规范，土壤有机质含量降低、土传病害加重等突出问题，以保障农业生产安全、农产品质量安全和农业生态环境安全为目标，组织实施土壤修复改良和农药残留治理工程。本项目根据当地农业发展水平和经济、资源状况，在加强基础设施、投入要素、农业科技和经营管理体制等方面建设基础上，采取综合有力的措施提升土壤品质，这为种植优质绿色无公害农产品打下了坚实的基础。 二、项目建设的必要性 1、有利于当地的环境保护 目前农用地的土壤被重金属污染及农药残留污染。通过项目的实施，能够有效改善土壤重金属污染状况，从根本上消除重金属和农药残留污染。在改良基地上种植出来的农作物品质优良、产量高、是优质的有机食品。因此，项目的建设对保护当地的生态环境都有重要意义。 2、有利于促进食品安全
按规定：食品安全，指食品无毒、无害，符合应当有的营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或者慢性危害。通过项目的实施，能够显著改善项目地土壤重金属污染现状，可以直接将农产品重金属污染控制在国内最低限量。因此，项目的建设能够从源头上促进农产品质量的安全性。 三、项目建设主要效益 一、经济效益 预计建设实施一年后，土地利用率在流转前的基础上提高了30%；保证了项目区生产条件和整体生产能力，有效提高土壤肥沃能力、土地利用率，达到增产增收亩地，带动推广周边农户经济发展。 二、生态效益 项目建设和实施后， 项目致力于通过有机药肥和物理措施防控病虫害，大大减少了农药、化肥的使用量，最大限度降低了农业污染。在生态循环种养模式下，各种农业废弃物均可以变废为宝，得到充分回收和循环利用，不对自然环境造成任何污染，为促进农业生态环境良性循环和可持续发展起到了积极作用。 三、社会效益
不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号
学校代码学号分类号密级 本科毕业论文 学院、系环境与资源学院 专业名称环境科学 年级2010级 学生姓名 指导教师 2014年5月
不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较 摘要 环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化
Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification
土壤腐殖质组成测定
土壤腐殖质组成测定 土壤腐殖质事土壤有机质的主要成分。一般来说，它主要是由胡敏酸（HA)和富里酸（FA)所组成。不同的土壤类型，其HA/FA比值有所不同。同时这个比值与土壤肥力也有一定关系。因此，测定土壤腐殖质组成对于鉴别土壤类型和了解土壤肥力均有重要意义。 实验方法：用0.1M焦磷酸钠和0.1M氢氧化钠混合液处理土壤，能将土壤中难溶于水和易溶于水的结合态腐殖质络合成溶于水的腐殖质钠盐，从而比较完全的将腐殖质提取出来。 实验操作步骤： 1、称取0.25mm相当于2.50g烘干重的风干土样，置于250ml三角瓶中，用移液管准确加入0.1M焦磷酸和0.1M氢氧化钠混合液50.00ml，震荡5分钟，塞上橡皮套，然后静置13——14小时（控制温度在20℃左右），旋即摇匀进行过滤，收集滤液（一定要清亮）。 2、胡敏酸和富里酸总碳量的测定 吸取滤液5.00ml，移入150毫升三角瓶中，加3mol／L H2SO4约五滴（调节ph为7）至溶液出现浑浊为止，置于水浴锅上蒸干。加0.8000mol／L（1／6K2Cr2O7）标准液5.00ml，用注射筒迅速注入浓硫酸5ml，盖上小漏斗，在沸水浴上加热15分钟，冷却后加蒸馏水50ml稀释，加邻啡罗林指示剂3滴，用0.1mol∕L硫酸亚铁滴定，同时作空白实验。 3、胡敏酸量测定 吸取上述滤液20.00ml于小烧杯中，置于沸水浴上加热，在玻璃搅拌下滴加3mol∕L H2SO4酸化（约30滴），至有絮状沉淀析出为止，继续加热10分钟使胡敏酸完全沉淀。过滤，以0.01mol∕L H2SO4洗涤滤纸和沉淀，洗至滤液无色为止（即富里酸完全洗去）。以热的0.02mol∕L NaOH溶解沉淀，溶解液收集于150ml三角瓶中（切忌溶解液损失），如前法酸化，蒸干，测碳。（此时的土样重量w相当于1g） 结果计算： 1、腐殖质总碳量（%）= [ 0.8000*5.00*（V0-V1 ）*0.003/V0 ]*100/W 式中：V0--5.00毫升标准重铬酸钾溶液空白实验滴定的硫酸亚铁毫 升数。 V1--待测液滴定用去的硫酸亚铁毫升数 w--吸取滤液相当的土样重（g） 5----空白所用K2Cr2O7毫升数
生态修复施工的方案设计
施工方案报审表
六盘水大河经济开发区天湖景观大道及德湖景观大道建设工程 边 坡 生 态 修 复 施 工 方 案 编制单位：深圳市铁汉生态环境股份有限公司 编制人：
审核人： 审批人： 编制日期： 六盘水大河经济开发区天湖景观大道及德湖景观大道建设工程 边坡生态修复施工方案 一、项目概况 1.工程名称 六盘水大河经济开发区天湖景观大道建设工程及附属配套项目 2.工程概况 本工程位于天湖景观大道两侧沿线边坡，地处六盘水大河经济开发区核心区，起讫桩号K0+000～K7+251,道路全长7.251km,天湖景观大道为城市线，在K3+116～K7+251处与育德路平交，工程边坡总面为236701㎡，其中路堑边坡主要类型为土石混合边坡、岩质边坡、土质边坡，主要边坡支护方式有人字骨架护坡、框架梁边护坡等；路基边坡主要类型为土石混合型，主要边坡支护方式为拱形骨架护坡、浆砌石护坡。 二、绿化施工工艺 (一）生态袋+挂网客土喷播（单层网）要求 1.施工工序流程 生态袋+挂网客土喷播（单层网）施工工艺流程为：边坡检验→种植土及喷播基材配置→种植土装袋→打设锚杆→挂生态袋→挂网→喷射基材→喷播种子→铺设无纺布→养护管理 1.2施工 （1）生态袋码砌： a.施工准备：做好人员、机具、材料的准备 b.清理：清除框架内的杂物与积水 c.生态袋填充：将基质材料填装入生态袋内，采用专用绑扎带封口，封口时将袋口收缩，用专用绑扎带绕端口两圈，再用力锁紧即可。 堆叠码放：框架内的生态袋堆叠要呈品字型，填充后生态袋要求摆放平整， d. 扣子扣入生态袋，达到连接良好的程度。 （2）挂网客土喷播： a.打锚杆、挂网 用气压钻或电钻在喷砼坡面或框架上打孔，将铁丝网或三维网沿坡面顺势铺下，铺设时应拉紧网，铺整顺后用锚杆自上至下固定。铁丝网规格为6.5cm×6.5cm，Φ=0.2cm。主锚杆锚固长度 50～80cm，辅锚杆锚固长度30～50cm，主锚杆选用
磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒
磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C； 【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】 【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至 液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用； 【产品简介】 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液
体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。 【试剂盒说明】 【自备仪器、耗材和试剂】 手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。 手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强 磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。 【手动普通版】 本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物 称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K， 涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。 注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液 室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合 转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离 将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管
土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述
土壤腐殖质的提取、分离与纯化综述 大车神 [摘要] 腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中， 根据溶解性，腐殖质可分为3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA， 又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶) 殖酸、富里酸广泛存在于土壤、水体以及沉积物中，对有金属离子、机污染物、及水处理过程中消毒副产物的形成有重要的影响。本文通过查阅文献，总结目前学者对于腐殖酸的提取、分离与纯化的相关技术进行阐述。 【关键词】腐殖酸、富里酸、胡敏酸、胡敏素、分离提纯 一、概述 土壤是人类赖以生存的物质基础,是人类不可缺少、不可再生的自然资源[1,2]。土壤有机质是土壤的重要组成部分,在土壤肥力、环境保护、农业可持续发展等方面都具有重要作用。其主要成分包括有机质及其他有机物，其中腐殖质类物质占有机质总量的85%～95%。腐殖质（humic substances; HS）是一类呈棕黑色或棕褐色、无定形、酸性、亲水性、多分散的有机物质，广泛存在于土壤、水体(如河流、湖泊、海洋和地下水等)以及沉积物中[3]。根据溶解性，腐殖质可分为 3类：腐殖酸(HA,又称胡敏酸，只溶于碱不溶于酸)，富里酸(FA，又称黄腐酸，既溶于酸又溶于碱)和胡敏素(Humin，又称腐殖素、腐黑物，酸碱都不溶)[4,5]，其中可提取腐殖质(HA+ FA)组成复杂，存在氨基、羟基、醌基、羰基和甲氧基等多种基团，能够对水体中各种机污染物和重金属的迁移转化进行影响和控制[6-8]。 富里酸( Fulvicacid，简称 FA)属于腐植酸的一种，别名为黄腐殖酸，是土壤腐植质的组成成分之一。颜色较浅，多呈黄色。主要由碳、氢、氧和氮等元素 构成，碳氢比值较低，分子式为C 14H 12 O 8 [9,10]。溶解能力强，移动性大，对某些土 壤的淋溶和沉积起很大作用，可以改善土壤环境。特性为低分子量和高生物活性。由于低分子量的特性，它能很好的粘贴及融合矿物质和元素到它的分子结构中，拥有很好的溶解性和流动性。 胡敏酸（Humic Acid，HA），由芳香核和脂肪族侧链组成，含有羧基、羟基、
土壤DNA提取
1 试验材料 吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品 电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、 电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、 异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。 主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。
腐殖质
【百科】腐殖质（英文称Humus)定义：已死的生物体在土壤中经微生物分解而形成的有机物质。是土壤有机质在微生物作用下形成的复杂而较稳定的大分子有机化合物。腐殖质是土壤有机质的主要组成部分，一般占有机质总量的50～70%。腐殖质的主要组成元素为碳、氢、氧、氮、硫、磷等。腐殖质并非单一的有机化合物，而是在组成、结构及性质上既有共性又有差别的一系列有机化合物的混合物，其中以胡敏酸与富里酸为主。 腐殖质虽是较稳定的化合物，但可被缓慢的分解，为植物生长提供有效的养分。其分解速度与温度、湿度和通气状况等因素密切相关。陆地生态系统中，通常纬度高、湿度小的地区，分解速度就越慢，有利于有机物的积累。如，热带稀树草原的分解速率比温带草原快得多，一般看不到凋落层，土壤中也很少有腐殖质的积累。（夏老师例说生态学几则疑点) 罗吧“动物粪便和动植物遗体残骸,经过细菌、真菌的分解而变为土壤中的腐殖质，使土壤更肥沃，为植物根系的发育提供各种营养物质”教材中的这段话没有错。 腐殖质的形成一定是要经分解者的作用。但是分解者的分解作用是有强有弱之分，太强了就无法形成腐殖质的中间产物状态，而是直接形成水、二氧化碳和无机盐。 1、动物粪便和动植物遗体残骸—→腐殖质→水、二氧化碳和无机盐。 2、动物粪便和动植物遗体残骸—→水、二氧化碳和无机盐。 分解者的分解作用的强弱又与水分和温度两个条件十分密切，必需两者都适应才能发挥最佳效果。 土壤有机质通过微生物作用形成复杂、较稳定的大分子有机化合物——腐殖质的过程。基本上分为两个阶段，第一阶段产生构成腐殖质主要成分的原始材料，即由各种形态和状态的有机物质组成的混合物，在微生物作用下分解为各种简单的化合物；第二阶段为合成阶段，即由微生物为主导的生化过程，将原始材料合成腐殖质的单体分子，进而再通过聚合作用形成不同分子量的复杂环状化合物。
土壤腐殖质测定报告 - 副本
摘要：实验对比分析黄土高原地区3种土地利用方式下（连作麦地、10年果园和20年果园）土壤中有机碳(TOC)、腐殖质组成特点。实验采用方法主要为重铬酸钾外加热法进行测定。结果表明:TOC平均含量为10.34g/kg。其中麦地TOC含量最高,平均值为10.74 g/kg,其次是20m年果园TOC平均值为10.26 g/kg,最后为10年果园，TOC含量平均值为10.01g/kg。同土地利用方式土壤腐殖质组成含量均为:胡敏酸碳<富里酸碳<胡敏素碳,胡敏素碳占TOC总量的比例为71%,腐殖酸碳占TOC总量的比例为29%。麦地、10年果园、20年果园的腐殖酸总碳量(胡敏酸碳与富里酸碳之和)含量分别为3.3、2.75、2.78g/kg。几种土地利用方式的土壤腐殖酸碳占土壤TOC总量的比例为麦地最高,依次为20年果园、10年果园。胡敏酸碳含量为:麦地>20年果园>10年果园;富里酸碳含量为:麦地>10年果园>20年果园。麦地、10年果园、20年果园的H/F比值分别为0.63、0.50、0.54。不同土地利用方式土壤TOC含量以及组成的差异与土壤环境特点、输入土壤的有机质性质以及人为耕作管理活动等有关. 0.引言 土壤腐殖质作为土壤有机质的主体,是土壤发生过程的产物,又是土壤发生过程的动力之一。土壤中的腐殖质多是与矿质部分结合形成的有机无机复合胶体,它是土壤中比较活跃的组成部分,对土壤结构的形成、土壤水分和养分的保持与供应都有重要影响等。研究认为,可用腐殖质指数来快速评估有机质的积累、土壤酸碱性和土壤生物活性。在由温室效应造成的全球变暖等环境问题的压力下,人们不仅希望通过增加土壤腐殖质的含量来改善土壤肥力,更希望能够固定更多大气中的CO2。本实验通过对比分析麦地、10年苹果园、20年苹果园几种土地利用类型中土壤有机碳、腐殖质组成及不同生长年限碳积累的差异，为进一步深入开展黄土高原地区土地利用变化影响土壤有机碳的研究和准确评价我国土地利用变化对土壤碳库的影响提供一些依据，为农民种植提供指导。 1 材料与方法 1.1 研究地区概况 研究区域选择在典型的黄土高原沟壑区长武塬，位于黄土高原中南部陕甘交界处，塬区平均海拔1200m，属温带半湿润大陆性季风气候区。塬区降水年内年际变化较大，多年平均降水量582mm。光照条件充足，年日照时数2230小时，日照率51%，年均辐射量为4837KJ/cm2，无霜期171天，年均气温9.1℃，≥10℃活动积温3029℃。塬区无灌溉条件，属典型的雨养农业区。黄土区土层深厚，
污染土壤修复工程技术标
技术方案 投标人：（盖单位公章）法定代表人或其委托代理人：（签字） 年月日
目录 一、污染土壤治理修复方案 (5) 1、项目概况 (5) 1.1 项目背景 (5) 1.2 前期情况回顾 (6) 1.3场地水文地质环境概况 (8) 1.4交通及处置场地供水供电 (9) 1.5现场目前情况 (9) 2、污染场地修复技术方案 (11) 2.1修复目标值的选择 (11) 2.2修复范围及修复量的确定 (12) 2.3修复技术介绍 (14) 3、现场施工方案 (24) 3.1污染范围界定与场地测量 (24) 3.2临时设施建设方案 (26) 3.3污染场地原位修复现场施工方案 (29) 3.4污染土壤异位修复现场施工方案 (33) 4、现场废水处置方案 (42) 4.1现场洗车废水处置方案 (42) 4.2原有废水池处置方案 (46)
4.3渗滤液收集池废水处置方案 (48) 5、建筑污染解毒方案 (49) 5.1建筑物解毒区域及工程量 (49) 5.2建筑物解毒流程 (49) 6、危险废物处置方案 (52) 6.1 场内危险废物及工程量 (52) 6.2 危险废物的处置流程 (52) 6.3 危险废物处置流程及处置单位 (54) 7、污染土壤处置及场地修复方案 (55) 7.1污染土壤处置接收场介绍 (55) 7.2污染土壤修复前的处理 (56) 7.3污染土壤处置工艺流程 (57) 7.4场地修复方案 (58) 8、工程组织及工程安排 (61) 8．1项目工程组织 (61) 8.2工程进度安排 (62) 8.3 主要机械及施工材料准备 (63) 8.4规章制度 (64) 8.5 安全教育及技能培训 (64) 8.6劳动、安全、卫生防护 (65) 9、合理化建议 (68) 10、施工防控措施 (69)
土壤总DNA的几种提取方法
土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤： 取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3） 称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。 冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4） 取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻
土壤DNA 纯化难点——腐殖质
土壤DNA 纯化难点——腐殖质 土壤，是由一层层厚度各异的矿物质成分所组成大自然主体。土壤和母质层的区别表现在于形态、物理特性、化学特性以及矿物学特性等方面。由于地壳、水蒸气、大气和生物圈的相互作用，土层有别于母质层。它是矿物和有机物的混合组成部分，存在着固体，气体和液体状态。疏松的土壤微粒组合起来，形成充满间隙的土壤的形式。这些孔隙中含有溶解溶液（液体）和空气（气体），因此，土壤通常被视为有多种状态。 提取土壤中微生物、动植物遗体等的DNA是在分子水平上研究生态、环境保护与修复及菌种筛选等的基础。土壤的成分包括矿物质、粘土等无机物、植物及植物的遗体、腐殖物质等土壤有机物以及在土壤中存在的微生物，其中绝大部分的微生物都是无法直接培养进行繁殖和研究，从土壤样品中提取DNA是研究土壤微生物最为有效的方法。 在整个提取的过程中，腐殖质是最大的干扰因素。腐殖质是已死的生物体在土壤中经微生物分解而形成的有机物质，含有植物生长发育所需要的一些元素，能改善土壤，增加肥力。主要方法是帮助增加可以让空气和水进入的空隙，也同样产生植物必须的氮，硫，钾和磷。动植物残体在微生物作用下形成简单化合物的同时又重新合成复杂的高分子化合物。但是由于腐殖物质的性质与DNA十分相似，从土壤中提取的DNA的同时也会将将腐殖质等物质一起纯化，因而采用一般的DNA提取方法很难除去腐殖物质等抑制因子，再加上这些腐殖物质会抑制聚合酶链式反应（PCR）及限制性酶切等，因此，彻底去除腐殖物质等抑制因子是整个操作过程中的重点，也是难点。 目前从土壤样品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和间接法。直接法是指将土壤样品放在裂解液中，经过有效的破壁方法使微生物的DNA全部释放到裂解液中，然后再进行分离提取的方法。间接法是指将土壤放在一种的缓冲液中，如Buffer PBS等，把微生物从土壤中分离出来，然后再进行DNA的提取。间接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金属盐对DNA提取带来的影响，但是这种方法会丢失许多微生物，得到的DNA并非土壤样品中的全基因组(宏基因组)，间接法使用的已经很少了。 目前市面上对于去除腐殖质工艺做的最好的试剂盒，就是MPbio公司的土壤DNA提取试剂盒，该试剂盒能够有效去除土壤样本中的腐殖质，极大提高目标DNA的提取浓度，很多土壤相关工作人员都选用该试剂盒。不过优秀的产品也会有短板，MP试剂盒在有效去除腐殖质的过程中难免会造成目标DNA的损失，操作过程略显繁琐，同时作为一个进口的产品，价格因素可以说是该产品最大的短板。 杭州新景生物试剂开发有限公司作为新手福音，业界良心，经过一系列的研究，终于开发了一种高效的去腐殖酸缓冲液，最大限度的去除土壤样本中的腐殖质，保留目标DNA，结合硅胶柱纯化的技术，得到高纯度的土壤微生物DNA。 我们的操作方法和一般的提取土壤DNA试剂盒有所不同，先要进行样本的前处理，将土壤样本经过去腐缓冲液洗涤，然后进行DNA提取得到高纯度且不含腐殖酸的土壤DNA。我们可以将多达500 mg的土壤样本放入含有陶瓷颗粒的2.0 ml试管中，首先使用去腐缓冲液洗涤，离心去上清后使用高效裂解液裂解所有土壤生物，包括之前难以裂解的种类，如真细菌孢子和芽孢、革兰氏阳性菌、酵母、藻类、线虫和真菌。离心后取上清与结合液结合，过硅胶柱进行DNA纯化即可得到高纯度DNA。 实验室将MP的试剂盒和公司的试剂盒做了一个平行实验，验证了新产品的结果。
土壤修复方案(1)(完整版)
湿地公园土壤修复方案
一、土壤背景资料 1、土壤及降雨蒸发量本底数据 据xx省林业设计研究院总体规划数据显示，xx国家湿地公园内表层土壤类型不多，主要发育着黑土、黑钙土、草甸土等几个土类。 黑土：平均有机质含量 4.81%，pH为7.2，呈微碱性。全氮0.17-0.27%、全磷0.12-0.16%、全钾1.7-2.9%，属于潜在肥力最高的土壤，但在湿地公园中分布面积不大。 黑钙土：有机质含量为3.28-3.89%，pH为8.2，在湿地公园中分布面积较大。 草甸土：有机质含量很低，为2-3.2%左右。水的矿化度较高，土壤盐碱化逐年加重，在湿地公园中分布面积最大。 全年平均降水量约为448mm，主要集中在6-8月，占全年降水量的60％以上，年平均蒸发量1638.1mm，5-7月蒸发量最高，约占全年蒸发量的1/3。 据xx农技推广站2011年文章《xx市土壤养分状况与测土配方施肥技术》数据显示，本地区土壤pH值为6.9～8.5，有机质为2.5～3.03%，速效氮123～144，速效磷17.1～32.6，速效钾为95.6～233（1984至2010年调查数据）。 以上本底数据表明该地区农田表土及园区内原有表层土基本理
化性质满足一般绿化种植要求，若将园区内该种理化性质的表土开挖后加以保护，可基本满足日后的绿化需求。 2、xx湿地公园人工山体土壤本底调查 2015年6月25日，在xx的带领下，我公司在该湿地公园进行了基本情况的摸底，实际采集土壤样品6个进行检测分析。土壤样品1～6号分别由山顶至山脚，采样深度30cm，约每10m高度采集一个混合样品（每个样品为5个以上采样点混合至最终不少于500g）。检测结果如下： 样号样品源PH EC mS/cm 有机质 % 全盐 量 g/kg 速效氮 mg/kg 速效磷 mg/kg 速效钾 mg/kg 土样 1 ＞40m山体9.5 0.321 0.48 2 1.42 7.0 3 4.60 84.58 2 30-40m山体9.6 0.329 0.44 3 1.40 13.68 5.02 85.05 3 20-30m山体9.8 0.299 0.550 1.39 15.21 6.41 123.99 4 10-20m山体9.8 0.33 5 0.564 1.44 14.25 6.70 100.71 5 0-10m山体9.8 0.341 0.498 1.50 15.80 6.34 91.91 6 山脚10.2 0.598 0.304 2.43 13.94 7.44 81.25 一般种植要求* 5.5～ 8.3 0.15～ 1.2 ≥1.2 ≤ 1.0* ≥40 ≥8 ≥60 注*：盐碱地耐盐植物土壤全盐量要求≤1.8 g/kg *根据住建部CJ/T 340-2011 绿化种植土壤《绿化种植土壤》标准 所测人工山体土壤碱性较为严重，EC值处于合理范围，土壤有 机质、速效氮及速效磷较为匮乏，速效钾不缺。山体自上而下的盐分、碱性呈加重趋势。与林业设计院土壤本底调查及肇东农技推广站文章中土壤调查土壤结果差距较大的原因主要有以下两点： A．xx地区位于xx平原东部地区，属于世界三大片苏打盐碱土集
湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术
微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.wendangku.net/doc/1218481643.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.wendangku.net/doc/1218481643.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。 关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分 析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树