博日PCR

PCR相关知识

1.半定量RT-PCR（实验室所做的普通PCR）与荧光定量Real-time PCR 最大的区别就在于semi-PCR需要跑电泳根据条带亮度的强弱来 判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低而Real-Time PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低。 所以由上可见semi-PCR不如Real-Time PCR精确。 至于RT 应该指Reverse Transcription。 为了便于区分我们更偏好使用qPCR来特指Real-Time PCR 但要注意REALTIME-PCR的定性问题，有时候你扩增出来的很有可能只是引物二聚体。所以要利用MELTING CURVE，如果是第一次做一个目的基因的REALTIME-PCR，还是要在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，以确定与你要扩增的目的基因大小一致。 RT-pcr 只能通过模板pcr后扩增的结果间接的反应初始模板的量。而realtime-pcr的结果直接可以看到初始模板的量。所以，realitime-pcr更精确些。 半定量反转录－聚合酶链反应（semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR）是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以

推测样品中特异mRNA的相对数量。以半定量RT-PCR为基础建立起来的mRNA含量测定技术，较含内标化的RT-PCR定量测定的mRNA的方法更为简便可行。 这种方法不另设‘内标准',排除了俩对不同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。 步骤： 1.抽提RNA， 2.反转录获得cDNA， 3.以cDNA为模板做PCR 注意： 步骤1，RNA抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和GAPDH俩中。步骤3，半定量RT-PCR应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！ 2.在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer(实验室用这种方法)；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。 如果用c方法，那么要去哪里查它的序列呢？https://www.wendangku.net/doc/172704500.html,

中国医疗器械最具投标实力供应商揭晓附名单

日前，由中国名企排行网、中国采购与招标网共同举办的 国医疗器械招标采购暨最具投标实力供应商评价活动在京圆满落幕。 着公正透明、公共利益至上的原则，经过初选、复审、网上投票及综合 评分，最终从近 400家报名企业中评选出了 160 家国内医疗器械行业各 产品类别最具投标实力供应商。 本次评选奖项设置和榜单如下： 2010 最具投标实力超声医疗设备 供应商五十强， 2010 最具投标实力医用磁共振品牌供应商二十强， 2010 最具投标实力医用 X 射线品牌供应商三十强，2010最具投标实力临床 检验分析仪器品牌供应商五十强， 2010最具投标实力手术室、急救室、 诊疗室设备及器具品牌供应商三十强， 2010 十大医疗设备品牌供应商 分类榜单， 2010 中国医疗器械诚信与服务最佳投标企业等。具体获奖 企业名单请登录中国名企排行网查阅，网址为 据主办方介绍， 此次评选活动与去年第一次评选最大区别在于， 专 门听取了政府采购中心、 医院及科研院所采购人、 行业专家等方面的意 见和建议， 根据不同产品类别、 区域等特点， 科学审慎评出最佳候选投 标人，从而对接招标采购业务， 充分满足政府集中采购及医院方面的实 际需求。 据了解， 评价活动历时三个月， 对参与评选的企业严格按照国家相 关要求设定入选“门槛” ，评价指标全部量化，评价专家高度保密。参 评企业不仅要具有良好的经营业绩和商业信誉， 而且实行重大质量安全 事故及违法违规一票否决制。 部分获奖企业在接受米访时说， 这种评选活动非常有意义， 不仅展 示了医疗器械企业的综合实力和品牌形象， 而且为我们快捷搭建了通往 政府采购招标和目标用户的桥梁。 还有参评企业负责人说，评价活动与 招标采购有效对接可以加快优胜劣汰和行业整合， 促进医疗设备产业结 构优化升级，为我国医疗器械产业做大做强起到积极引导和重要推动作 用。（青牛/文） 2010 中国医疗器械最具投标实力供应商在京揭晓 2010 中

普通PCR设计引物应遵循以下原则

普通P C R设计引物应 遵循以下原则 -CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN

一设计引物应遵循以下原则 1 、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 2 、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3 、引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC 含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃，设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。 4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6 、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。 7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 8 、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR 体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。 9 、设计软件：最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. 二引物保存 定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在 -20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。 三各种PCR的引物设计 1、长距离PCR： 标准PCR的扩增长度在1～2kb间，不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距离PCR。其引物设计原则在标准PCR的基础上还要注意一下几点:

PCR扩增原理及操作

PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，

医疗设备公司排名

检验设备公司排名：排 排名名公公司名称司名称 销售额 总资产 利润 三项综合得 分 三项综合得 分 注册资金 经营年限 年上缴税金 三项综合得分 金 经营年限 年上缴税金 三项综合得分 加减分 公示得票 两项综合得 分 评价 总得分 1深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司5542262921072 2东芝医疗系统（中国）有限公司457.52802841021.5 3天津九安医疗电子股份有限公司540240195975 4沈阳东软医疗系统有限公司529.5140272941.5 5无锡市欧普兰科技有限公司525194213932 6南京普朗医用设备有限公司417.5191290898.5 7长春迪瑞实业有限公司535.5116246897.5 8桂林优利特医疗电子销售有限公司487.5131.9277896.4 9重庆天海医疗设备有限公司550.5159.5179889 10江西特康科技有限公司408206266880 11长沙爱威科技实业有限公司487.5147244878.5 12上海迅达医疗仪器有限公司430.5138299867.5 13长春市曼特诺医疗器械有限公司483219163865 14深圳市康立高科技有限公司552142170864 15深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司501159189849 16重庆西山科技有限公司447233162842 17希森美康医用电子（上海）有限公司454.5200186840.5 18深圳市恩普电子技术有限公司445.5198193836.5 19英科新创（厦门）科技有限公司496.5189146831.5 20华美生物工程有限公司510159160829 21山东高密彩虹分析仪器有限公司435223.5170828.5 22深圳匹基生物工程有限公司508.5163155826.5 23中生北控生物科技股份有限公司516153.5149818.5 24深圳市雷杜电子有限公司480165.5170815.5 25深圳市锦瑞电子有限公司442.5101268811.5 26深圳市希莱恒医用电子有限公司435188.5186809.5 27艾康生物技术（杭州）有限公司483143.5180806.5 28江苏奥迪康医学科技有限公司402204.5198804.5 29中山大学达安基因股份有限公司426214154794

PCR基本原理及方法_图文.

Medical Molecular Biology Principle and Applications of PCR （Polymerase Chain Reaction） Department of Biochemistry and Molecular Biology 1 Contents History of PCR Concept and principle of PCR PCR reaction system Types and Applications of PCR 2 Replication Substances Involved in DNA replication and Functions substrate (底物: 4 dNTP。合成新链的原料。 template (模板: 解开成单链的DNA母链。指引dNTP按碱基互补配对原则合成新链。 primer (引物: 一段寡核苷酸序列。提供3′-OH末端使dNTP 可以依次聚合。 polymerase (聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶( DNA-pol Other enzymes & protein factors： Helicase, Topoisomerase：解链解旋，防止打结。 SSB （单链DNA结合蛋白）：稳定已解开的单链。 Primase：催化RNA引物生成。DNA ligase：连接两段相邻的岡崎片段。 4 一、History of PCR 1、Khorana(1971等提出在体外经DNA变性,与适当引物 杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 2、1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 3、1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR 技术。 4、1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 5

杭州朗鹰科技有限公司_中标190924

招标投标企业报告杭州朗鹰科技有限公司

本报告于 2019年9月24日 生成 您所看到的报告内容为截至该时间点该公司的数据快照 目录 1. 基本信息：工商信息 2. 招投标情况：中标/投标数量、中标/投标情况、中标/投标行业分布、参与投标 的甲方排名、合作甲方排名 3. 股东及出资信息 4. 风险信息：经营异常、股权出资、动产抵押、税务信息、行政处罚 5. 企业信息：工程人员、企业资质 * 敬启者：本报告内容是中国比地招标网接收您的委托，查询公开信息所得结果。中国比地招标网不对该查询结果的全面、准确、真实性负责。本报告应仅为您的决策提供参考。

一、基本信息 1. 工商信息 企业名称：杭州朗鹰科技有限公司统一社会信用代码：913301055802739012工商注册号：/组织机构代码：580273901 法定代表人：周爱香成立日期：2011-08-22 企业类型：有限责任公司(自然人投资或控股)经营状态：存续 注册资本：200万人民币 注册地址：浙江省杭州市西湖区转塘街道金街美地商业中心5号楼701室(杭州中微商务秘书有限公司托管26） 营业期限：2011-08-22 至 2031-08-21 营业范围：服务：计算机软硬件、网络的技术开发、技术服务；销售（网上销售）：计算机软硬件、通讯设备、多媒体设备、广播设备、音响设备、安防设备、LED显示屏、教学设备、电子产品（除电子出版物）、办公用品；其他无需报经审批的一切合法项目。 联系电话：*********** 二、招投标分析 2.1 中标/投标数量 企业中标/投标数： 个 （数据统计时间：2017年至报告生成时间） 24

pcr实验原理及注意事项

PCR疑难解答 当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 将PCR反应的试管与反应板紧贴。 当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml 的PCR管中不能均匀传热。 不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。 没有扩增产物： 在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。 检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 检查模板和引物的用量。 增加循环次数和/或模板DNA的用量。 泳道中出现模糊条带： 减少循环次数或模板DNA的用量。 提高退火温度，但不要超过68℃。 重新设计引物或设计更长的引物。 其他值得注意的条件： 建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。 最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。 大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。 建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。 基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。 要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。 降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。 变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。 延伸：68--72℃下进行延伸操作。 循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。 长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。 测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

PCR仪的分类

1聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理PCR反应过程与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要简单的多，主要包括DNA靶序列、引物、4种单核苷酸dNTP、耐热DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。PCR反应过程有以下3个步骤：①变性。将反应体系混合物加热到94 ℃，维持较短时间（大约15 s-30 s），使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。②退火。将反应体系冷却至特定的温度（引物的TM值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板引物复合物。③延伸。将反应体系的温度提高到72 ℃并维持一段时间，引物在耐热聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以4种单核苷酸（dNTP）作为底物合成新的DNA链。以上三步作为一个循环重复的进行，每一循环的产物作为下一循环的模板。如此循环数十次，从而使目的基因得到指数级扩增，达到检测或获取基因的目的。 2 PCR仪的分类 根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。 2.1普通PCR仪 一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。 主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。 2.2 梯度PCR仪 一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。真正的梯度，是每一排管都有精确的加热控温探头，2009年为止只有美国ABI公司可以做到。其他的都是从两头的热传递来设计控温。

杭州市十大产业重点企业名单

杭州市十大产业重点企业名单 一、文化创意产业（30家） 1.杭州文化广播电视集团 2.思美传媒股份有限公司 3.杭州宋城旅游发展股份有限公司 4.浙江华策影视股份有限公司 5.杭州嘉德威钢琴有限公司 6.浙江绿城建筑设计有限公司 7.杭州爱华文具有限公司 8.浙江南方建筑设计有限公司 9.浙江华鹰控股集团有限公司 10.杭州日报报业集团有限公司 11.汉鼎信息科技股份有限公司 12.西泠印社拍卖有限公司 13.华数数字电视传媒集团有限公司 14.杭州千岛湖发展有限公司 15.浙江宇天科技股份有限公司 16.浙江中博展览股份有限公司 17.杭州十九楼网络传媒有限公司 18.杭州开源艺术品有限公司 19.杭州畅唐科技有限公司 20.杭州西湖国际博览有限公司 21.杭州搜视网络有限公司 22.杭州文晖投资管理有限公司 23.杭州国阳标识设计制作有限公司 24.杭州瑞德设计有限公司 25.浙江联大汽车网络股份有限公司

26.杭州凸凹工业设计有限公司 27.浙江茗苑旅游规划设计研究中心有限公司 28.杭州天屹三维艺术设计有限公司 29.杭州迅博达数字传媒技术有限公司 30.安赛体育用品（杭州）有限公司 二、旅游休闲产业（30家） 1.浙江省中青国际旅游有限公司 2.浙江省中国旅行社有限公司 3.浙江两岸食品连锁有限公司 4.杭州东方文化园旅业集团有限公司 5.杭州宋城旅游发展股份有限公司 6.杭州海外旅游有限公司 7.杭州市华溥实业有限公司凯悦酒店分公司 8.浙江中山国际旅行社有限责任公司 9.杭州花中城大酒店有限公司 10.杭州开元名都大酒店 11.浙江省中国国际旅行社 12.浙江世贸君澜大饭店 13.浙江哨兵实业有限公司 14.杭州国际旅行社有限公司 15.杭州望湖宾馆有限责任公司 16.浙江金马饭店有限公司 17.杭州假日旅行社有限公司 18.浙江西子宾馆 19.杭州西溪湿地经营管理有限公司 20.杭州之江饭店 21.杭州双溪旅游开发有限公司 22.杭州野生动物世界有限公司 23.杭州佳优子健身服务有限公司 24.杭州湖畔居茶楼 25.杭州新安江旅业发展有限公司 26.杭州王星记扇业有限公司 27.杭州大明山风景旅游有限公司 28.桐庐垂云通天河旅游有限公司 29.杭州市清河坊历史街区管理办公室 30.浙江天目山旅游建设有限公司 三、金融服务业（30家） .中国工商银行股份有限公司浙江省分行营业部 2.中国农业银行股份有限公司浙江省分行营业部 3.中国建设银行浙江省分行 4.广发银行股份有限公司杭州分行

pcr技术原理简介

PCR技术的基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引

几种PCR扩增的比较

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤 普通PCR 1概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 2 PCR原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP（脱氧核糖核苷三磷酸）为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3. PCR反应体系与反应条件 3.1标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶2.5 μl Mg2+ 1.5mmol/L

生殖健康类企业汇总

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PCR原理及过程

PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus 公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 三、实验试剂与器材 模板DNA、L dNTP Taq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物 O 10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH 2 PCR仪、移液枪、PCR板 四、实验步骤 1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液： 模板DNA 2μL 引物1 1μL 引物2 1μL dNTP μL

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤 普通PCR 1概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 2 PCR原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3 PCR反应体系与反应条件 3.1标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA 0.1～2μg

杭州求阙科技有限公司_中标190924

招标投标企业报告杭州求阙科技有限公司

本报告于 2019年9月24日 生成 您所看到的报告内容为截至该时间点该公司的数据快照 目录 1. 基本信息：工商信息 2. 招投标情况：中标/投标数量、中标/投标情况、中标/投标行业分布、参与投标 的甲方排名、合作甲方排名 3. 股东及出资信息 4. 风险信息：经营异常、股权出资、动产抵押、税务信息、行政处罚 5. 企业信息：工程人员、企业资质 * 敬启者：本报告内容是中国比地招标网接收您的委托，查询公开信息所得结果。中国比地招标网不对该查询结果的全面、准确、真实性负责。本报告应仅为您的决策提供参考。

一、基本信息 1. 工商信息 企业名称：杭州求阙科技有限公司统一社会信用代码：91330104MA27W7TL7X 工商注册号：330104*********组织机构代码：MA27W7TL7 法定代表人：许亮成立日期：2015-11-06 企业类型：有限责任公司(自然人投资或控股)经营状态：存续 注册资本：301万人民币 注册地址：杭州市江干区云河家园商铺（临）3号 营业期限：2015-11-06 至 9999-09-09 营业范围：服务：计算机软硬件的技术开发，网络技术开发；批发、零售：建材，家居用品，窗帘，家具，五金交电，纺织品，纱窗，日用百货，电子产品（除电子出版物），工艺品，金属纱窗，隐形纱窗；加工：窗帘。（依法须经批准的项目，经相关部门批准后方可开展经营活动） 联系电话：*********** 二、招投标分析 2.1 中标/投标数量 企业中标/投标数： 个 （数据统计时间：2017年至报告生成时间） 2

PCR技术原理模板

PCR技术原理 PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 一.假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq 酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖

凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。 靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其

普通PCR设计引物应遵循以下原则

一设计引物应遵循以下原则 1 、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 2 、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3 、引物碱基：G C含量以40-60%为宜，G C太少扩增效果不佳，G C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm 值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们. 引物对的Tm差异不超过5℃，设计时温度和GC含量是个主要的参数，做复合扩增时更要设计成相近的温度，而且引物加个尾影响不大。但要切记BLAST，包括查阅文献的引物.如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃, 或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。 4 、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 5 、引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6 、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物5‘端引入酶切位点得黏性末端，随意加入3个保护性碱基，但是要注意不要形成引物二聚体，而且以A或G开头为好。 7 、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。 8 、引物酶切：除非产物非常特异，直接酶切PCR产物效果有时不是很好，还有一般PCR 体系里过量的dNTPs会影响酶切效果。酶切后，可以用标准得乙醇沉淀法沉淀酶切产物，获得高纯度得酶切产物，也即是你的黏性目断片断供后边得试验。 9 、设计软件：最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. 二引物保存 定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。 三各种PCR的引物设计 1、长距离PCR： 标准PCR的扩增长度在1～2kb间，不能满足中大型基因的扩增。在此背景下产生了长距