米诺环素抑制MPP_诱导的PC12细胞凋亡和线粒体功能损伤
细胞凋亡的信号通路
山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007 细胞凋亡的信号通路 谢昆,李兴权 红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199 摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径 中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05 The Signal Pathway of Apoptosis XIE Kun,LI Xing-quan Department of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,China Abstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases. Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway 细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念[1]，随后Paweletz等对其进行了详细的描述[2,3]。在形态学上，凋亡表现为核浓缩、细胞质密度增高、染色质凝聚、核膜破裂、核内DNA断裂、细胞集聚成团、形成凋亡小体(Apoptosome)等特征，这些凋亡小体最终被巨噬细胞清除，但不会引起周围细胞的炎症反应，另外，凋亡发生在单个细胞之间[4,5]。坏死，通常是由相邻的多个细胞之间发生细胞肿胀，细胞核溶解，细胞膜破裂，细胞质流入到细胞间质中，并伴发一系列的炎症反应，从而与凋亡表现为本质性区别[6,7]。 目前认为，凋亡发生的途径分为三种。第一种是线粒体途径，也称为内源性途径，该途径包括两类，第一类需要通过激活Caspase通路促进凋亡，在一序列凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的Cyt C（细胞色素C）释放至细胞质中，从而与Apaf-1(Apoptosis protease activating factor1，凋亡蛋白酶活化因子1)结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子Caspase-9结合形成凋亡小体，凋亡小体激活Caspase-9，从而激活下游的凋亡执行分子Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7等诱导细胞凋亡的级联反应；第二类是不依赖于Caspase途径的，通过线粒体释放AIF（Apoptosis induce factor，凋亡诱导因子）直接诱导凋亡的发生。但是在细胞内，直接检测AIF比较困难，而且AIF的变化不一定能代表凋亡发生的程度，因为引起凋亡发生的途径不一。第二种是死亡受体途径（也称为外源性途径），经由死亡受体（如TNF，Fas等）与FADD的结合而激活Caspase-8和caspase-10，进一步激活凋亡执行者caspase-3,6,7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激（蛋白质错误折叠或未折叠、内质网胁迫）会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活caspase-12，caspase-12进一步激活caspase-9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl-2(B细胞淋巴瘤蛋白)家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[8]。 1凋亡的线粒体途径 在哺乳动物中，由于凋亡的激活需要线粒体中细胞色素C（CytC）的释放，因此CytC由线粒体膜间隙释放到细胞质中的多少可以作为判断凋亡发生强弱的指标之一。有研究认为，CytC的释放是通过Bcl-2家族调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），科学 收稿日期:2013-03-07修回日期:2014-09-11 基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2010ZC151) 作者简介:谢昆(1975-),男,云南富民人,博士研究生,研究方向为动物生物化学与分子生物学.E-mail:xk_biology2@https://www.wendangku.net/doc/129651241.html, 数字优先出版:2015-06-03https://www.wendangku.net/doc/129651241.html,
线粒体与细胞凋亡
万方数据
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线粒体与细胞凋亡 作者：周艺群， 谷志远， ZHOU Yi-qun， GU Zhi-yuan 作者单位：浙江大学医学院附属口腔医院口腔颌面外科,浙江,杭州,310006 刊名： 解剖科学进展 英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2006,12(1) 被引用次数：14次 参考文献(17条) 1.樊廷俊;夏兰;韩贻仁线粒体与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理学报 2001(01) 2.赵云罡;徐建兴线粒体,活性氧和细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(02) 3.蔡循;陈国强;陈竺线粒体跨膜电位与细胞凋亡[期刊论文]-生物化学与生物物理进展 2001(01) 4.Hortelano S;Dallaporte B;Zamzami N Nitric oxide induces apoptosis via triggering mitochondrial permeability transition[外文期刊] 1997(2-3) 5.Marchetti P;Hirsch T;Zamzami N Mitochondrial permeability transition triggers lymphocyte apoptosis 1996(11) 6.Marchetti P;Castodo M;Susin SA Mitochondrial permeability transition is a central coordinating event of apoptosis[外文期刊] 1996(03) 7.Susin SA;Zamzami N;Castedo M Bcl-2 inhibits the mitochondrial release of an apoptogenic protease [外文期刊] 1996(04) 8.Chou JJ;Li H;Salvesen GS Solution structure of BID,an intracellular amplifier of apoptotic signaling[外文期刊] 1999 9.Ji HB;Zhai QW;Liu XY Transcription regulation of bcl-2gene 2000(02) 10.Tsujimoto Y;Shimizu S Bcl-2 family:Life or death switch 2000(01) 11.Zamzami N;Susin SA;Marchetti P Mitochondrial control of nuclear apoptosis 1996(04) 12.Ruth MK;Ella BW;Douglas RG The release of cytochrome c from apoptosis[外文期刊] 1997(5303) 13.Narita M;Shimizu S;ItoT Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome c release in isolated mitochondrial 1998(25) 14.Cosulich SC;Savory PJ;Clarke PR Bcl-2 regulates amplification of caspase activation by cytochrome C[外文期刊] 1999(03) 15.Bossy-Wetzel E;Green DR Caspases induce cytochrome C release from mitochondria by activating cytosolic factors[外文期刊] 1999(25) 16.Sutton VR;Davis JE;Cancilla M Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid,but not direct granzyme B-mediated caspase activation[外文期刊] 2000(10) 17.Stoka V;Turk B;Schendel SL Lysosomal protease pathways to apoptosis.Cleavage of bid,not pro-caspases,is the most likely route[外文期刊] 2001(05) 本文读者也读过(10条) 1.杨胜细胞凋亡机制简述[期刊论文]-科技信息（学术版）2007(26) 2.冯俊奇.李秀兰.白人骁.FENG Jun-qi.LI Xiu-lan.BAI Ren-xiao细胞凋亡机制研究进展[期刊论文]-国际生物医学工程杂志2006,29(1)
TRAIL诱导Hela细胞凋亡的线粒体信号通路
2011年10月第31卷第10期 基础医学与临床Basic ＆Clinical Medicine October 2011Vol．31No．10 收稿日期：2010－11－02 修回日期：2011－03－16 基金项目：扬州环境资源职业技术学院基金（07001） * 通信作者（corresponding author ）：yejilin126yejilin@126．com 文章编号：1001-6325（2011）10-1120-04 研究论文 TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡的线粒体信号通路 叶记林1*，刘永春2，于有江1，刘延庆 3 （1.扬州环境资源职业技术学院医学系，江苏扬州225127；2.江苏省苏北人民医院，江苏扬州225000； 3.扬州大学医学院，江苏扬州225001） 摘要：目的探讨TRAIL 诱导人宫颈癌Hela 细胞凋亡的线粒体通路。方法琼脂糖凝胶电泳判断细胞凋亡；激光共 聚焦、Western blot 、荧光免疫和caspase-3活性检测测定细胞线粒体膜电位（MMP ）、BCL-2蛋白、细胞色素c （Cyt c ）和凋亡诱导因子（AIF ）蛋白在细胞中的定位以及caspase-3活性。结果TRAIL 能诱导Hela 细胞凋亡，有凋亡细胞特有的DNA 梯状条带。同时， TRAIL 具有时间依赖性致MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）减小和BCL-2蛋白含量明显下降，线粒体Cyt c 蛋白释放，AIF 蛋白向细胞质、细胞核转移，caspase-3活性增强（作用10h 后达到2.25?0.20倍，P ＜0.05）。结论TRAIL 诱导Hela 细胞凋亡途径之一是通过线粒体信号通路进行的。 关键词：TRAIL ；Hela 细胞；细胞凋亡；线粒体 中图分类号：R 737.33 文献标志码：A TRAIL induced apoptosis in Hela cells by mitochondrial signal pathway YE Ji-lin 1*，LIU Yong-chun 2，YU You-jiang 1，LIU Yan-qing 3 （1.Medical Science Department ，Yangzhou Vocational College of Environment and Resources ，Yangzhou 225127；2.Subei People's Hospital of Jiangsu Province ，Yangzhou 225000；3.Medical Academy ，Yangzhou University ，Yangzhou 225001，China ） Abstract ：Objective To explore the mitochondrial pathway in the apoptosis of Hela cells induced by TRAIL． Methods Apoptotic cells were detected by DNA electrophoresis．The mitochondria membrane potential （MMP ）， the expressions of BCL-2，the location of Cyt c and AIF ，the caspase-3activity were tested by confocal laser mi-croscopy ，western blot ，immunofluorescence and caspase-3activity assay．Results TRAIL can induce apoptosis in Hela cells．DNA ladders were showed on agarose gel electrophoresis．At the same time ，TRAIL induced the de-crease of MMP （P ＜0.05，P ＜0.01）and BCL-2，the release of Cyt c ，the translocation of mitochondrial AIF to cytoplasm and nuclei ，the increase of caspase-3activity （the activity increased to 2.25?0.20fold in 10h treated cells ，P ＜0.05）in the time-dependent manner．Conclusions TRAIL induce the apoptosis of Hela cells through involves mitochondrial signal pathway． Key words ：TRAIL ；hela cel1s ；apoptosis ；mitochondria 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necro-sis factor related apoptosis inducing ligand ，TRAIL ）是 肿瘤坏死因子配体超家族中的一个新成员。它能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒性作
线粒体与细胞凋亡
线粒体与细胞凋亡 苑金香(潍坊学院生物系山东潍坊261043) 摘要 细胞凋亡是一种由基因控制的自主性死亡过程。近年来研究发现,线粒体在细胞凋亡过程中起重要作用,它可以通过改变膜通透性、释放凋亡活性物质等介导细胞凋亡。 关键词 线粒体 细胞凋亡 线粒体作为真核细胞能量代谢中心已为人熟知,然而近年来的研究发现,线粒体在细胞的另一重要生理活动 细胞凋亡中还扮演着重要角色。细胞凋亡即细胞程序性死亡(programmed cell death),是一种由基因编程调控的细胞主动自杀过程,细胞凋亡在胚胎发育、机体内环境的稳定、细菌和病毒感染细胞的清除过程中起重要作用,许多疾病的发生与细胞凋亡失控有关,而线粒体在细胞凋亡过程中起着重要作用。 1 线粒体膜的通透性改变与细胞凋亡 线粒体起着启动细胞凋亡的重要作用,其主要机制与线粒体渗透性转换孔(mitochondrial permeability transi tion pore,mtPTP)开放有关,mtPTP位于线粒体内膜和外膜的交界处,是一种由多种蛋白组成的复合体。mtPTP参与调节线粒体基质中的Ca2+、pH值电荷等,维持线粒体内环境的稳定性,保持氧化还原通路的畅通。mtPTP平时允许不大于0.15 104的小分子物质通过。当线粒体内Ca2+超载、自由基对线粒体膜造成氧化损伤,或者是能量产生下降时,均可引起mtPTP开放。在细胞凋亡发生早期,线粒体膜mtPTP打开,线粒体内膜电位( m)降低,一方面使得线粒体内的死亡促进因子(deathe-promoting factor,DPF)释放出来,促进凋亡的进行;另一方面,又使得细胞质进入线粒体基质,由此引起膜质子的转运异常,导致线粒体处于高渗状态,线粒体基质扩张,细胞骨架蛋白受压,直接导致细胞凋亡。 2 线粒体释放物与细胞凋亡 研究发现,线粒体内含有许多促死亡因子,包括细胞色素C,凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF),胱冬酶原及其他线粒体蛋白等。这些因子从线粒体中释放出来以后,以不同的方式参与到细胞凋亡的过程,影响细胞凋亡的进程。 2.1 细胞色素C的释放与细胞凋亡 1996年德克萨斯西南医学院研究中心王晓东研究小组发现细胞色素C参与细胞凋亡的过程。当细胞受凋亡信号刺激后,细胞色素C能迅速从线粒体释放到胞浆中,在细胞色素C含量丰富的细胞中,细胞将进入快速凋亡机制,释放出来的细胞色素C参与激活凋亡的酶通路,细胞内仍有许多未释放的细胞色素C,它们维持电子传递和有氧呼吸,从而产生足够的ATP,为细胞凋亡提供足够的能量。而在细胞色素C含量较少的细胞中,由于细胞色素C的大量释放,使电子传递链受阻,ATP产量骤减,无法提供足够的能量,因而使细胞走向与凋亡完全不同的坏死过程。 72h,凋亡细胞数从6.65%增加到16.42%;若处理96h 后,凋亡细胞数从4.71%增加到21.94%,这说明染料木黄酮可诱导前裂腺癌细胞的凋亡,通过这种办法可预防前列腺癌的发生。 另外,许多不同种类的化学物质(如亚硝胺类、杂环胺类、多环氮氢化物和糖醛核呋喃等)、外界微生物的侵袭、高温和放射线等化学的、物理的和生物的因素是影响癌细胞的生长和凋亡的外源性调节因素。还有一些常规使用的肿瘤化疗药物(如顺铂、维甲酸、羟基脲等)和 射线都可诱导多种肿瘤细胞凋亡。 4 结论 在正常机体内,细胞增殖和细胞凋亡处于一种动态平衡。故癌的发生和细胞的生与死密切相关。一方面,细胞的过度增殖导致了癌的发生,一些化学预防剂抑制癌发生的一个重要机制就是抑制细胞增殖;另一方面,细胞凋亡过程的失调也是癌发生的另一原因。研究细胞凋亡与癌发生的关系,进而诱导细胞凋亡对癌的预防具有重要的意义。 参考文献 1 Davis JN et al.Nutr Cancer,1998,32:123 131. 2 Li M et al.Cancer Epidemiol Biom Prev,2000,9(6):545 550. 3 方福德等.分子生物学前沿技术.北京医科大学、中国协 和医科大学联合出版社,1998,76 174. 4 贾旭东.细胞增殖和细胞凋亡和癌的发生和预防.国外 医学卫生学分册,2001,28(2):65 68. (B H) 17 2003年第38卷第5期 生 物 学 通 报
细胞凋亡的途径
按照起始caspase的不同，可将哺乳细胞的凋亡分为三种基本的途径。 一种称为外在途径（extrinsic pathway），由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因 子受体家族（tumour necrosis factor receptor，TNF-R）引发; 另一种称为内在途径（intrinsic pathway）或线粒体途径（mitochondrial pathway），由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始（Nicholson, 1999；Denault和Salvesen，2003）; 第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化，从而导致凋亡。 细胞凋亡的途径 摘要细胞凋亡是机体维持自身稳定的一种基本生理机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序的细胞自我消亡形式。通过细胞凋亡，机体可消除损伤、衰老与突变的细胞来维持自身的稳态平衡和各种器官及系统的正常功能。由于细胞凋亡是一种复杂的生理及病理现象，所以在其发生的3个阶段中涉及不同的信号转导途径及其调控。 关键词细胞凋亡线粒体内质网caspase家族NO 疾病 细胞凋亡（apoptosis）是一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是受基因调控的细胞主动性死亡过程，是细胞核受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应，然后凋亡的细胞将被吞噬细胞吞噬。经研究发现，不管是单细胞生物还是多细胞生物，细胞凋亡被称为细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]。是因为细胞死亡往往受到细胞内的某种遗传机制决定的“死亡程序”控制的。也会因为它的失调，机体也会失去稳定性，引发人类疾病如肿瘤、免疫系统等疾病[2]。由于它保证多细胞生物的健康生存过程中的重要性，引起了人们对其途径的广泛深入的研究，成为目前生命科学研究的热点之一。但其凋亡的途径不是很清楚，本文从多个方面概述了细胞凋亡途径。 1 细胞凋亡形态学上的特征 细胞凋亡（apoptosis）是1972年由Kerr教授根据形态学特征最先提出的[3],主要强调的是这种细胞凋亡是自然界中的生理学过程，是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。
生精细胞凋亡及其可能的信号通路.doc
生精细胞凋亡及其相关内容 细胞凋亡又叫程序性细胞死亡,是细胞在一系列内源性基因的调控下发生的自然或生理性死亡的过程。细胞凋亡过程是受基因的精确调控而完成的,其具体的过程机制尚不明确,Bcl-2 是一种细胞膜蛋白,主要存在于线粒体膜、滑面内质网和核膜上,高水平的Bcl-2 蛋白有抑制细胞死亡等作用,是细胞凋亡调控机制中的一个关键蛋白。Tanaka等证实Bcl-2 能抑制睾丸生精细胞的凋亡和分化。CytC 是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质,而Bax、Bak可与Bcl-2结合,止其对CytC释放孔道的抑制作用,从而促进CytC从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 检测生精细胞凋亡的技术 4．1 形态学检测 透射电镜检测：处死大鼠,取出睾丸。取出左侧睾丸少量组织,迅速在冰浴上切成1mm×1mm×2mm小块,置于预冷的2%戊二醛溶液中固定,标本经锇酸固定、脱水、树脂包埋、超薄切片和醋酸双氧铀染色后,在透射电镜下观察。可见细胞质空泡化,核膜增厚,核周隙增宽；染色质浓缩,附着于核边缘呈新月形；严重者染色质固缩、断裂, 出现凋亡小体。 4．2 琼脂糖凝胶电泳 通过观察DNA梯状电泳带或定量检测DNA片段,可测定凋亡。凋亡细胞DNA 在核小体连接处规律性降解,形成以180 bp一200 bp为最小单位的寡聚体片段,琼脂糖凝胶电泳时呈典型的“梯状带”。但Singh等琼脂糖凝胶电泳检测到青年人生精细胞DNA迁移呈圆形,老年人凋亡生精细胞DNA迁移呈彗星状。 4．3 DNA缺口原位标记法 处死大鼠,取出睾丸。置于10%中性福尔马林溶液中固定24ｈ,常规石蜡包埋、切片（4μm）,用于原位末端标记法（TUNEL）检测。主要以精原细胞凋亡为主。可见曲细精小管中各级生精细胞大量凋亡,管腔变薄,管腔中可见大量凋亡的分裂晚期的精子细胞。DNA缺口原位标记(TUNEL)法可用于检测凋亡细胞。此方法是将细胞的外源性核苷酸(dUTP)结合到单股断链的3′粘性未端上,标记的DNA 再用荧光或显色法检出。该法可检测早期细胞凋亡,特异性和敏感性都很高。E renpreisa等用甲苯胺蓝(tolui di ne blue,TB)、吖啶橙(acridine orange,A0)和TUNEL法检测人生精细胞DNA的完整性,证实这3种方法具有一致性。 4．4 流式细胞术 流式细胞(flow cytometry, FCM)可进DNA 、RNA含量分析,细胞周期、细胞表面标志和细胞受体分析。凋亡细胞的DNA裂解,FCM的DNA图上呈亚二倍体核型峰特点。应用DNA 染色剂穿透正常和凋亡细胞膜的能力,及其与凋亡细胞DNA 结合能力不同以区分正常细胞、凋亡细胞。FCM 还可定量检测凋亡标记蛋白的表达。吞噬凋亡细胞和未吞噬凋亡细胞的巨噬细胞群可利用带有荧光染料反应物的FCM 区分。 4．5 免疫组化法 利用抗原抗体特异性结合测定凋亡相关物质以检测凋亡。凋亡蛋白抗体或抗单链DNA 抗体标记观察凋亡细胞可检测凋亡标记蛋白Fas／FasL、Bc1-2／Bax、p53、p2l、caspases等以鉴定细胞凋亡。 死亡受体途径 Fas/FasL系统：现已有多种证据表明Fas/FasL信号系统启动生精细胞的凋亡：①在混合培养的支持细胞和生精细胞中加入FasL的反义核苷酸(阻断FasL的翻译), 能明显观察到生精细胞凋亡数目的减少；②Fas和Fas L的mRNA表达量随动物年龄的不同而不同。大鼠在16~ 33 d最多, 此时刚好是大鼠生精细胞凋亡的高峰期；③加入模拟FasL效用的Fas激动剂Jo-2(一种抗Fas的抗体), 生精细胞的数目大大减少；④在环境内分泌干扰物邻苯二甲酸-2-乙基已基酯(DEHP)的代谢产物邻苯二甲酸-单-乙基已基酯(MEHP)等一些有害化合物引起的睾丸损伤中, 随着生精细胞凋亡数目的增多, Fas和FasL的表达量也相应提高并逐渐达到峰值。 Bcl一2 家族成员引发的线粒体途径 在细胞凋亡中, 死亡信号通过Bcl-2 家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞色素c ( Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。 Bcl-2 家族的凋亡前体成员,一组BH3亚蛋白家族引发线粒体途径。胞外因素促使这些蛋白与另一组Bcl-2家族的凋亡前体成员——Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated x protein,Bax)亚蛋白家族结合。Bax为可溶性蛋白,存在于生精细胞质,受诱导向细胞核移动,定位于核旁聚合的线粒体外膜,以诱导生精细胞凋亡。Olderid 等在凋亡生精细胞中检测剑p53、p21、Bcl-2 和Bax的表达。Zhang等恒河猴隐睾症模型检测凋亡生精细胞,检测出Bax 转移剑细胞核附近及Bcl-2 表达增加,反映Bc1-2、Bax参与生精细胞凋亡。Bc1-2 和Bax的相互作用使Bax 聚合并横跨线粒体内外膜。 Bax的变化使原位于线粒体内膜caspases活化蛋白、Cyt—C从线粒体内移入胞质。释放的Cyt-C与胞质凋亡蛋白酶激活因子—1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)结合并诱导Apaf-1聚合,聚合Apaf-1 募集并活化procaspase-9。第二个caspases的线粒体激活因子(second mitochon—dria—derived activator of caspases,Smac) 同时从线粒体进入胞质, S ma c与APaf-1结合并促进procaspase一9活化。Caspase一9募集并活procaspase-3,最终引发生精细胞凋亡。 Procaspase-3活化引发Bcl一2作用促死亡蛋白(Bc1-2-interacting death agonist,Bid)裂解,Bid为Bcl-2连接蛋白,可诱导Cyt— C从线粒体释放,从而与Bcl一2／Bax途径相联系。Yu等观察到大鼠凋亡生精细胞内存在Bc1-2／Bax及Fas／FasL,显示这2条途径有相关性。 Bcl-2基因是线粒体途径的初始信号 Bcl- 2基因(B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是人B淋巴细胞的染色体易位激活的原癌基因, 该基因编码一种细胞质膜蛋白, 能够抑制细胞的程序性死亡。 Bcl-2原癌基因存在于多种动物的许多正常组织内, 对凋亡具有抑制作用。它不能促进细胞增殖,但能延长细胞的生命期限。Bcl -2蛋白之间常常以同源二聚体形式存在。用免疫组化法检测正常人体睾丸内Bcl-2蛋白表达时发现,精子细胞呈现中度到高度染色阳性(2+～4+) ,而精原细胞、初、次级精母细胞、支持细胞及间质细胞绝大多数染色呈阴性。Bcl-2蛋白主要分布在生精细胞线粒体,可能通过阻止细胞内Ca2 +的流动,干扰过氧化物的产生和脂膜的过氧化而抑制细胞凋亡。Ba x则可能通过插入线粒体膜, 引起细胞色素C (Cyt C )释放入细胞质而诱导生精细胞的凋亡。无细胞系统实验发现,外源性Bcl-2防止Cyt c释放与线粒体效用有关。在其他死亡信号不存在时, Bax 异位表达可以触发Cyt c的释放。Bax直接加入分离的线粒体环境中, 可以诱导Cyt c释放。但这种效应可被临近细胞Bcl-xl过表达或通过直接加入重组的Bcl-xl 而阻断。但是, caspase抑制剂虽不影响Cyt c的释放, 但却可以有效地阻断caspase激活和延缓细胞凋亡。 通过研究基因敲除和转基因小鼠发现：Bcl- 2基因家族在精子发生中有重要作用, Bax过量表达可诱导细胞凋亡, Bcl- 2过量表达可抑制细胞凋亡, Bax敲除小鼠不能产生成熟精子, 曲细精管中有大量不正常精原细胞的累积, 最终导致不育；Bcl-2和Bcl-Xs表达水平高的小鼠精子发生不正常时同样可引起不育。还有人对鸡睾丸的发育过程进行了研究。结果发现,在鸡胚胎期的睾丸中几乎检测不到Bca- XL, 而在未成熟和成熟的睾丸中均可检测到。由于在成熟睾丸中处于减数分裂及减数分裂后的细胞占大多数, 因此说明Bcl-2和Bcl- XL在鸡精原细胞减数分裂及减数分裂后细胞凋亡过程中的调节作用有所不同。 细胞色素C /Cyt— C是线粒体途径的关键节点 生精细胞DNA 受损引起p53表达,p53诱导Bax产生,引发Cyt C释放入胞质,进而发生caspases级联反应。在细胞凋亡中, 死亡信号通过Bcl-2家族或直接诱导线粒体膜通透性增加, 释放细胞色素c (Cyt c) , 激活半胱氨酸蛋白酶, 继而使细胞发生凋亡。CytC是一个线粒体起源的细胞凋亡信号,Bcl-2可通过抑制CytC从线粒体的释放入细胞质, 而Bax、Bak可与Bcl-2结合,阻止其CytC 释放孔道的抑制作用,从而促进CytC 从线粒体释放,引起凋亡。CytC通过接头分子使caspase（胱冬肽酶）分子募集并相互酶解活化,进而诱导细胞凋亡。 Caspase-3 是线粒体途径的最终执行者 caspase-3 是介导细胞凋亡的关键效应酶,是凋亡执行的重要效应分子。正常情况下,caspase-3 以酶原的形式存在于细胞质中,无活性,当细胞接受凋亡刺激时,其被激活,而诱导凋亡。caspase-3 是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志。 天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶(cysteinylaspartate- specific protease,Caspase)是执行细胞凋亡的蛋白酶家族,通过各种不同信号传导途径激活后降解或失活某些关键的细胞蛋白,并与凋亡的形态学特征密切相关。Caspase-3酶原能够被caspase- 8、- 9、- 10以及颗粒酶B所激活,是细胞凋亡的主要执行者。有证据表明,细胞凋亡的某些特征性标志,如染色体凝聚和DNA 片断化等均与caspase- 3 有直接关系。Caspase介导的细胞凋亡信号传导通路上,线粒体通路和死亡受体通路的交汇点也在caspase-3。Caspase-3对睾丸各级生精细胞凋亡的作用：潘连军等对睾丸静脉曲张大鼠各级生精细胞进行免疫组化检测,发现正常精原细胞及精母细胞胞质中均有少量caspase- 3表
细胞凋亡途径
细胞的凋亡 凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis , IAPs)是细胞内一类独特的抗凋亡蛋白家族,包括XIAP，c-IAP1，c-IAP2，神经元凋亡抑制蛋白(NIAP) ,ML-IAP, Apollon和survivin。IAPs通过在体外或体内抑制不同的caspases而抗细胞凋亡。与其他的可抑制上游 caspases的蛋白不同, IAPs是唯一的内源性 caspase 抑制物【1】。 Survivin(生存素)是凋亡抑制蛋白家族中的成员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子，于1997年由耶鲁大学Alfieri【2】等用效应细胞蛋白酶受体1(effector-cell protease receptor 1, ERP-1)在人类基因库的杂交中分离出来，Survivin大量表达于胚胎及婴幼儿组织中，在正常的分化组织中几乎检测不到【3】，然而却在60余种肿瘤细胞株和大部分人体肿瘤组织过度表达。 1.Survivin的分子结构 IAP家族蛋白一般在N末端含有 2～3个串联的含有 Cys/ His的保守冠状病毒IAP重复序列结构域(Baculovirus IAP Repeat, BIR)，发挥着极为重要的凋亡抑制作用。IAPs家族发挥抗凋亡作用的机理是通过BIR功能区之间的连接序列直接与Caspases家族蛋白结合，抑制细胞凋亡的发生。多数IAPs的C末端还含有一个环指状结构域(RING-finger domain)能够与两个锌原子形成配位键。这一锌指结构对于IAPs家族蛋白抗凋亡的功能密切相关。只有包含BIR2功能区的IAPs蛋白分子才具有结合和抑制死亡蛋白酶的功能，单一BIR1， BIR3或环指结构以及它们的任意组合蛋白体均无此效应。 Ambrosini 等【4】测定并绘出了Survivin基因完整的基因图谱，全长14796 bp，位于距离端粒约3%的位置。Survivin 基因与EPR-1 基因的编码区序列高度互补，位于染色体17q25的同一基因族，含有3个内含子和4个外显子，编码产生1个由142个氨基酸组成的胞浆蛋白，分子量约为16. 5kD。Survivin只含有一个BIR区域，C末端有一个α卷曲螺旋结构，不含环指状结构域【5】。 Survivin是唯一具有剪接异构体的IAP基因，一个是序列中缺少外显子3的survivin-ΔEX3；另一个是把部分内含子2作为隐蔽的外显子的survivin-2B。两者序列的改变导致了相应蛋白质结构和功能发生了显著变化，survivin-ΔEX3仍保留抗凋亡特性，survivin-2B抗凋亡功能则显著下降[6]。2004年Badran A等[7]发现survivin的另一新剪接异构体survivin-3B，survivin-3B 含有5个外显子，比survivin多3B外显子， survivin-3B包含单一的BIR，这对于其抗调亡作用致关重要。最近，包含两个外显子，3'为197bp的内含子的survivin-2α发现【8】。其终止密码在第2内含子，编码产生74个氨基酸的蛋白质。survivin的剪接异构体的功能尚不清楚，初步认为survivin-ΔEX3与线粒体依赖性凋亡通路有关，另外，证实survivin-2α能减弱survivin的抗凋亡活性[7]。 Survivin的异构体如图1。
线粒体和细胞凋亡
无论从原始的生物线虫到高级的哺乳动物乃至人类，还是从生物体外周器官到中枢神经系统，细胞凋亡都广泛存在。它作为生命的基本现象之一，可以发生在生理或病理条件下[1]。最初人们仅从形态学表现的特征上加以认识，如胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。随着科学的发展，人们开始发现线粒体在细胞凋亡中的起着重要的作用。随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒体与体细胞凋亡的关系有了新的认识。
2.1细胞凋亡的概念 细胞凋亡是细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）是一种细胞自身有基因控制的主动性死亡过程，其形态特征为核染色体固缩、DNA片段化、胞质浓缩、胞膜皱缩并形成凋亡小体，生化上表现为DNA梯形条带。而最新研究表明人类许多疾病都与其相关，如爱滋病、神经变性性疾病、骨髓发育不全综合征、酒精中毒性肝病、缺血性损伤, 尤其宫内窘迫所致胎儿缺血缺氧性脑损伤。神经细胞的凋亡，更是目前关的焦点，凋亡程度与胎儿乃至新生儿的脑发育、智力发育密切相关[2]。而科学家们发现，用溴化乙锭除去线粒体DNA(mtDNA)诱导一株人成纤维细胞凋亡，表明线粒体在细胞凋亡中起作用[3]。现在认为，细胞凋亡有胞核和胞质两条途径，随着对细胞凋亡研究的深入，人们对线粒与体细胞凋亡的关系有了新的认识。 2.2细胞凋亡与细胞坏死区别 细胞凋亡是细胞受基因调控的一种自然死亡过程，同细胞生长分化一样是生命活动中重要的细胞学事件。细胞凋亡与坏死不同，是一种细胞遵循自身程序结束其生命的主动的细胞学过程，对机体清除衰老或受损细胞具有重要意义[4]。细胞凋亡与坏死在形态特征上有明显的区别，凋亡细胞表现为染色质固缩，常聚集于核周边，呈境界分明的颗粒块状或新月形小体；细胞浆浓缩，密度增高；细胞核裂解为碎片，而线粒体形态结构保持完整（凋亡细胞细胞膜和线粒体的动态变化）。坏死是一种由多种刺激所引起的非特异性细胞死亡。如补体作
凋亡途径
凋亡途径 三种凋亡途径：第一种称为外在途径(extrinsic pathway),由细胞表面的死亡受体如Fas和肿瘤坏死因子受体家族(tumour necrosis factor receptor,TNF-R)引发;另一种称为内在途径(intrinsic pathway)或线粒体途径(mitochondrial pathway),由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所起始(Nicholson,1999;Denault和Salvesen,2003);第三种途径是内质网应激所导致的caspase-12的活化,从而导致凋亡 细胞凋亡的调控涉及许多基因，包括一些与细胞增殖有关的原癌基因和抑癌基因。其中研究较多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。 最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族，前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner 或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。 细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。 Apaf-1被称为凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1），在线虫中的同源物为ced-4，在线粒体参与的凋亡途径中具有重要作用，该基因敲除后，小鼠神经细胞过多，脑畸形发育。Apaf-1含有3个不同的结构域：①CARD（caspase recruitment domain）结构域，能召集caspase-9；②ced-4 同源结构域，能结合ATP/dATP；③C端结构域，含有色氨酸/天冬氨酸重复序列，当细胞色素c的结合到这一区域后，能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用，而这一过程又需要细胞色素c（Apaf-2）和caspase-9（Apaf-3）参与。Apaf-1/细胞色素c复合体与ATP/dATP结合后，Apaf-1就可以通过其CARD结构域召集caspase-9，形成凋亡体（apoptosome），激活caspase-3，启动caspase级联反应。 Bcl-2[5]为凋亡抑制基因，是膜的整合蛋白，其功能相当于线虫中的ced-9。现已发现至少19个同源物，它们在线粒体参与的凋亡途径中起调控作用，能控制线粒体中细胞色素c等凋亡因子的释放。 Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常有一个羧端跨膜结构域(transmembrane region ,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。根据功能和结构可将Bcl-2基因家族分为两类（图15-7），一类是抗凋亡的（anti-apoptotic），如：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1；一类是促进凋亡的（pro-apoptotic），如：Bax、Bak、Bad、Bid、Bim，在促凋亡蛋白中还有一类仅含BH3结构，如Bid、Bad。 虽然Bcl-2蛋白存在于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上，但主要定位于线粒体外膜，它拮抗促凋亡蛋白的功能。而大多数促凋亡蛋白则主要定位于细胞质，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们可以向线粒体转位，通过寡聚化在线粒体外膜形成跨膜通道，或者开启线粒体的PT孔，从而导致线粒体中的凋亡因子释放，激活caspase，导致细胞凋亡。 胞质中的促凋亡蛋白可通过不同的方式被激活，包括去磷酸化，如Bad；被caspase加工为活性分子，如Bid；从结合蛋白上释放出来，如Bim是与微管蛋白结合在一起的。 Fas又称作APO-1/CD95，属TNF受体家族。Fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白，分布于胸腺细胞，激活的T 和B淋巴细胞，巨噬细胞，肝、脾、肺、心、脑、肠、睾丸和卵巢细胞等。Fas蛋白与Fas配体结合后，会激活caspase，导致靶细胞走向凋亡。 p53是一种抑癌基因，其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤，则抑制细胞增殖，直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复，则诱导其调亡，研究发现丧失p53功能的小鼠胸腺细胞对糖皮质激素诱导的调亡反应和正常细胞相同，而对辐射诱导的调亡不敏感。 是高表达，作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。 ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）是与DNA损伤检验有关的一个重要基因。最早发现于毛细血管扩张性共济失调