绿色荧光蛋白标记技术的研究成就与展望

绿色荧光蛋白标记科技的研究成就与展望

2008年10月8日，日裔美国科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和华裔美国科学家钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。诺贝尔奖委员会将化学奖授予下村修、马丁·沙尔菲和钱永健三人，以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术。

绿色荧光蛋白GFP的发现
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein)，简称GFP，是科学家从水母(Aequorea victoria)体内发现的野生型发光蛋白。其分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。
绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，在细胞生物学与分子生物学领域中，是常用的报导基因。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色荧光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物,例如白鼠身上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。
这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。在大自然中，具有发光能力的生物有不少，萤火虫是陆地上最为常见的发光生物。在海洋里，某些水母、珊瑚和深海鱼类也有发光的能力。事实上，大多数发光动物能发光是靠两种物质——荧光素和荧光素酶——合作产生的结果。不同发光生物的荧光素和荧光素酶结构是不一样的。因此，这些生物的发光本领只能是它们自己的“专利”。
20世纪60年代，日本科学家下村修从美国西岸打捞了大量发光水母，带回位于华盛顿州的实验室进行研究。这些水母在受到外界的惊扰时会发出绿色的荧光，下村修希望找到这种水母的荧光素酶。然而，经过长期的重复努力，居然毫无收获。他大胆地假设，这种学名叫Aequorea victoria的水母能发光也许并不是常规的荧光素/荧光素酶原理。他想，可能存在有另一种能产生荧光的蛋白。此后，他进行了更多的实验，终于搞清楚了这种水母的特殊发光原理。原来，在这种水母的体内有一种叫水母素的物质，在与钙离子结合时会发出蓝光，而这道蓝光未经人所见就已被一种蛋白质吸收，改发绿色的荧光。这种捕获蓝光并发出绿光的蛋白质，就是绿色荧光蛋白。
绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。利用这一性质，生物学家们可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或细

胞，然后在蓝光照射下进行显微镜观察。原本黑暗或透明的视场马上变得星光点点——那是被标记了的活动目标。对生物活体样本的实时观察，在绿色荧光蛋白被发现和应用以前，是根本不可想象的。
传统的荧光分子在发光的同时，会产生具有毒性的氧自由基，导致被观察的细胞死亡，这叫做“光毒性”，因此，在绿色荧光蛋白发现以前，科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构，而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱，非常适合用于标记活细胞。
然而，绿色荧光蛋白被发现20多年后，才有人将其应用在生物样品标记上。1993年，马丁·沙尔菲成功地通过基因重组的方法使得除水母以外的其他生物(如大肠杆菌等)也能产生绿色荧光蛋白，这不仅证实了绿色荧光蛋白与活体生物的相容性，还建立了利用绿色荧光蛋白研究基因表达的基本方法，而许多现代重大疾病都与基因表达的异常有关。至此，生物医学研究的一场“绿色革命”揭开了序幕。
1994年，华裔美国科学家钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理，并对它进行了大刀阔斧的化学改造，不但大大增强了它的发光效率，还发展出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物学家们选用。目前生物实验室普遍使用的荧光蛋白，大部分是钱永健改造的变种。
有了这些荧光蛋白，科学家们就好像在细胞内装上了“摄像头”，得以实时监测各种病毒“为非作歹”的过程。通过沙尔菲的基因克隆思路，科学家们还培育出了荧光老鼠和荧光猪，由于沙尔菲与钱永健的突出贡献，他们与绿色荧光蛋白的发现者下村修共享了2008年的诺贝尔化学奖。瑞典皇家科学院将绿色荧光蛋白的发现和改造与显微镜的发明相提并论，成为当代生物科学研究中最重要的工具之一。

绿色荧光蛋白GFP的性质
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching 绿荧光水母——通过体内绿色荧光蛋白发光)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，

荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。

绿色荧光蛋白GFP的应用
1．分子标记 作为一种新型的报导基因，GFP已在生物学的许多研究领域得到应用。利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。
除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点
2．药物筛选 许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。基于细胞的荧光分析可分为三类：即根据荧光的密度变化、能量转移或荧光探针的分布来研究目标蛋白如受体、离子通道或酶的状态的变化。荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。
在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。例如当信号分子和某一特殊受体结合后常会导致配体-受体复合物从某一细胞区域迁移到另一区域，而这一迁移过程通常会介导一重要的生理功能。因而，这些受体常常被用作药物筛选的目标，若某一药物具有与信号分子类似的功能，那么该药物即具有潜在的医药价值。利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出哪些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。利用这一原理，已经成功构建了一个

筛选模型用于研究药物介导的糖皮质激素受体(hGR)的迁移过程。在一96孔板中培养细胞，并以一编码hGR-GFP蛋白的质粒转染该细胞。当细胞用待筛选的药物处理后，hGR-GFP从细胞质迁移人细胞核的过程可实时或在某一时段内被证实，根据荧光分布即可推断哪一种药物具有与hGR配体相类似的功能。利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。
3．融合抗体 近二十年来，抗体生成技术有了飞速发展，已经从细胞工程抗体(杂交瘤技术一单克隆抗体)发展到了第三代抗体：基因工程抗体，尤其是噬菌体抗体库技术的出现，解决了人源抗体的研制问题，促进了各种性能优良抗体以及具有多种功能的抗体融合蛋白的开发。单链抗体是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。
由于技术上的的原因，一般融合抗体均置于原核表达系统如E.coli中表达。为便于表达蛋白的分离纯化，一般在单链抗体的N端或C端插入一6×His序列，便于用Ni-NTA亲和层析柱纯化目标蛋白。但这一技术也存在一些问题。由于抗体分子内存在二硫键，而在原核表达系统内由于抗体不能正确折叠，容易形成包涵体，表达出来的目标蛋白无活性，需要在氧化还原体系中进行复性。但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。
4．生物传感器 蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。第一个基于GFP的生物感受器为Ca2+感受器，由Romoser和Miyawaki几乎同时提出。这一感受器原理是利用钙调蛋白结合钙离子后引起的空间构象变化导致两种GFP突变体间发生荧光共振能量转移。

但是由于大多数蛋白不能像钙调蛋白那样承受较大的空间构象变化，为克服这一缺点，人们开始提出利用基因融合技术将一新的分子识别位点结合到GFP上以构建新的分子感受器。Doi和Yanagawa根据这一原理将TEM1 β-内酰胺酶(Bla)融合到GFP上。当缺少目标分子时，GFP处于静止状态不会产生荧光。但是当目标分子β-内酰胺酶抑制蛋白(BLIP)与Bla结合后，即使GFP活化产生荧光，而这一变化很容易被检测到。将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。
5.GFP在肿瘤发病机制研究中的应用 GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因形成融合蛋白且不影响自身的目的基因产物的空间构象和功能。GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为绿色，即可定 将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中
量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。
在肿瘤的形成过程中，增殖和凋亡是一对相互矛盾的统一体。若肿瘤细胞凋亡占优势，肿瘤组织将长期处于休眠状态或自行消亡。肿瘤细胞的凋亡受凋亡相关基因调控。用GFP转染肿瘤细胞凋亡相关基因，并与正常组织进行比较，则大致可判断此基因为抑制肿瘤细胞凋亡的基因；反之，为促进肿瘤细胞凋亡的基因。
肿瘤细胞浸润是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动和基质内增殖等一系列过程的表现，其根本原因在于肿瘤细胞内某些基因表达异常。利用GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

绿色荧光蛋白的应用前景
野生型 GFP 合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能 , 而且在 470 nm 处的荧光强度相对较低。为了改善 GFP 荧光特性 ( 如摩尔吸收值及释放波谱 ) , 对 GFP 进行了突变和重组实验。 Chalfie 等 通过测定大肠杆菌和线虫体内重组 GFP 的荧光光谱发现 , 它和提纯的天然 GFP 光谱完全一致。突变实验发现 , 多数突变导致 GFP 部分或完全丧失荧光活性 , 但某种突变使 GFP 明显地改变激发和释放波谱。例如用 The 替代 Ser 65 , 在 490 nm 处出现一个单一激发峰值 , 激发后产生的荧光强度是野生型的 6 倍 , 对光淬灭具有更强的抵抗性 , 并且出现红移现象 , 该突变蛋白质与 FITC 的性质相似 ; 同样 Leu 替代 Phe 64 , 即增加 GFP 的可溶性 , 荧光强度增强 35 倍。 3 个氨基酸同

时突变时 , 在 360 nm 至 400 nm 之间 , 出现最大激发峰 , 而且增大生色团形成的机率 , 可溶性更强 , 荧光强度为野生型 GFP 的 18 倍。现有人认为 , 低浓度 GC 含量是 GFP 低表达的原因之一 , 为此 , 研究人员合成了高 GC 含量的特殊 GFP , 并且发现这种 GFP 有更强的荧光强度 。此外 , 用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型 GFP 中密码子可提高 GFP 在哺乳动物中的表达效率。许多 GFP 突变蛋白 , 不仅改变了激发和释放波谱 , 而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等 。 不同的突变体给应用提供了更广阔的前景 , 但是也发现某些突变体在生理变化的 pH 值范围内显示了更大的敏感性。研究人员利用一个 pH 敏感的 GFP 突变体检测细胞质、细胞核、高尔基体和线粒体基质中的 pH 值 , 发现在这些区域测量到的数值与以前报道的测量值有非常好的吻合 。 GFP 依赖的 pH 检测子 , 与小分子染料不同 , 这种检测手段不必考虑染料渗透、环境水解等一系列问题 , 且 GFP 具有高度选择定位性 , 适合于所有对于基因转染敏感的细胞。更重要的是 , 这个实验说明利用组织特异性启动子 GFP 检测特定组织 , 通过融合到目的蛋白 , 可以检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的 pH 值。这样开创了检测以前所不能到达部位 pH 值的可能性。
到目前为止 , 荧光蛋白已有非常广泛的应用 , GFP 可应用于转染细胞的确定 , 体内基因表达的测定 , 蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测 , 免疫分析、核酸碱基探针分析 , 以及分子间第二信使钙离子和 cAMP 水平的指示 , 细胞间隙 pH 变化的检测 。另外 ,GFP 也可以和其他蛋白质形成融合蛋白 , 作为基因治疗检测指标 。
但是 ,GFP 在应用中还发现有许多问题亟待解决 : (1) 荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难 , (2) 多数生物具有微弱的自发荧光现象 , 并有着类似的激发和发射波长 , 这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 , (3) 实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株 , 可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关。