淋病奈瑟菌表面蛋白A真核表达载体的构建及表达
中国皮肤性病学杂志２００６年１１月第２０卷第１１期ＣｈｉｎＪＤｅｒｍＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｎｏｖ．２００６，Ｖ０１．２０，Ｎｏ．１１
淋病奈瑟菌表面蛋白Ａ真核表达载体的
构建及表达
谢良伊１，胡四海１，唐湘云２，杨胜辉１，余敏君１，詹利生１，吕运成１
［摘要］目的构建淋病奈瑟茵外膜蛋白——奈瑟菌表面蛋白Ａ（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎＡ，ＮｓｐＡ）的真核表达载体并使其在真核细胞中表达。方法用ＰＣＲ方法扩增ＮｓｐＡ基因，将扩增的产物连接于测序载体ｐＵＣｍ．Ｔ上，并构建重组体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＮｓｐＡ。以脂质体法转染ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞，用ＲＴ—ＰＣＲ检测ＮｓｐＡｍＲＮＡ的水平，免疫组化染色法检测蛋白表达。结果扩增的目的基因包括了全段ＮｓｐＡ基因，长度约５２５ｂｐ。以脂质体转染ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞后，用ＲＴ—ＰＣＲ和免疫组化染色法检测表明，细胞可转录和表达ＮｓｐＡ。结论成功构建了重组真核表达栽体ｐｃＤ—ＮＡ３．１（＋）／ＮｓｐＡ，并在真核细胞中得到表达，为研究此蛋白的免疫原性以及淋病基因疫苗的研制提供了物质基础。
［关键词］淋病奈瑟菌；ＮｓｐＡ；真核表达载体；克隆；表达
［中图分类号］Ｒ３７８．１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００１—７０８９（２００６）１１—０６４５—０４
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＥｕｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＧｅｎｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａＧｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＳｕｒｆａｃｅＰｒｏｔｅｉｎＡ
ＸＩＥＬｉａｎｇ?ｙｉ，ＨＵＳｉ—ｈａｉ，ＴＡＮＧＸｉａｎｇ—ｙｕｎ，ｅｔａｌ
（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，ＮａｎｈｕａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｎｇｙａｎｇ４２１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗｈｉｃｈｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｏｆＮｓｐＡｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅ
ＮｓｐＡｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ．ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐＵＣｍ—Ｔａｎｄｔｈｅｎｓｕｂ—ｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１（＋）．ＴｈｅｎｔｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｐｌａｓｍｉｄｗａｓｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄｉｎｔｏＲＡＷ２６４．７ａｎｄＣＯＳ一７ｃｅｌｌｓｂｙｌｉｐｏｓｏｍｅ—ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｔｈｏｄ．ＬｅｖｅｌｏｆＮｓｐＡｍＲＮＡｉｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＲＡＷ２６４．７ｃｅｌｌｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲａｎｄＮｓｐＡｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｆｅｅｔｅｄＣＯＳ－７ｃｅｌｌｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｇｅｎｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｂｏｕｔ５２５ｂｐ，ｉｎｃｌｕｄｅｄｅｎｔｉｒｅｇｅｎｅｏｆＮｓｐＡ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｃｏｕｌｄｅｘｐｒｅｓｓＮｓｐＡｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＮｓｐＡｈａｖｅｂｅｅｎａｃｈｉｅｖｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ，ＷｈｉｃｈｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｅｉｔｙｏｆＮｓｐＡａｎｄＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｎｅｉｓｓｅｆｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ；ＮｓｐＡ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ；Ｃｌｏｎｅ；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
淋病奈瑟菌（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）简称淋球菌，主要侵犯人类泌尿生殖道的柱状上皮，破坏黏膜并侵入黏膜下层，引起泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性炎症，是危害性很大的性传播疾病之一。如何有效控制和预防淋病，成为全世界普遍关注的公共卫生问题，而研制出有效的疫苗，是预防和控制淋病的关键。Ｐｌａｎｔｅ等首先克隆了淋球菌的奈瑟菌表面蛋白Ａ（ＮｓｐＡ）基因，发现ＮｓｐＡ不但能在淋球菌表面持续表达，而且高度保守、具有较强免疫原性，是一个颇具潜力的淋球菌疫苗候选蛋白…。笔者运用分子生物学技术，在克隆淋球菌ＮｓｐＡ全长基因的基础上，构建淋
［基金项目］湖南省自然科学基金（０５ｊｊ３００４５）；衡阳市科研基金（２００５ＫＳ０１—０５７）
［作者单位］１南华大学病原生物研究所，湖南衡阳４２１００１；２湖南环境生物职业技术学院附属医院，湖南衡阳４２１００１
［作者简介］谢良伊（１９７８一），女，湖南涟源人，医学硕士，主要从事淋球菌感染与免疫的研究。
［通讯作者］胡四海，Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｈｓｓｈｈ＿５１８＠１６３．ｃｏｉｎ球菌ＮｓｐＡ真核表达载体，使其在真核细胞中得到表达，为进一步研究该蛋白的免疫效果以及淋球菌ＮｓｐＡ基因疫苗奠定基础。
１材料和方法
１．１材料与试剂淋球菌ＷＨＯ标准株Ａ株、菌株Ｅ．ｃｏｌｉ、ＪＭｌ０９、真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）、ＲＡＷ２６４．７小鼠巨噬细胞株和ＣＯＳ－７细胞株均为本研究所保存；ＧＣ琼脂粉、血红蛋白粉、促淋生长剂及混合抗生素均购自Ｏｘｏｉｄ公司，按说明书配制Ｔ—Ｍ培养基；Ｔ—Ａ克隆载体ｐＵＣｍ—Ｔ、即用ＰＣＲ扩增试剂盒、ＵＮＩＱ一１０柱式质粒小量提取试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂盒和总ＲＮＡ提取试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａｌＩ，ＲＮＡＫｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０购自大连宝生物工程有限公司；Ｔ。ＤＮＡ连接酶、１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ和酶标二抗山羊抗兔ＩｇＧ．ＨＲＰ购自华美生物工程公司；脂质体转染试剂ＬｉｐｏｆｅｅｔａｍｉｎｅｌＭ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＤＡＢ免疫组
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化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。
１．２方法
１．２．１淋球菌基因组ＤＮＡ的制备取Ｔ—Ｍ培养基上生长的淋球菌单个菌落，接种于淋球菌液体培养基，３７℃培养１６ｈ后，取５ｍ１液体培养物菌体沉淀重悬于５０¨１裂解液中，充分振荡混匀，１００℃煮沸１５ｒａｉｎ，离心取上清备用。
１．２．２ＰＣＲ引物的设计和合成据ＧｅｎＢａｎｋ上公布的淋球菌ＷＨＯ—Ａ参考菌株ＮｓｐＡ的全长基因序列设计并合成一对引物，在上、下游引物分别引入ＨｉｎｄＨＩ和ＸｂａｌＩ限制性酶切位点。上游引物（Ｐ１）：５’一ＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＴ］？ＧＣＣＧ一３’，下游引物（Ｐ２）：５’一ＧＴＡＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＡｒＩＴＧＡＣＧＣＧＣＡＣ－３’。弓ｌ物由上海生物工程公司合成。
１．２．３ＮｓｐＡ基因的ＰＣＲ扩增以提取的淋球菌基因组ＤＮＡ为模板，ＰＣＲ反应总体积为２５¨ｌ：淋球菌模板ＤＮＡ０．３斗ｌ，引物Ｐｌ和Ｐ２各１斗ｌ，２ＸＰＣＲＭａｓｔｅｒ１２．５ｍ，ＳｔｅｒｉａｌｄｄＨ２０１０．２阻ｌ。ＰＣＲ反应条件：９４℃预变性３ｒａｉｎ，９４℃３０ｓ，５８０Ｃ３０Ｓ，７２℃１ｒａｉｎ，３０个循环，末次循环后再７２。（２延伸８ｍｉｎ。取８ｌｘｌＰＣＲ产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳观察结果，并用ＤＮＡ胶回收试剂盒回收纯化ＰＣＲ产物。
１．２．４ｐＵＣｍ—Ｔ载体的构建及鉴定按ｐＵＣｍ—Ｔ载体克隆试剂盒操作说明书要求，将回收的ＰＣＲ产物与开环的克隆载体ｐＵＣｍ—Ｔ经Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化人大肠杆菌ＪＭｌ０９，并进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆，对其进行酶切和ＰＣＲ鉴定分析。
１．２．５重组真核载体的构建及鉴定按ｐｃＤＮＡ３．１（＋）克隆试剂盒操作说明书要求，取ＨｉｎｄⅢ和ＸｂａｌＩ酶切后纯化的ＰＣＲ产物和ｐｃＤＮＡ３．ｉ（＋）质粒ＤＮＡ，将两者按一定摩尔比混合，１６＇１２连接过夜后转化人大肠杆菌ＪＭｌ０９，筛选阳性克隆。取阳性克隆的质粒，对其进行酶切和ＰＣＲ鉴定分析，将获得的重组载体命名为ｐｃＮｓｐＡ。ＤＮＡ测序由上海生工公司完成。１．２．６脂质体法转染ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞用含１０％胎牛血清的ＨＧＤＭＥＭ培养基培养ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞。于转染前１８～２４ｈ，将处于对数增长期的ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞，以Ｔｒｙｐｓｉｎ（２．５∥Ｌ）一ＥＤＴＡ（１ｍｍｏｌ／Ｌ）消化传代。将ＲＡＷ２６４．７和ＣＯＳ－７细胞均按每孑Ｌ约为２×１０５个细胞接种于６孔培养板中。至细胞密度大约为９０％时，分别取上述制备好的质粒ｐｅＤＮＡ３．１（＋）和ｐｃＮｓｐＡ４斗ｇ加入无血清、无抗生素的ＨＧＤＭＥＭ培养基中，总体积为２５０止（留１管不加质粒作为空白对照），混匀。取１０汕ｌ脂质体加入２４０出无血清、无抗生素的ＨＧＤＭＥＭ培养基中。两者混匀后，室温静置１５ｍｉｎ。将６孔板用ＨＧＤＭＥＭ洗３次，每孔加无血清、无抗生素的ＨＧＤＭＥＭ１ｍ１，然后逐滴加入上述置备好的脂质体一ＤＮＡ复合物，５ｈ后吸出细胞上清液每孔细胞中加入２ｍ１含１０％胎牛血清的ＨＧＤＭＥＭ培养基，置３７℃５％ＣＯ，恒温培养箱中培养。
１．２．７ＮｓｐＡｍＲＮＡ的检测将上述转染了ｐｃＤＮＡ３．１（＋）和’ｐｃＮｓｐＡ质粒的ＲＡＷ２６４．７细胞以及未转染质粒的细胞培养４８ｈ后，提取细胞总ＲＮＡ，紫外分光光度计和电泳检测其含量和纯度。最后用引物Ｐ１和Ｐ２进行ＲＴ—ＰＣＲ检测（两步法）。ｃＤＮＡ第１链的合成参照ＴａＫａＲａ公司产品说明书。ＰＣＲ反应体系为：逆转录产物１０¨１，Ｐ１和Ｐ２各０．５¨ｌ，５×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ１０斗ｌ，ＴａＫａＲａＥｘＴａｐＨＳ０．２５斗１，用ｄｄＨ２０补至５０“１。于９４℃预变性２ｍｉｎ，以下３０个循环为：９４℃变性，５８。Ｃ退火，７２＇Ｅ延伸。最后于７２℃再延伸５ｍｉｎ。以Ｂ—Ａｃｔｉｎ为ＰＣＲ内对照，设计一对引物（上游引物：５’一ＡＧＡＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣ．３’，下游引物：５，＿ＣＧＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＣＣＧＴ一３７）。ＰＣＲ产物经１．ｏ％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色后于紫外线透射仪摄像。
１．２．８ＮｓｐＡ表达产物的检测用免疫组化染色法检测构建的重组载体ｐｃＮｓｐＡ在ＣＯＳ一７细胞中的表达。将上述转染了ｐｃＤＮＡ３．１（＋）和ｐｃＮｓｐＡ质粒的ＣＯＳ一７细胞以及未转染质粒的细胞培养４８ｈ后，经９５％乙醇固定、ＰＢＳ洗涤后，用ＳＡＢＣ法检测ＮｓｐＡ蛋白的表达，一抗为兔抗淋球菌多克隆抗体，二抗为山羊抗兔ＩｇＧ，以ＤＡＢ显色，显微镜下观察后照相。
２结果
２．１ＰＣＲ扩增淋球菌ＮｓｐＡ基因以引物Ｐ１和Ｐ２扩增淋球菌ＮｓｐＡ的全长基因，结果显示为单一条带，片段大小约５２５ｂｐ，与理论设计扩增片段大小一致（图１）。
２．２重组质粒ｐＵＣｍ—Ｔ／ＮｓｐＡ的鉴定重组质粒ｐＵＣｍ—Ｔ／ＮｓｐＡ经ＰＣＲ和双酶切鉴定，ＰＣＲ扩增出的条带与理论设计扩增片段大小一致，双酶切产生大小约为２７７３７ｂｐ和５２５ｂｐ２个条带（图２）。
２．３重组真核表达载体的鉴定和和ＤＮＡ测序重组质粒ｐｃＮｓｐＡ经ＰＣＲ和双酶切鉴定，ＰＣＲ扩增出的条带与理论设计扩增片段大小一致，双酶切产生大小约为５４２８ｂｐ和５２５ｂｐ２个条带。ＤＮＡ测序证实重组蛋白基因含有５２５个核苷酸，无任何密码子缺失与突变，读码框架正确（图３）。
２．４转染的ＲＡＷ２６４．７细胞中ＮｓｐＡｍＲＮＡ的测定
中困皮肤性病学杂志２００６年１１月第２０卷第１１期ＣｈｉｎＪＤｅｎｎＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｎｏｖ．２００６，Ｖ０１．２０，Ｎｏ．１１
１：空白对照；２：ＮｓｐＡ基因ＰＣＲ扩增产物；Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ
图１ＮｓｐＡ基因ＰＣＲ扩增产物
Ｍ１：１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：以ｐＵＣｍ。Ｔ／ＮｓｐＡ豪组质粒为模板的ＰＣＲ扩增产物；２：经ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｂａｌＩ双酶切的重组质粒ｐＵＣｍ—Ｔ／ＮｓｐＡ；３：经ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｂａｌＩ双酶切的空质粒ｐＵＣｍ?Ｔ；４：空质粒ｐＵＣｍ－Ｔ；５：重组质粒ｐＵＣｍ－Ｔ／ＮｓｐＡ．；Ｍ２：Ｓｕｐｅｒｃｏｉ｜ｅｄＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ
图２ｐＵＣｍ．Ｔ／ＮｓｐＡ重组质粒ＰＣＲ、酶切鉴定ＲＴ—ＰＣＲ产物经１．ｏ％琼脂糖凝胶电泳、ＥＢ染色后，可见ＮｓｐＡｍＲＮＡ扩增条带约为５２５ｂｐ；而空质粒及无质粒转染的ＲＡＷ２６４．７细胞均未出现此预期条带，提示转染ｐｃＮｓｐＡ的ＲＡＷ２６４．７细胞中有ＮｓｐＡｍＲＮＡ存在。内对照［３－Ａｃｔｉｎ经ＲＴ—ＰＣＲ可见大小约１３８ｂｐ的片段（图４）。
２．５ＮｓｐＡ在ＣＯＳ一７细胞中的表达免疫组化染色结果显示，转染空质粒和未经转染的ＣＯＳ一７细胞都没有着染，而转染重组质粒ｐｃＮｓｐＡ的ＣＯＳ一７细胞胞浆、胞膜都有明显的棕黄色颗粒着染（图５）。
３讨论
２０世纪７０年代Ａｒｋｏ等使用灭活的全细胞淋球菌疫苗免疫雄性黑猩猩，部分动物获得了对尿道淋球Ｍ１：１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：以ｐｃＮｓｐＡ重组质粒为模板的ＰＣＲ扩增产物；２：经ＨｉｎｄＩＩＩ和ＸｂａｌＩ双酶切的重组质粒ｐｃＮｓｐＡ；３：经ＨｉｎｄＩｌｌ和ＸｂａｌＩ双酶切的空质粒ｐｅＤＮＡ３．１（＋）；４：空质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）；５：莺组质粒ｐｃＮｓｐＡ；Ｍ２：ＳｕｐｅｒｃｏｉｌｅｄＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ
图３ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ＮｓｐＡ重组质粒ＰＣＲ、酶切鉴定
Ｍｔ：１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ；１：ｐｃＮｓｐＡ转染ＲＡＷ２６４．７细胞的ＲＴ—ＰＣＲｊ“物；２：ｐｅＤＮＡ３．１（＋）转染ＲＡＷ２６４７细胞的ＲＴ—ＰＣＲ产物；３：未转染质粒的ＲＡＷ２６４．７细胞的ＲＴ．ＰＣＲ产物
图４ＲＡＷ２６４．７细胞中ＮｓｐＡｍＲＮＡＲＴ—ＰＣＲ产物的
琼脂糖凝胶电泳分析
菌感染的抵抗力，但因个体差异太大，免疫力不持久，不足以保护再感染而未能成功卫Ｊ。此后对淋病疫苗的研究主要集中于纯化的特异性抗原，包括ＰＩ（又名Ｐｏｒｉｎ／ＰｏｒＢ，主要外膜蛋白）、Ｐ１Ｉ（又名Ｏｐａ，热修饰蛋白）和ＰｌｌＩ（Ｒｍｐ，还原反应可修饰蛋白）等外膜蛋白，还有菌毛蛋白ｐｉｌｉｎ和ＬＰＳ（脂多糖）／ＬＯＳ（脂寡糖）。在这几种侯选疫苗抗原中，淋球菌表面抗原的易变性，是其产生保护性体液免疫的主要障碍。３ｏ。
１９９７年，Ｍａｒｔｉｎ等Ｍｏ首次报道奈瑟氏属脑膜炎球菌的外膜上存在一种低分子量蛋白，并命名为奈瑟菌表面蛋白Ａ（ｎｅｉｓｓｅｒｉａｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ，ＮｓｐＡ）。ＮｓｐＡ
中国皮肤性病学杂志２００６年１１月第２０卷第１１期ＣｈｉｎＪＤｅｒｍＶｅｎｅｒｅｏｌ，Ｎｏｖ．２００６，Ｖ０１．２０，Ｎｏ．１１
Ａ：ｐｃＮｓｐＡ转染ＣＯＳ－７细胞；Ｂ：ｐｃＤＮＡ３．１（＋）转染ＣＯＳ－７细胞；Ｃ：未转染质粒的ＣＯＳ－７细胞
图５ＮｓｐＡ基因表达的免疫组化染色法检测×２００
存在于所有脑膜炎球菌的细胞膜表面，其抗原保守性超过其他膜蛋白。用重组ＮｓｐＡ免疫小鼠能诱导保护性免疫，ＮｓｐＡ单抗能保护小鼠免于致死量脑膜炎球菌的攻击，并且发现淋球菌的基因组内也存在ＮｓｐＡ基因¨－９１。Ｐｌａｎｔｅ等。１１在上述研究的基础上克隆淋球菌ＮｓｐＡ基因，发现淋球菌ＮｓｐＡ氨基酸序列和脑膜炎球菌ＮｓｐＡ的同源性为９３％，淋球菌菌株之问的同源性高达９８％。用同位素标记ＮｓｐＡ单抗，检测ＮｓｐＡ在淋球菌细胞膜表面的暴露情况，证实淋球菌ＮｓｐＡ暴露于整个细菌表面。Ｐｌａｎｔｅ所制备的７株淋球菌ＮｓｐＡ单抗中有４株单抗能识别所有用于测试的５１株淋球菌。ＮｓｐＡ抗原高度保守，能在菌体表面持续表达，且具有较强免疫原性，抗ＮｓｐＡ抗体有溶菌活性，是一个很具潜力的淋球菌疫苗候选抗原。
淋球菌的表面蛋白有多种，在淋球菌的生理和致病方面起着重要的作用。其中ＮｓｐＡ是淋球菌最具特征的外膜蛋白，形成一个由八条肽链组成的反向平行的Ｂ管状结构，在细胞外形成的环状结构构成了一个长的黏附区域，这个区域主要包括疏水残基和锚定分子，从而推测这个蛋白的功能可能是与疏水配体（例如脂质分子）结合。因此，疫苗的研究也可以以这种结构为基础¨…。
本研究运用分子生物学技术，在克隆淋球菌ＮｓｐＡ全长基因的基础上，成功地构建了淋球菌ＮｓｐＡ真核细胞表达载体ｐｃＮｓｐＡ，转染细胞后经ＲＴ—ＰＣＲ和免疫组化染色检测，表明ＮｓｐＡ基因能够在真核细胞中转录和表达，为进一步研究淋球菌ＮｓｐＡ基因疫苗在淋病预防中的作用奠定了一定的基础。
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［１０］ＬｕｃｙＶａｎｄｅｐｕｔｔｅ－Ｒｕｔｔｅｎ，ＭａｒｔｉｎｅＰ．Ｂｏｓ，ＪａｎＴｏｍｍａｓｓｅｎ，ｅｔａ１．ＣｒｙｓｔａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａｌＳｕｒｆａｃｅＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＮｓｐＡ），ａＣｏｎｓｅｒｖｅｄＯｕｔｅｒＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈＶａｃｃｉｎｅＰｏｔｅｎｔｉａｌ『Ｊ］．ＪＢｉ０１．Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（２７）：２４８２５＿．２４８３０．
［收稿日期］２００６－０２－０５［修回日期］２００６－０３－２７
?消息?陕西新桥医药有限公司
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