消毒剂消毒效力及有效期验证方案
消毒剂的选用原则：
目的：确认各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒、防止污染的目的，并在消毒剂有效期内能确保其消毒效力能符合要求。
范围：本验证方案适用于本公司洁净区的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、地漏、推车、桌椅等表面以及操作人员双手（手套）的消毒等。
1.参考文件
1.1.《医疗器械生产质量管理规范》
1.2.《中国药典》2015版第4部微生物限度检查法
2.概述
2.1.本公司的洁净区为D级，拟定用于洁净区表面消毒的有五种消毒剂：75%乙醇、%新洁尔
灭溶液、%新洁尔灭溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液。本次验证方案将选用
以上5种消毒剂分别进行验证试验。
作用对象一样的消毒剂每月轮换使用，避免表面微生物产生耐药菌株。在利用消毒剂进
行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于10分钟，利用消毒剂进行浸泡消毒
的不少于5分钟。
消毒剂的种类、消毒对象、消毒方法和有效期
2.2.为了确认消毒剂的消毒效力，通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证。其中，
用定量悬浮试验法和表面实验法进行实验室考察试验部分。
洁净区设施表面材质基本都是不锈钢和玻璃两种，故表面试验法选用不锈钢载片和玻璃
裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验。
两种试验方法作用的消毒剂见表。
现场考察试验部分选择车间(D级)的配液间、灌装间设备表面消毒前和消毒后分别进行取样，测定其微生物数量。
3.确认前准备
3.1.验证用试剂与材料
3.1.1.菌种
3.1.2.培养基
规格：：55mm，取样面积为25m2
3.1.3.消毒液拟定选用的中和剂
3.1.
4.稀释液
%无菌氯化钠溶液（NS）
3.1.5.器具及设备
3.2.验证用试剂与材料记录见附录1。
4.消毒剂消毒效力试验
4.1.中和剂鉴定试验
4.1.1.试验目的
通过该试验，确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用，对试验用菌剂及其恢复期培养示范有害或不良影响。
4.1.2.菌液的制备及计数
4.1.2.1金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌工作菌液的制备
接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24小时。取上述培养物用％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为1×108~5×108CFU/ml，可不再用％无菌氯化钠溶液稀释）。
计数时，将1×108~5×108CFU/ml的工作菌液10倍系列稀释成含50～100CFU/ml菌液，并同时采用营养琼脂培养基30～35℃培养2天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。
4.1.2.2白色念珠菌工作菌液的制备
接种白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，23～28℃培养24～48小时。取上述培养物用％无菌氯化钠溶液做10倍系列稀释成1×108~5×108CFU/ml 的工作菌液（如肉汤培养物的浓度已为1×108~5×108CFU/ml ，可不再用％无菌氯化钠溶液稀释）。计数时，将1×108~5×108CFU/ml 的工作菌液10倍系列稀释成含50～100CFU/ml 菌液，并同时采用改良马丁琼脂培养基23～28℃培养3天计数。计算该稀释级的平均菌落数，将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数。 4.1.3.
鉴定试验操作 4.1.3.1
配制75%乙醇、%新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液、40mg/L 的二氧化氯、60mg/L 的二氧化氯，具体操作执行《清洁剂和消毒剂管理》。将配置好的消毒剂置20℃±1℃恒温水浴锅中备用。 4.1.3.2
分组操作 试验分组及稀释操作方法简表
具体操作 第1组
目的：观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力。 操作：
取消毒剂+工作菌液，混匀作用10min 后，取混合液+稀释液，混匀作用10min ，取注皿，平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置23～28℃培养5天计数计数。 第2组
组号 混合液A
混匀作用 10min
混合液B 混匀作用 10min
取混合液B 或混合液B 的稀释级溶液平板计数（2皿/组） 取工作菌液加入下
列溶液中 取混合液 A 加入下列溶液 1 消毒剂 稀释液 混合液B 、10-1
2 消毒剂 中和剂 混合液B 、10-1
3 中和剂
稀释液 10-2
、10-3
4 中和产物（消毒液与中和剂比例为1:1） 稀释液 10-2
、0-3
5 稀释液
稀释液
10-2
、10-3
6
稀释液和中和剂各注入无菌平皿中，各制备2皿。
目的：观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长。
操作：
取消毒剂+工作菌液，混匀作用10min后，取混合液 +中和剂，混匀作用10min，用稀释液稀释成10-1。分别取未稀释溶液（混合液+中和剂的混合液）及10-1注皿，各平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于23～28℃培养5天计数。
第3组
目的：观察中和剂是否有抑菌性
操作：
取中和剂+工作菌液，混匀作用10min，取混合液 l+稀释液，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数计数。
第4组
目的：观察中和产物，或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。操作：
取消毒剂和中和剂1:1的混合液+工作菌液，混匀作用10min，取混合液 l+稀释液，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计。
第5组
目的：作菌落数对照用
操作：
取稀释液+工作菌液，混匀作用10min，取混合液 l+稀释液，混匀作用10min后，用稀释液进行10倍系列稀释成10-2、10-3。取相应稀释级注皿，各稀释级平行制备2皿。金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置30～35℃培养3天计数。
第6组
目的：作为阴性对照用
操作：分别取稀释液和中和剂各注入无菌平皿中，各制备2皿。
4.1.3.3结果判断
试验结果应符合下列全部条件，判断所选中和剂合格。
第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长。
第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、5组菌落数少，且符合下表要求
第1组平板平均菌落数第2组平板平均菌落数
0〉5
x〉(x+5)
y〉(y+
第3、4、5组有相似菌落数生长，其每组间菌落数误差率不超过15%。计算公式如
下：
（3组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和
误差率＝————————————————————————×100％
3×3组间菌落平均数
第6组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。
4.1.4.中和剂鉴定试验记录见附录2。
4.2.定量悬浮试验
4.2.1.试验目的
由于%的新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液、60mg/L二氧化氯溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液是通过浸泡或液封消毒，通过定量悬浮试验，确定其消毒效力是否符合要求。
4.2.2.试验操作
4.2.2.1配制%的新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液、60mg/L二氧化氯溶液、%醋酸氯己定溶液、%
醋酸氯己定溶液，操作执行《清洁剂和消毒剂管理》。将配置好的消毒剂置20℃±1℃恒温水浴锅中备用。
4.2.2.2由于%的新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试
验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。
%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。
4.2.2.3将菌液制备成1×108~5×108CFU/ml的工作菌液，菌液的制备及计数同。
4.2.2.4将试管按需要分组排列在试管架上，试验组分3组（4min、5min、6min各一组），并
由左向右逐管标明消毒剂、中和剂、10-1、10-2。对照组分1组，并由左向右逐管标明稀释液、中和剂、10-1、10-2、10-3、10-4。。
4.2.2.5向个试管加入相应的试剂，标明10-1、10-2、10-3、10-4。加入的稀释液。
4.2.2.6吸取工作菌液加入标明消毒剂的试管中，对照组加入标明稀释液的试管中，迅速混匀，
并开始计时。
4.2.2.7待菌液与消毒剂相互作用至8min、10min、12min，吸取菌液和消毒剂混合液，加入标
明中和剂的试管中，迅速混匀。
4.2.2.8中和作用10min后，吸取加入标明10-1的试管中，混匀后吸取加入标明10-2试管中（对
照组以此类推，对照组直至10-4）。
4.2.2.9试验组分别取中和剂管、10-1、10-2管溶液1ml按平皿法测定存活菌数；对照组取10-3、
10-41ml按平皿法测定存活菌数。每管平行制备2皿。
4.2.2.1金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基，倒置于30～35℃
培养3天计数；白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基，倒置于23～28℃培养5天计数。
4.2.3.结果计算
计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）4.2.4.可接受标准
杀灭对数值(KL)应不低于3~5个对数单位。
4.2.
5.定量悬浮试验记录见附录3
4.3.表面试验法
4.3.1.试验目的
由于75%乙醇、40mg/L二氧化氯溶液、%新洁尔灭溶液是通过擦拭消毒，故选用不锈钢载片和玻璃裁片进行表面试验法，确定其消毒效力是否符合要求。
4.3.2.菌种选择
由于75%乙醇、%新洁尔灭溶液中低效消毒剂，且不能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌。
%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液为高效消毒剂，能杀灭芽孢，故定量悬浮试验用菌枯金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、枯草芽孢杆菌。
4.3.3.工作菌液制备
工作菌液的制备方法、浓度及验证同步计数操作同。
4.3.4.试验操作
4.3.4.1（1）染菌不锈钢载片制备
将经灭菌的载片平铺于无菌平皿内，滴加金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌含菌量为1×108~5×108CFU的菌液，并均匀涂布于整个载体表面。滴染菌液后，载片置超净工作台晾干后备用。每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片。
（2）染菌玻璃载片制备
因培养皿的材质为玻璃，故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验。进行菌液滴染前，用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积（50mm×50mm），标注清晰。菌液滴染操作同染菌不锈钢载片制备。
4.3.4.2试验组：
将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上，消毒剂作用时间分别为8min、10min、12min，不锈钢载片和玻璃载片每个作用时间分别制备2个。作用结束后，用接触碟取样（接触碟规格：55mm，取样面积为25m2）。取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟（编号：BZW12085）；取样白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基接触碟（编号：BZW15129）。
接触碟取样方法：打开接触碟盖，使无菌培养基表面与取样面直接接触，均匀按压接触碟底板，确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触10秒左右，在盖上跌盖。
对照组
对照组的活菌浓度计数见。.
阴性对照：
用接触碟在已灭菌的载片上（未染菌片的载）按压取样，操作同上。每种载片及每种接触碟平行制备两份。
4.3.4.3培养
将取样金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌芽孢菌的接触碟倒置于30～35℃培养3天计数；取样白色念珠菌的接触碟倒置于23～28℃培养5天计数计数。
4.3.4.4结果计算
计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值:
杀灭对数值(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）4.3.4.5可接受标准
杀灭对数值(KL)应不低于3~5个对数单位。
4.3.
5.表面试验法记录见附录5
4.4.现场考察试验
4.4.1.消毒前对洁净区进行表面微生物取样。
取样地点：D级车间的配料间墙壁和设备表面、灌装间墙壁和设备表面、中间站墙壁表面。取样操作及检验执行《表面微生物检验》。
4.4.2.生产操作结束后操作人员按照《生产区清洁》对洁净区进行清洁消毒。
4.4.3.清洁消毒完毕15分钟后，现场QA对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物取样。
取样地点：固体车间（D级）的制粒间一墙壁和设备表面、小容量注射剂车间(C级)的配液间墙壁和设备表面、灌封间层流罩（A级）下设备表面。取样操作及检验执行《表面微生物检验》。
4.4.4.至少进行3次试验。
4.4.
5.可接受标准
消毒后：D级：50CFU/25cm2
4.4.6.现场考察试验记录见附录5
5.消毒剂有效期确认试验
5.1.试验目的
通过该试验，确定消毒剂在有效期内是稳定的，并且消毒效力不会变化，符合要求。5.2.试验操作
5.2.1.配制75%乙醇、%新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液。
操作与储存执行《清洁剂和消毒剂管理》。
5.2.2.在消毒剂储存的第0天、第6天、第7天、第8天、第28天、第30天、第32天取样
试验。
%新洁尔灭溶液、%新洁尔灭溶液、%醋酸氯己定溶液、%醋酸氯己定溶液试验操作同
定量悬浮试验。
75%乙醇试验操作同表面试验。
5.2.3.结果计算
计算试验组和对照组的活菌浓度（CFU/ml），并换算为对数值（N），并按下式计算杀灭对数值：
杀灭对数值(KL)＝对照组平均活菌浓度的对数值（NO）－试验组活菌浓度对数值（NX）5.2.4.可接受标准
在消毒液有效期末，杀灭对数值(KL)应不低于3~5个对数单位。
5.3.消毒剂有效期确认试验记录见附录6
6.附录列表