毕业论文——载体构建
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摘要 ................................................................................... 错误！未定义书签。1．前言 .............................................................................. 错误！未定义书签。
1.1研究背景 ............................................................... 错误！未定义书签。
1.2User fusion 技术简介............................................ 错误！未定义书签。
2.实验材料和方法.............................................................. 错误！未定义书签。
2.1SUR1启动子的克隆 ................................................ 错误！未定义书签。
2.2转化农杆菌 ........................................................... 错误！未定义书签。
2.3农杆菌侵染法侵染拟南芥...................................... 错误！未定义书签。
2.4Basta筛选转基因拟南芥 ....................................... 错误！未定义书签。
3.结果................................................................................ 错误！未定义书签。
3.1SUR1启动子User fusion克隆结果 ....................... 错误！未定义书签。
3.2启动子PCR产物与载体连接 .................................. 错误！未定义书签。
3.3大肠杆菌中SUR1启动子菌落PCR检测结果........... 错误！未定义书签。
3.4 SUR1启动子农杆菌的PCR检测............................. 错误！未定义书签。
3.5 Basta筛选结果 .................................................... 错误！未定义书签。
4.讨论......................................................................... 错误！未定义书签。参考文献 ............................................................................ 错误！未定义书签。致谢 ................................................................................... 错误！未定义书签。
摘要：
芥子油苷是一类十字花科植物所特有的硫代产物，芥子油苷代谢与植物防御反应密切相关，且某些芥子油苷的降解产物具有很高的抗肿瘤活性，因而其代谢及调控机制的研究备受关注。随着生物信息学的发展以及芥子油苷合成途径中相关基因的鉴定，SUR1基因参与硫苷生物合成模式三个阶段中硫苷核心结构的形成阶段，SUR1表达的C-S lyase SUR1 能将 S-烷基硫代烷肟转换成硫代肟基酸。本研究以模式植物拟南芥为实验材料。采用USER fusion，构建载体，农杆菌转化，GUS染色等方式，观察其表达模式，完成其组织定位，结果用以和其他已知的芥子油苷合成路径中的一些相关的基因进行表达上的对比，通过这中方式探讨SUR1基因在芥子油苷的合成途径中的功能意义，以及SUR1基因时空表达的特异性。
关键词：
芥子油苷,拟南芥,SUR1 ,USER fusion
Abstract: is a class of sulfur-containing secondary metabolism outcomes
specialized in Cruciferous plants. Glucosinolates have an important role in plant defense and some of the glucosinolates degradation products can prevent cancer in humans. Today, the researching about the glucosinolates metabolism and its biosynthesis regulation is under the spotlight. Along the development of bioinformatics and the demonstration of the new genes which involve the biosynthesize of glucosinolates,，SUR1 take part in the process Constructing the glucosinolate core,which can happen non-enzymatically, the produced
S-alkylthiohydroximates are converted to thiohydroximates by the C-S lyase SUR1。In this study，we use the model plant Arabidopsis as experimental
material,USER fusionconstruct vectors, Agrobacterium-mediated
transformation,GUS ,to observe expression pattern and complete its tissue localization.the results are usedand some other known mustard
oil glycoside synthesis route related gene expressioncontrast. the functional significance of the SUR1 gene in the biosynthesis ofglucosinolates this way SUR1 gene temporal and spatial expression specificity.
Key word
Glucosinolates , Arabidopsis thaliana , SUR1 , USER fusion
1前言
1.1 研究背景
硫代葡萄糖苷即芥子油苷简称硫苷，是一种含氮、硫的化合物。芥子油苷广泛
分布于16 个不同科的双子叶被子植物中, 它们分别是十字花科
( Brassicaceae) 、藜木科( Bataceae) 、钟萼木科( Bretschneideraceae) 、
白花菜科( Capparaceae) 、番木瓜科( Caricaceae) 、大戟科( Euphorbiaceae) 、环蕊科( Gyrostemonaceae) 、池花科( Limnanthaceae) 、辣木科(Moringaceae) 、瘤药树科( Pentadiplandraceae) 、商陆科
( Phytolaccaceae) 、海
桐花科( Pittosporaceae) 、木犀草科( Resedaceae) 、刺茉莉科
( Salvadoraceae) 、烈味三叶草科( Tovariaceae)和旱金莲科
( Tropaeolaceae)[1]。最主要是存在于十字花科植物中，十字花科植物中超过350 个属和3 000 个种都可以合成芥子油苷。是一种重要的植物次生代谢产物。芥子油苷既分布于植物的生殖器官( 花序、角果/果实、种子) , 也存在于营养
器官( 根、茎、叶) [2]。在同一植物中芥子油苷的含量和成分明显依赖于株龄[3, 4]和组织器官而发生变化。近年来，由于其在黑芥子酶作用下的分解产物
异硫代氰酸盐在人体抗癌方面的健康功效而不断受到大家的重视。增加食品中
的芥子油苷含量和充分发挥其分解物的生物有效性已经成为现今的一个研究热点。芥子油苷一般贮存于植物细胞液泡中，而芥子酶贮存于特定的蛋白体中，
一般情况下二者是分离的，当植物组织受到病原体或虫害侵袭时，细胞组织被
破坏，芥子酶与硫苷相遇，发生反应，将硫苷水解成异硫氰酸盐（Isothiocyanates）、硫氰酸脂（Thiocyanates）和腈类（Nitriles）等降解
产物[7]。硫苷及其降解产物能调节十字花科植物的生长素代谢，平衡体内的硫
元素，缓解硫素胁迫，保证植物正常生长发育，抵御病原体及虫害侵袭，此外，
还对癌症的发生起阻断作用。在植物防御与人类营养学上起着重要的作用，具
有很高的生物学价值与经济价值。
芥子油苷通常由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基团以及来源于氨基酸的侧链R
组成(图1) 。
目前至少有120种不同的结构被确定[ 5 ] 。根据侧链的氨基酸来源可以将芥子油苷分为脂肪族芥子油苷(侧链来源于甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸) 、芳香族芥子油苷(侧链来源于苯丙氨酸和酪氨酸)和吲哚族芥子油苷(侧链来源于色氨酸) 3个类群。
硫苷生物合成模式大致可分为三个阶段：氨基酸侧链的延长、硫苷核心结构的形成和葡萄糖配基侧链的二次修饰。硫苷的有无与含量的高低是由基因来控制的，相关的主要合成和调节基因参与硫苷合成的三个阶段。氨基酸或氨基酸侧脸延长筒源无可经由细胞色素P450(CYP450)家族的
CYP79s(CYP79subfamily)和NADPH催化转变为相应的肟。肟形成后被
CYP83s(CYP83subfamily)和NADPH催化产生不稳定的酸式硝基化合物或氧化氰。二者均可与硫供体——半胱氨酸结合，在谷胱甘肽硫转移酶作用下生成S-烷基硫代烷肟，之后在C-S裂解酶的催化下生成的硫代肟基酸经S—葡萄糖基转移酶的作用下，与活化硫酸盐的磺基结合形成芥子油苷的硫核心结构，该核心结构之后再需要经过羟基化、甲基化、去饱和化、磺化、葡萄糖基化等种种次级修饰形成不同的芥子油苷。
本研究所涉及的SUR1基因是在硫苷核心结构的形成阶段起重要作用：在硫苷核心结构形成的阶段中SUR1表达的C-S lyase SUR1 能将
S-alkylthiohydroximates（S-烷基硫代烷肟）转换成 Thiohydroximates（硫代肟基酸）[6]从而保证下一步反应的进行(见图2)。本研究旨在完成该基因的组织定位。
图2：脂肪族与吲哚族芥子油苷的生物合成路径
1.2 USER fusion技术简介
USER fusion技术的基础理论是依赖于PCR引物的使用，该引物包含一个12-nt 5’尾部中至少含有四个脱氧胸腺嘧啶核苷（Ts）被替换成脱氧尿苷（Us），之后PCR产物被尿嘧啶-DNA糖苷酶（uracil DNA glycosidase即UDG）处理，这
种酶可以选择性的切除尿嘧啶碱基，而保留磷酸二酯骨架的完好性，缺失的碱
基位点会使碱基互补配对不稳定。实验结果中，引物的3’突出端在退火过程中同样的在PCR扩增载体3’突出端互补配对。处理后的PCR产物和载体能形成一个可被转入一个不需结扎的大肠杆菌之中的稳定环状杂交产物。随着技术的发展，第二种酶被引入PCR产物的处理中——T4核酸内切酶V，可以在3’端破坏DNA 磷酸二酯骨架制造一个脱碱基位点。因此，UDG和T4内切核酸酶V连续作用在PCR产物中，与一个3’端含有单U残基的引物一起，可以有效地被用于克隆。商用公司通过一种简单的双酶处理法将两种酶混合到一起，称为USERTM enzyme mix，并作出一定程度上的优化改进。这种USER fusion技术被认为是一种高效率且通用性强的技术。[8]
2实验材料与方法
2.1 SUR1启动子的克隆
启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性，即启动子是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列，启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达的起始时间和表达的程度，本身不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因活动的。一般认为目的基因上游约2kb即包含目的基因启动子片段，由于所需克隆的片段较长，故选择USER fusion方法来克隆这段目的基因片段，这种方法通用性强，并且准确率和效率都比较高。
2.11 多聚酶链反应扩增
包含SUR1启动子全长cDNA的质粒模板，寡核苷酸引物序列从Invitrogen 公司购买，依照说明书使用PfuTurbo CX Hotstart DNA聚合酶行驶反应。所涉及引物序列见表一（A、B）
引物序列
SUR1启动子FP 5′---GGCTTAAUTATTGCATTGCTACTTTGTGGTT----3′
SUR1启动子RP 5′---GGTTTAAUCTTCTCTCTGTGCTTTGAGTTCTT---3′
表一（A）SUR1启动子引物
引物序列
SUR1启动子fusion FP1 5’---ATCTGGUATTAACTTGAAACTTTCACACTTCT----3’SUR启动子fusion RP1 5’---ACCAGAUTTTCATTACTTTCATTTAAAGTTCG----3’SUR1启动子fusion FR2 5’---ATAGTCUAAAAATAGAAATTTGTTGACCAAG----3’SUR1启动子fusion RP2 5’---AGACTAUGGGTGCAAATGTTGTTTG----3’
表一（B）SUR1启动子USER fusion 引物
2.12 DNA纯化
根据厂家说明书用QIAquick PCR纯化工具对PCR产物进行柱相纯化，纯化产物以原体系的三分之一的蒸馏水进行洗脱。
2.13 纯化的PCR产物与预备载体的结合
等体积的纯化PCR产物连同等体积的带有PacI/Nt.BbvCI的预备载体pCambia3300一起，于琼脂糖凝胶上进行跑胶，通过条带亮度分析相对浓度，决定混合配比3:3:3:1 。
2.14 用USERTM enzyme mix处理
一微升10 TE buffer【100mM Tris-HCl, 1mMEDTA (pH 8.0)】、1U 的 USERTM enzyme mix(1U/μL)加到8 μL预备载体和PCR纯化产物的混合物，反应在37℃的温度下孵育20分钟，接着在25℃的条件下反应20分钟，预备载体在反应混合物中的量大概占 0.01 pmol.
2.15 转化
全部10μL的反应混合物与50μL感受态大肠杆菌细胞进行热激反应
2.16 质粒的准备与限制性分析
依照厂家说明书，使用GenEluteTM 质粒小量制备工具，4ml过夜培养，
被纯化的质粒用50μL的水洗脱，在一个20μL包含1 NEB Buffer 2[50mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 10mM MgCl2, 1mM dithiothreitol (pH 7.9)]和100μL/ml BSA 的反应体系中每两微升质粒用10U的SpeI,37℃条件下切割2小时。
在含有卡那霉素固体培养基中筛选，PCR和酶切鉴定重组质粒，取阳性克隆菌落。
载体示意图如图3
图3：载体示意图
所构建载体为二元载体，Basta为在植物体中的筛选标记，Kana为菌体中的筛选标记。所连接的GUS基因用于后续组织定位之用。
2.2 转化农杆菌
重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2 500 kV／em；电容25 F；电阻500 Q。电击3～5 ms后，取出电击杯，迅速加入800 L的LB液体培养基，混匀并转移至1．5 mL的EP管中，在28℃震荡培养3 h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培养24 h，即可长出阳性克隆。
阳性克隆的菌落PCR与酶切鉴定。随机挑取单菌落，在装有1 mL的LB和1．5 mL的抗生素的离心管中28℃培养12 h左右。取5O L培养物，煮沸5 rain，5 000 r／rain离心2 min，取1～2／,L上清进行PCR扩增后电泳检测。选取菌落PCR验
证后的菌液抽提质粒，并用BstE 1I和Bgl 1I双酶切后，电泳检测。
2.3 农杆菌浸染法侵染拟南芥
前期准备：
取150ml 含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，
大摇过夜至培养基由红色转为黄色。将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌
的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min弃上清，加入50ml 1／2 MS，将
菌泥搅起。
用于侵染的1／2 MS配方：（每150 ml菌液加50 ml 1／2 MS液）
MS大量 5 ml
蔗糖10 g
水95 ml
表面活性剂20 ul
常用1／2 MS配方（1 L）：
10X大量元素50 ml
100X微量元素 5 ml
100X铁盐 5 ml
蔗糖（1%）10 g
琼脂粉8 g
拟南芥生长土壤：
腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟
注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵
放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。
种子消毒：
30%H2O2+85%乙醇1:4混合
取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1
／2 MS平板上。4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。16\8 光
周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。
后续操作
1 种植健康的拟南芥直到开花。在种子种下后浇水盖膜，盖膜的目的是为
了保持水分。移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜。
2 初次开花时将花蕾剪掉以促进更多花枝的增生，修剪后越4至5天可使用，
这样优化后的植物含有很多未成熟的花序并没有很多受精的角果，以保证大多
数植物被成功的转化。
3准备携带目的基因在双元载体（双元载体有两套筛选引子，菌体中用一种，植物中用一种）里的农杆菌菌株。养殖在一个大的液体LB培养基中，培养
基带有抗生素，以为筛选二元质粒。
4 摇床摇农杆菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性剂，达到浓度0.05%）混悬到OD600 = 0.8（左右）把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入
大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵
染之前一晚上最好给钵子里浇些水，以免第二天侵染后钵子里的土容易掉出来），侵染后用滤纸擦干。
5 侵染后的拟南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时后继续光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。一周后可再侵染一次，这是由于拟南芥的盛
花期较长，一般要侵染2—3次。
6 浇水松土正常养殖，种子成熟后停止浇水。
7 角果自然开裂后收获干燥的种子，独立分装备用。
2.4 Basta筛选转基因拟南芥
收获后的干燥种子经表面消毒，放于4℃冰箱，春化4天后，播种于培养土中，待长出2片真叶后，喷洒1：1 000的Basta除草剂进行筛选。设计特性引物，
采用RT_PcR方法对具有Basta抗性的拟南芥转基因植株进行鉴定。
3 实验结果
3.1 SUR1启动子USER fusion 克隆结果（图4）
SUR1启动子分割成三段的PCR扩增结果凝胶电泳图，Marker均为2000bp,
从上至下依次为：2000、1000、750、500、250、100
M
SUR1启动子第一段
M
SUR1启动子第二段
M
SUR1启动子第三段
图4：扩增条带显示，SUR1启动子克隆第一段约800bp左右，第二段越600bp左右，第三段越600bp左右，三段合约2000bp，所得片段与预期一致。
3.2 启动子PCR产物与载体的连接
通过条带亮度计算出连接体系
总体系12 ul
1 ul 4号酶切质粒
3 ul SUR1启动子第一段
3 ul SUR1启动子第二段
3 ul SUR1启动子第三段
1 ul USERTM enzyme
1 ul 无菌水
3.3 大肠杆菌中SUR1启动子菌落PCR检测结果
经卡那霉素筛选，得到阳性克隆，对其进行菌落PCR检测。
M 1 2 3
图5：Marker为2000bp,从上至下依次为：2000、1000、750、500、250、100 1号为空白对照，2、3号为挑取的单菌落。3号菌落经电泳结果显示为假阳
性。
SUR1启动子
图6：重组质粒构建示意图
为印证连接正确并成功导入大肠杆菌，SUR1启动子的第二段出于连接的中心，对SUR1启动子第二段进行PCR扩增，如未被导入或连接错误能得不到与之前（图5）一致的结果，所得结果约600bp，与之前图5结果一致，证明三段启动子均被转入并连接正确。
对重组质粒进行测序，结果表明编码序列与预期一致。
3.4 SUR1启动子农杆菌的PCR检测
对上述测序过的大肠杆菌进行提取质粒，重组表达载体导入农杆菌，挑取阳性菌落对其进行菌落PCR凝胶电泳，扩增SUR1启动子的第二段，原理同结果3.3。
M 1 2
图7：M为Marker，2000bp,从上至下依次为：2000、1000、750、500、250、100 1、2为挑取的单菌落
结果表明大小约600bp，与预期结果相符，证明重组表达载体成功转入农杆菌中。
3.5 Basta筛选结果
用浓度为1：1 000的Basta除草剂喷洒四叶期的幼苗进行筛选，未转化成功的幼苗由于不含抗Basta除草剂基因而枯萎变黄被杀死；成活的即为转化成功的幼苗。
(A) (B)
图8 进行Basta筛选之前
（A）为转基因幼苗，（B）为野生型空白对照
（A）（B）
图9 进行Basta筛选之后
（A）为转基因幼苗，（B）为野生型空白对照
可以看出，（B）组野生型全部被Basta杀死，枯萎变黄，（A）组部分幼
苗由于未被转化成功，不含抗Basta基因，遂也被杀死，枯萎变黄。剩余
有Basta抗性即存活下去者即为被转化成功的幼苗。
4讨论：
本研究利用了USER fusion技术以拟南芥基因为基因模板克隆出SUR1的启动子基因，并选用pCambia 3300 为载体，成功的将SUR1启动子构建到CAMV35S启
动子的下游，通过大肠杆菌转化农杆菌、农杆菌侵染植物等步骤将下游连接GUS 基因的SUR1启动子转入拟南芥中，对其进行组织定位的研究。转录的起始，是
基因表达的关键阶段，影响基因表达的水平，一般认为目的基因上游约2kb即包含目的基因启动子片段，由于所需克隆的片段较长，本研究选用USER fusion技术来完成这段目的基因的克隆。USER fusion是一种快捷而高效的方法，可以同时对复杂的PCR产物进行融合和克隆。由于本研究所涉及的SUR1启动子，所需克隆的基因长度达2000bp，对这种长度的基因，传统的PCR方法难以克隆出准确的目的基因，并且酶的效率也会变低。但通过USER fusion技术将片段分割成三部分同时分别克隆并在融合酶的作用下按原序列融合在一起。从而得到了较长目
的基因——SUR1启动子的克隆产物。USER fusion是一种简单、快速、高效的技术，用以一步完成合成和克隆多重PCR产物到载体之中。大大的节约了时间并提高了实验的准确性，为后续实验的进行提供了优越条件。
SUR1组织定位的意义
和其他已知的芥子油苷合成路径中一些相关的基因的表达特异性进行对比，可以清楚的了解SUR1基因在芥子油苷合成途径中的功能意义，以及SUR1基因时
空表达的特异性。由于时间并未进行到对其的GUS染色处理，进一步的实验分析将在后续实验中继续进行讨论。
5参考文献
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致谢：
感谢全体实验室同仁！李晶导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论文从选题到完成，每一步都是在李晶导师和师兄孔稳稳的指导下完成的，倾注了大量的心血。在此，谨向导师及师兄表示崇高的敬意和衷心的感谢! 本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此表示深深的感谢。