阿司匹林对肿瘤坏死因子α诱导的大鼠平滑肌细胞蛋白及丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

阿司匹林对肿瘤坏死因子-α诱导的大鼠平滑肌细胞syndecan-4蛋白及

p44/42丝裂原活化蛋白激酶表达的影响

作者：罗烨， 欧阳平， 赖文岩， 贝伟剑， 许顶立， LUO Ye， OUYANG Ping， LAI Wen-yan， BEI Wei-jian ， XU Ding-li

作者单位：罗烨,欧阳平,赖文岩,许顶立,LUO Ye,OUYANG Ping,LAI Wen-yan,XU Ding-li(南方医科大学南方医院心血管内科,广东广州,510515)， 贝伟剑,BEI Wei-jian(广东药学院中医药研究院,广东广州,510006)

刊名：

广东药学院学报

英文刊名：Journal of Guangdong Pharmaceutical College

年，卷(期)：2012,28(1)

本文链接：https://www.wendangku.net/doc/139654585.html,/Periodical_guangdyxyxb201201023.aspx

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验 实验准备： 细胞，24孔板，transwell小室（8μm，24孔板专用），ECM Gel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头，1.5 mL EP 管，冰盒 实验设计： 实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。 实验操作（请细读注意事项）： 一、细胞侵袭实验 1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。 2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。 3.根据自己的使用量，按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使 用液。 4.把枪头剪去一小段（约3 μm）后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel使用液轻轻 加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。 5.放在37 ℃孵箱15 min，让胶凝固。 6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞， 制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。 7.按照每孔200 μL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加 入10%FBS+培养基500 μL，放入37 ℃孵箱培养。 8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒 在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。 9.在上室中加入结晶紫染液，染色5 min，回收染液，用流水缓缓冲去染液， 再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。 10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。 11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。

细胞外信号调节激酶_丝裂原激活的蛋白激酶细胞信号转导通路与类风湿关节炎研究现状

?４３０?生垡凰邂煎堂鏊壶垫！Ｑ生鱼星笙ｊ生鲞笔鱼塑￡ｈｉ出ｈ些塑蛔ｌ，ｊ坠卫！婴！Ｑ，ｙ丛！！生盥Ｑ：§ 细胞外信号调节激酶／丝裂原激活的蛋白激酶细胞信号 转导通路与类风湿关节炎研究现状 胡佳亮黄清春陈秀敏 在细胞生命活动的过程中，不同的细胞相互问通信协调，将外界的信号传递至效应细胞胞内，启动特定的生理功能。传递信号的通路种类繁多，有其各自功能，也互相交义影响，而细胞外信号调节激酶（ｅｘｔｒａｅｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ“ｎａｓｅｓ，ＥＲＫ）通路就是将细胞外信号传递至细胞内的信号通路之一。 ＥＲＫ通路的主要生物学功能是促进细胞的分化和增殖，并参与炎症和应激等反应。而以滑膜增生和血管翳形成为主要病理表现的类风湿关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ），其病理过程和ＥＲＫ通路的活动有着千丝万缕的联系．蹦此该通路在ＲＡ中的作用机制逐渐受到莺视，百ｒ能成为明确疾病病理和研发相关治疗药物的莺要领域。 １细胞信号转导通路 在多细胞牛物体内。信息在非直接接触的细胞之间传递需要借助于信号分子的作用。信号分子与相心的受体结合后引起效应细胞内的信号转导蛋向或第二信使水平的变化。从而启动相关的基冈转录或细胞分化、分裂、增殖。 根据所在位置的不同，受体一般可分为胞质，核受体与表面，膜受体。膜受体一般可以分为３大类：离子通道型受体、Ｇ蛋门耦联受体和酶耦联受体。酶耦联受体则叮分为４类，其中激活Ｒａｓ—ＭＡＰＫ通路和Ｐ１３Ｋ通路的主要是受体酪氨酸激酶（ＲＴＫｏ但是受体激活的下游信号通路并不绝对，例如Ｇ蛋一耦联受体、离子通道型受体也ｎｒ通过相关机制如信号通道的交互通话（ｃｍ鹪一ｔａｌｋ）激活ＥＲＫ通路。 ２ＭＡＰＫ信号转导通路 ＥＲＫＩ／２通路属于丝裂原激活的蛋白激酶（ＭＡＰＫ）通路系统，也是其中得到研究最早、最系统和透彻的，因为Ｒａｓ是该通路．ｉ级酶链反应最上级ＭＡＰＫＫＫ（Ｒａｔ＂）的主要激活因子．故也将这类三级酶链的信号转导系统称为Ｒａｓ—ＭＡＰＫ通路。 ２．１ＭＡＰＫ通路的分子生物学特征：ＭＡＰＫ通路在生物进化中高度保守，广泛存在于从酵母到人的各种真核细胞生物，其最明显的特点是有３个级联激活的激酶依次传递信号．按被激活的顺序称为丝裂原激活的蛋自激酶激酶激酶ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００７—７４８０．２０１０．０６．０１９ 基金项目：中国博士后科学基金（２００７０４２０１４０）：全军医学科学技术研究“十一五”计划面上课题项目（８类）（０６［Ｂ１６１） 作者单位：５１００１０广州军区广州总医院风湿免疫科（第一作者现为广州中医药大学在读研究生） 通信作者：黄清春（ＭＡＰＫＫＫ／ＭＫＫＫ）。丝裂原激活的蛋白激酶激酶（ＭＡＰＫＫ／ＭＫＫ）．丝裂原激活的蛋ｎ激酶（ＭＡＰＫｏ上游激酶ＭＫＫＫＫ、小Ｇ蛋白家族成员Ｒａｓ、Ｒｈｏ，寡聚化等上游闪素可卣接激活ＭＫＫＫ而肩动该通路。ＭＡＰＫ家族的激酶在激活过程中依赖其共同的结构特征，即其磷酸化位点的三肽模体苏氨酸（１１１ｒ）一ｘ一酪氨酸（Ｔｙｒ），其中ｘ在ＥＲＫ通路是谷氨酸（Ｅ），Ｐ３８通路是＂氨酸（Ｇ），ＪＮＫ通路是脯氨酸（Ｐ），Ｔｈ卜Ｘ—Ｔｖｒ模序的双磷酸化使得ＭＡＰＫ途径得到激活。一些被激活后的Ｆ游底物可射通路产生负反馈调节作用，而一磐特异性磷酸酶（ＭＫＰｓ）对“Ｔｈ卜Ｘ—Ｔｖｒ，’模序的去磷酸化则导致ＭＡＰＫ的失活。２．２ＭＡＰＫ通路的家族成员构成：ＭＡＰＫ信号转导通路家族成员之间具有较高的问源性。在空间结构上也十分相似，可以分为几个亚族，早在１９９９年统计就已经鉴定出１４种ＭＫＫＫ，７种ＭＫＫ和１２种ＭＡＰＫ，近年来陆续发现了ＥＲＫ７，ＥＲＫ８等新的ＭＡＰＫ及其上游激酶，根据２００８年的统计发现的ＭＫＫＫ则更是达到了２１种。最Ｊ：游ＭＫＫＫ中最早得到研究的是与细胞生长和增殖有关的Ｒａｆ激酶，另有以激活Ｐ３８通路和ＪＮＫ通路为主的ＭＥＫＫ！．４等激酶；处于级联中游的ＭＫＫ目前得到研究的则主要为ＭＥＫＩ．７；而最下游的ＭＡＰＫ则分为ＥＲＫ、Ｐ３８和ＪＮＫ／ＳＡＰＫ３组成员。 ＥＲＫ／ＭＡＰＫ激酶是研究最为透彻的信号通道激酶。也是３个通路中发现成员最多的。以ＴＥＹ三肽模体构成的磷酸化位点为特征。除外得到深入研究的ＥＲＫ１／２以外，还有主要存在细胞核的ＥＲＫ３，通过Ｒａｓ依赖件通路被激活的ＥＲＫ４。被称为大ＭＡＰＫ通路（ＢＭＫＩ）的ＥＲＫ５，来源于同一基因Ｍａｐｋｌ５分属于大鼠和人类的ＥＲＫ７和ＥＲＫ８。这条通路主要受生长因子和其他丝裂原信号调控，也能被一些炎性细胞闲子和细胞应激激活。而以ＴＧＹ为特征磷酸化位点的Ｉ＇３８通路主要参与细胞的麻激、凋亡和免疫调控；以ＴＰＹ为磷酸化位点的ｃ－－ＪｕｎＮ端激酶／应激激活的蛋白激酶（ＪＮＫ俗ＡＰＫ）通路则主要受炎性细胞因子、感染和应激激活，在免疫应答和胚胎发育中具有重要作用。此外尚有ＮＬＫ（Ｎｉｍｏ—ｌｉｋｅｋｉｎａｓｅ）、ＭＯＫ（ＭＡＰＫ／ＭＡＫ／ＭＲＫｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｋｉｎａｓｅ）等研究较少的类ＭＡＰＫ信号转导通路，它们与ＥＲＫ２有着３０％，４５％的同源性，执行着诸如下调Ｗｎｔ信号等功能。 各种上游激酶和下游底物之间既有特异性。又有相互交叉调节．通过其特异性的结合位点、特定的细胞内空间分布，不同的作用时问以及和其他信号通路的交互通话等可能的方式．对大量的外界刺激产生特异性的应答。 万方数据

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)说明书

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)水平。用纯化的小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：135U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/

Transwell侵袭实验全面总结

Transwell侵袭实验全面总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1．Transwell trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable support s）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（T ranswell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有－μm，根据不同需要

可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。下图是一个Trans well装置的纵切面 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养 液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择μm以下孔径。常用、μm。我们实验室用的是μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)说明书活性

小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）水平。用纯化的小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），再与HRP标记的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性浓度。 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA、者柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后， 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中 如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为18 U/L，12 U/L ，6 U/L，3 U/L，1.5 U/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

细胞周期调控的研究进展(精)

细胞周期调控的研究进展 高燕,林莉萍,丁健 * (中国科学院上海生命科学研究院药物研究所,国家新药研究重点实验室, 中国科学院研究生院,上海 201203 摘要 :细胞周期是一种非常复杂和精细的调节过程,有大量调节蛋白参与其中。此过程的核心是细 胞周期依赖性蛋白激酶 (CDKs。 CDKs 的激活又依赖于另一类呈细胞周期特异性或时相性表达的细胞周期蛋白 (cyclins,而 CDKs 调节的关键步骤是细胞周期检查点。 PLKs 是多种细胞周期检查点的主要调节因子, Aurora 蛋白激酶主要在细胞有丝分裂期起作用。本文就上述因素在细胞周期进程中的作用作一综述。 关键词 :细胞周期;调控;细胞周期检查点中图分类号:Q253文献标识码:A A review: cell cycle regulation GAO Yan, LIN Li-Ping, DING Jian* (State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Shanghai Institues for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

Abstract: The cell cycle is a complex and elaborate process involving numerous regulatory proteins as directors.Central to this process are the cyclin-dependent kinases (CDKs, which are activated in a cyclin-dependentmanner at special points of the cell cycle. Cyclin protein levels rise and fall during the cell cycle and in the waythey periodically activate CDKs. Furthermore, the cell cycle checkpoint is also discussed as a key process inthe regulation of CDKs. PLKs are important mediators for various cell cycle checkpoints, while Aurora kinaseshave emerged as essential regulators of cell division. Here, we reviewed the effects of above factors on cellcycle regulation. Key words: cell cycle; regulation; cell cycle checkpoint 收稿日期 :2005-01-22; 修回日期 :2005-03-09 作者简介 :高燕 (1974— ,女,博士研究生;林莉萍 (1962— ,女,博士,副研究员;丁健 (1953— ,男, 研究员,博士生导师, *通讯作者。 文章编号 :1004-0374(200504-0318-05 1概述 细胞周期是指一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂的结束 , 细胞由一个分裂为两个子细胞。细胞的分裂由两个连续的过程组成, 即 DNA 复制及染色体的分离。一个细胞周期包括准备阶段的间期和有丝分裂期 (图 1 。间期包括 G 1、 S 和 G 2期。 G 1期时,细胞为遗传物质 DNA 的合成作准备,而 DNA 的合成是在 S 期完成。 G 2期主要完成蛋白质的合成,为细胞进入有丝分裂期作准备。有丝分裂期 (M期又分为前期、中期、后期和末期,以完成染色体的凝集,中心粒移至细胞核对立的两极,核仁解体,核膜消失 (前期 ; 纺锤体形成和染色体排列于其间 (中期 ; 姐妹染色单体分开并移向两极 (后期 ; 子核形成和胞质分裂 (末期。另外, G 1期的 319

肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

抗肿瘤药物5氟尿嘧啶对肿瘤细胞 迁移的影响 欧阳学文 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官，长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细

胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力，核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时，往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。

不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶和细胞外调节蛋白激酶表达的影响

不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶和细胞外调 节蛋白激酶表达的影响 目的观察不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶（MEK）1/2和细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2表达的影响，探讨隔姜灸治疗脾虚证的可能作用机制及量效特征。方法将75只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、隔姜灸3壮组、隔姜灸6壮组、隔姜灸9壮组，每组15只。200%大黄浓缩液4 ℃灌胃制作脾虚证大鼠模型。造模成功后，隔姜灸组选取“足三里”“中脘”予不同灸量治疗，连续8 d。HE染色镜下观察大鼠胃组织病理学改变，免疫组化检测大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达。结果与空白对照组比较，模型组大鼠胃黏膜损伤明显，可见较大的破损、脱落；与模型组比较，隔姜灸3壮组大鼠胃黏膜表面有部分脱落、破损情况改善，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组大鼠胃黏膜表面较完整、脱落及破损明显改善。与空白对照组比较，模型组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，隔姜灸各组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白明显表达升高（P＜0.01）；与隔姜灸3壮组比较，隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高（P＜0.01），但二者作用效果相当，差异无统计学意义（P>0.05）。结论隔姜灸通过提高胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达，激活MEK/ERK信号转导通路，进而促进脾虚证大鼠胃黏膜的修复。 Abstract：Objective To observe effects of different dosages of moxibustion with ginger-separated moxibustion on expressions of mitogen extracellular kinase （MEK）1/2 and extracellular regulated protein kinase （ERK）1/2 of gastric tissue in rats with spleen deficiency；To explore the possible mechanism and the dose-effect relationship. Methods Seventy-five SD rats were randomly divided into blank control group，model group，ginger-separated moxibustion for three zhuang group，six zhuang group and nine zhuang group according to random digits table method，with fifteen rats in each group. The rat model of spleen deficiency was established by intragastric administration with 200% Rhei Radix et Rhizoma infusion at 4 ℃. Ginger-separated moxibustion groups were treated with different dosage of moxibustion at “Zusanli”，“Zhongwan” for eight days after the modeling. Pathological changes of gastric tissue by HE staining were observed under light microscope，and immunohistochemistry was used to detect the expressions of MEK1/2 and ERK1/2 protein in gastric tissue of rats. Results Compared with the blank control group rats，the gastric mucosa injury in the model group was obvious，which showed that the damage and abscission was more serious；compared with the model group，the gastric mucosa of rats was partly exfoliated and the damage was improved in three zhuang group，and the surface of gastric mucosa of rats was more complete and damage was improved obviously in six zhuang group and nine zhuang group；compared with the blank control group，the expressions of MEK1/2 and

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料

肿瘤细胞侵袭实验(Tumour Invasion Assay)

肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay ） 肿瘤细胞侵袭实验（TumourInvasionAssay ）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 实验方法原理 Matrigel 是从小鼠EHS 肉瘤中提取的基质成分，含有LN 、IV 型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM 培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um ，而且膜孔都被Matrigel 覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel 的滤膜放在以Blind Well 腔或MICS 腔上下室之间，铺有Martrigel 面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN 、FN 或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel 的用量有关，选择 25ugMartrigell 铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE 染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel 的细胞数。另外用Transwell 小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell 小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel ，加入细胞72h 后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll 腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel 而直接将8um 孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN 或FN 或在滤膜下表面铺上LN 或FN ，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验材料 Matrigel 基质胶试剂、试剂盒 DMEM 结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM 培养基FBS-DMEM 培养基IFN-γ仪器、耗材 24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒实验一、溶液配制

肿瘤学研究常用实验技术及方法

肿瘤学研究常用实验技术及方法复习题 1.表观遗传的科学内涵 三个特点？ a)基因功能完全、稳定地丧失，有遗传性； b)细胞外环境长期作用的结果，有可逆性； c)分析方法灵敏，可检出少数细胞的变化 2.变性高效液相色谱(DHPLC)技术在肿瘤研究中的应用 DHPLC 的主要应用？ Separation of DNA, MSI, LOH, STRs, Q-PCR, detection of mutation , SNPs, oligos, RNA. 3. 蛋白质分离纯化及鉴定 i.分离纯化蛋白质的方法有哪些？ 盐析，透析，离心，凝胶过滤（分子筛）层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相层析。 ii.等电聚焦电泳（IEF）与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）有何不同？ 等电聚焦电泳：利用蛋白质分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。 SDS-PAGE:蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子，所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量，从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异。在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以 说是取决于蛋白质分子量的大小，而与蛋白质原来所带电荷量无关 iii.两种等电点相近的，分子量相差较大的蛋白质应该首选那种分离方法？SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 iv.蛋白质印迹（Western Blotting）过程中应注意的事项有哪些？ 1.丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时一定要注意 防护。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶时，小心防止凝胶渗漏。 3.蛋白加样量要合适，加样量太小，条带不清晰，加样量太大，则泳道超 载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进

肿瘤细胞侵袭和迁移研究的实验技术改进 【摘要】肿瘤的基础研究一直是医学类研究的热点，研究者发现恶性肿瘤细胞具有高度侵袭和迁移的特性，对于侵袭和迁移特性的研究具有现实指导意义，而实验技术是基础研究中重要的一个环节，本文针对研究肿瘤细胞侵袭和迁移的几种常用实验技术，提出相应的改进建议。 【关键词】肿瘤；侵袭；迁移；实验技术 肿瘤的治疗一直是生物医学类研究很重要的一部分，恶性肿瘤成为威胁人类健康和生命的主要疾病之一，近些年来，我国及全世界的恶性肿瘤发病率和死亡率都呈上升趋势。近年来肿瘤相关研究取得了很大的进展，但恶性肿瘤具有的高度侵袭和迁移特性成为肿瘤治疗失败的主要原因之一，因此肿瘤细胞的侵袭和迁移是抗肿瘤研究中的热点。 1.检测肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的常用实验技术 基础研究对临床工作有着推动作用，注重基础研究不仅利于提高医务工作者的素质，并且利于开展交流合作，推动行业发展，肿瘤疾病治疗的研究工作最终还是要从基础研究做起。实验技术对于基础研究的发展有着至关重要的作用，实验技术的发展推动基础研究的进步。研究肿瘤细胞侵袭和迁移特性时，常用的实验技术有Western blot、免疫组化、Transwell小室测定法、划痕实

验等，对这几种实验技术进行优缺点分析能够为科研工作者提出建议，让科研工作者在研究过程中少走弯路，具有一定的现实意义。 1.1检测肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白 肿瘤细胞侵袭和迁移相关蛋白有CD147、MMP-2、MMP-9、VEGF 等。CD147是免疫球蛋白家族中一个高度糖基化的跨膜蛋白，能够调控MMPs的表达，刺激MMP-2、MMP-9的产生，MMP-2、MMP-9能降解细胞外基质的蛋白成分，并且诱导VEGF的产生，促进血管的生成，在恶性肿瘤的侵袭和转移中起关键性作用。研究证实，这些蛋白的表达水平都与肿瘤细胞的恶性程度、肿瘤的侵袭和迁移有着密切的联系，通过实验来检测蛋白的表达水平，一定程度上可了解肿瘤细胞的侵袭和迁移特性。 在基础研究中，通常可以通过Western blot来检测侵袭和转移相关蛋白的表达水平，从而确定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性是否存在差异，这种方法一定程度上是可以让研究者间接了解肿瘤细胞的侵袭性和迁移性的变化，并且Western blot的方法可以量化蛋白的表达水平，但缺点是检测蛋白表达水平对于判断侵袭性和迁移性不够直观，实验步骤较为复杂，抗体和蛋白的亲和力存在差异，并且抗体价格相对比较昂贵，因此此方法存在一定的局限性。 1.2Transwell小室测定法 Transwell小室测定法可用于测定肿瘤细胞的侵袭性和迁移性，

细胞周期调控蛋白MPF的研究

细胞周期调控蛋白MPF的研究 第三节细胞周期调控的分子机理一、MPF的生化本质、活性调节及其功能MPF(卵细胞促成熟因子，matuation-promotingfactor;细胞促分裂因子，mitosis-promoting factor;M期促进因子，M-phase-promoting factor)。 Johnson和 Rao1970将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体prematurely condensedchromosome，PCC。不同形态的PCCG1期PCC为单线状，因DNA未复制;S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制;G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。人M期细胞与袋鼠 (Ptk)G1、S、G2 期细胞融合诱导 PCC:提示M期细胞存在诱导PCC的因子; 不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子maturation promoting factor，MPF。1971年， Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出MPF的概念 ? ? ? 注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中，含有 Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射卵母细胞成熟的因子，称做 MPF1979年， 到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子MF。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。在此后20年里，许多学者致力于MPF的提纯，试图揭示MPF的生化本质。第二个研究领域是为了弄清楚细胞周期调节基因，遗传学家们利用裂殖酵母和芽殖酵母温度敏感突变

肿瘤细胞迁移实验(细胞划痕法)讲义

抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 （细胞划痕法） 实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤最基本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官， 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发瘤。 图1肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤最初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力， 核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即 所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时， 往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培

养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α以及其他化学药物。 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后， 由于药物的作用使细胞迁移受到抑制(B)，而未加入药物的细胞保持了原有的迁移能力，在 一段时间后通过迁移将划痕掩盖(C)。 A B C 图2实验结果（A表示在单层细胞上划出的一道痕；B表示加入抑制剂，为阳性对照组； C 表示未加入抑制剂，为阴性对照组） 一、实验目的 1．了解肿瘤细胞转移的基本原理

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验(ｃell ｍｉgratiｏn ａssay) 实验介绍?细胞迁移与侵袭实验将Traｎswell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。 1材料准备:?可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Ｃoｓter与实验步骤:? Corning公司得也较常用),Ｔrａnswelｌ迁移实验得细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买得Trａnｓwｅｌl小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清ＤMＥM,(1%胎牛血清)ＤMEM与1640培养基,ＤMEM完全培养基,１6４0完全培养基(也可加到20%血清),无菌P ＢＳ,棉签,胰酶,４％多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1％(g/ml)PBS结晶紫)?2步骤与流程?2。1基质胶铺板: 用BＤ公司得Mａｔｒigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Ｔraｎswell小室底部膜得上室面,置3７℃30min使Ｍaｔrigeｌ聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。?２、2制备细胞悬液?①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。但这一步并不就是必须得、 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用ＰBS洗1－2遍),用含ＢSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×10５/ml。?２。3接种细胞 ①取细胞悬液１00μl加入Trａnｓwelｌ小室、?②24孔板下室一般加入600μl含20％ＦBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。?③培养细胞:常规培养12-４８h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。２４h较常见,时间点得选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目得影响也不可忽视、?2、４结果统计 直接计数法,“贴壁"细胞计数,这里所谓得“贴壁”就是指细胞穿过膜后,可以附着在膜得下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞、 取出Ｔｒanｓｗelｌ小室,弃去孔中培养液,用无钙得PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。?0、1%结晶紫染色２０mｉｎ,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用ＰBS洗3遍。?４00倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。 实验材料 (１)Tｒａnｓwell ｃhamber: 24—ｗell, 8。０-μm porｅ meｍｂranes (C ｏｒning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%ＥＤTA (３)固定液:甲醇 (４)染色液:Giemsa染液 (5)封片剂:中性树胶 (６)其她:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片 操作步骤