转基因动物技术与转基因动物制药
中国药科大学学报
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@药学前沿@
转基因动物技术与转基因动物制药
沈子龙B7廖建民7徐寒梅
9中国药科大学生物技术中心7南京5=666C:
摘要转基因动物技术始于上个世纪<6年代756多年来7转基因动物在制作方法上由最初的显微注射法D逆转录病毒法和胚胎干细胞法7发展到体细胞核移植技术D腺病毒载体法D精子头与转移基因共注射法等E随着转基因技术的不断发展7利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展7目前7转基因动物制药正走向产业化的道路7具有十分广阔的前景E
关键词转基因动物F显微注射法F逆转录病毒法F胚胎干细胞法F体细胞核移植法F转基因动物制药
中图分类号;G H<文献标识码;I文章编号;=666J K6L<95665:65J66<=J6?
转基因动物技术和转基因动物制药是近年来世界范围
内的研究热点7各国学者竞相加入研究行列7许多国家的政
府和一些大的生物技术公司都给予其极大的关注7相继投
入巨资进行研究E本文将对转基因动物技术和转基因动物
制药的研究进展进行回顾E
=转基因动物技术的发展
使动物能够组织特异性地表达外源蛋白质7需要人为
地将编码这种蛋白质的基因转移到动物的胚胎中7使目的
基因能够整合到动物染色体上7进而得到表达E制作转基
因动物的方法主要有;显微注射法D逆转录病毒法D胚胎干
细胞法D体细胞移植技术D腺病毒载体法和精子头与转移基
因共注射法E
=M=显微注射法
=C<6年7N"$O/%首先建立了前核显微注射的转基因
方法P=Q E N"$O/%将疱疹病毒胸腺激酶基因克隆于R S T U55
载体9启动子为V W L6基因的启动子:7前核显微注射到小
鼠受精卵7再将受精卵移植到假孕母鼠的输卵管中7产生了
第一例转基因小鼠E这说明外源基因能够整合到哺乳动物
胚胎染色体上E随后7其他研究小组的研究证明P5>L Q显微注
射后产生的整合有外源基因的生殖细胞能够传代E目前7
显微注射方法仍然是常用的转基因方法7它的缺点是不能
控制转基因的整合位点及整合的拷贝数E
=X5胚胎干细胞9Y V细胞:转染法
Y V细胞最早是从早期的小鼠胚胎中获得的P K7?Q7在滋
养层或条件培养基中具有无限增生的能力E从胚泡期胚胎
的内细胞群中分离细胞F培养这些细胞并用外源基因进行
转染7外源基因通过随机插入或者同源重组的方式整合到
Y V细胞的基因组中E在转染的外源基因结构中有一个抗性
筛选标记7可以通过向培养液中添加抗生素的方法富集被
转染的细胞E把被转染的细胞注射进感受态胚囊7并将感
受态胚囊移植进假孕母鼠的体内E这样得到的转基因动物
是嵌合体小鼠E由于Y V细胞能在体外培养7因此可以作为
基因转移的受体P H7 细胞进行转基因的最大优点是通过同源重组构件的转染7 能够进行基因打靶7即在体外就能够确定整合的位点7克服 了前核显微注射无法解决的随机整合的问题7但是本方法 目前只限于小鼠E =X U逆转录病毒载体法 在转基因小鼠出现前7!&/%+3.*9=C H?:通过观察发现鼠 的胚胎在逆转录病毒的转染下7其基因组上能够插入病毒 T Z I染色体组的前病毒[Z I序列P==Q7虽然当时还没有意 识到可以用这种方法来制作转基因动物7但随着重组传染 性逆转录病毒系统的发展P=5Q7用带有外源基因的逆转录病 毒介导的基因转移成为可能E从供体动物身上取得早期胚 胎7再将胚胎细胞移植到受体动物之前9有时在之后:将它 们与逆转录载体混合7逆转录载体连自身与目的基因一起 插入宿主基因组中7再将带有外源基因的胚胎移植到怀孕 的或假孕的雌性动物体内就可以产生转基因动物E在=C 年7用逆转录病毒法制作的转基因小鼠成功P=U Q E这一方法 最近又有了新的进展7I%0*"%4P=L Q等认为以逆转录病毒载 体介导的基因整合的关键在于有丝分裂时出现核膜分裂7 \ \\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ = < A收稿日期566=J==J5 处于减数分裂中期!"##$的卵母细胞无核膜的时间远长于处于有丝分裂"期的细胞%这就为逆转录病毒载体介导的基因插入提供了可能&研究者将乙肝表面抗原基因插入复制子缺失的逆转录病毒载体内并注射"##期的牛卵母细胞&注射完毕的卵母细胞同获能后的牛精子共同孵育’()使其受精并在体外进一步培养到囊胚期%将其中*+个胚胎移植到,头受体母牛的子宫%有-头受体牛怀孕生产了(头健康的犊牛!两公两母$&进一步的研究表明(头犊牛的皮肤和血液细胞都携带乙肝表面抗原基因%’头母牛的乳汁中均含有乙肝表面抗原&外源基因在宿主基因组中的整合成功率为*++.& */(体细胞核移植法 *001年%英国223公司的科学家45)67898与罗斯林研究所的:7;<=>等通过体细胞核移植技术率先在世界上制作成功转基因绵羊?*,@%之后各国科学家相继报道了类似的研究成果&*00A年:B9B C B */,精子头与转移基因共注射法 *000年%S6>)F6C?*(@报道了胞质内注射精子制作转基因小鼠的方法&用精子头与编码绿色荧光蛋白的报告基因共孵育%然后注射未受精的小鼠卵母细胞%产生了D(.的转基因表达胚胎%将这些胚胎未经选择地转移到假孕母鼠子宫中%后代中’+.的小鼠表达了绿色荧光蛋白& ’转基因动物制药 转基因动物的另一个十分重要的用途就是可以用来生产重要的蛋白质药物%即转基因动物制药!V I B6\J8675B67Q 第一阶段是细菌基因工程&即把改建后的目的基因插入到适当的质粒中%然后将质粒转入大肠杆菌使目的基因表达&细菌基因工程的成功使大量生产人体内的稀有蛋白成为可能%改变了蛋白药物生产的传统模式&目前上市的蛋白基因工程药物大多数都是用这一方法生产的&但是细菌基因工程也存在着极大的缺陷N细菌本身是低等生物%缺乏真核生物基因所必须的一些翻译后加工机制%因此用于表达真核基因时的蛋白产物往往没有活性%必须经过后加工才能成为有活性的蛋白药物&而后加工过程极为复杂%因而限制了细菌基因工程的发展& 第二阶段是细胞基因工程&细菌基因工程的缺陷促使人们寻找新的生产药用蛋白质的方法&从1+年代开始人们转向使用真核细胞表达系统来生产药用蛋白%即利用哺乳动物细胞株来代替基因工程细菌&该方法克服了细菌基因工程表达出的蛋白质没有活性的缺点&用该方法生产的红细胞生成素!^2_$G组织纤溶酶原激活剂!>Q2S$等已经上市&但是哺乳细胞培养要求的条件十分苛刻%药物生产的成本太高%限制了该方法的进一步发展& 第三阶段就是用转基因动物来生产药用蛋白&外源基因在转基因动物体内最理想的表达场所就是乳腺&因为乳腺是一个外分泌器官%乳汁不进入体内循环%不会影响转基因动物本身的生理代谢反应&从转基因动物的乳汁获取的目的基因产物不但产量高G易提纯%而且表达的蛋白质经过 ’ A中国药科大学学报--卷 充分的修饰加工!具有稳定的生物活性"因此又被称为转基因动物乳腺反应器"利用转基因动物乳腺生物反应器来生产基因药物是一种全新的生产模式!具有投资成本低#药物开发周期短和经济效益高的优点"表$是一家公司对用传统的细胞培养及用转基因动物生产蛋白质的投入及产出的统计%&’()*+,-./0+1/*23445,6677789./:+1/*28*’;<"目前一种新药从它的研制开发#审批到上市需要$=>$?年的时间!而用转基因动物乳腺生物反应器的话!周期只需要@年左右" A9B$C-./0+1/*2*’;59)/2’1’D5)’E(*4/’1/15(4291E*’242D’);’1’*F’19F914/B’E/+2(2/1:4)9E/4/’19F*+F F*(F4()+.+)2(2(2/1:4)912:+1/* 5’(F4)G’):’942 A)9E/4/’19F*+F F*(F4()+H’(F4)G+::20’94;/F I J97;94+)/9F.’F(;+%I:<$K====L?=L$=== M95/49F+N(/5;+14*’24!’)*’245+)91/;9F%E’F F9)2<$==O/F F/’1$===$====>?==== P N(/5;+14;9/14+191*+*’242!’)I++5/1:*’245+)91/;9F%E’F Q F9)2<$=====$=L?== R1/4*’245+)5)’4+/1%E’F F9)25+):)9;<$===8$=>=8L?L>L= S$==I:’D)97;94+)/9F5+)G+9) 建立转基因动物乳腺生物反应器首先要保证目的蛋白在动物乳腺的特异性表达!这就要求表达载体的启动子调控元件应选用动物乳蛋白的基因启动子元件"目前!用于转基因动物乳腺定位表达的调控元件主要有以下四类,第一类,T Q乳球蛋白%U V0<基因调控元件!&/;’12等将绵羊的U V0基因转入小鼠!绵羊的T Q乳球蛋白在小鼠乳腺中特异表达!其奶液中含量可达L W:6V" 第二类,酪蛋白基因调控序列"常用牛X&$Q酪蛋白基因和羊T Q酪蛋白基因的调控序列"如X&$Q酪蛋白基因调控序列指导的人白介素Q L基因已在兔奶液中成功表达" 第三类,乳清酸蛋白%Y-H<基因调控序列"Y-H是啮齿类动物奶液中的主要蛋白质!在家畜奶液中没有Y-H 的存在!但Y-H基因调控序列可以指导外源基因在家畜奶液中表达" 第四类,乳清白蛋白基因调控序列" 第三类和第四类可以指导外源基因的表达!但乳腺表达的特异性及表达量都不如第一类和第二类" 近年来!转基因动物制药的研究取得了极大的进展!表 L Z L[\对近年来研制成功的用于药物生产的转基因动物的种类#特点#发展水平及发展公司进行了总结"表W Z L K\是目前世界上正在研究的用转基因动物乳腺生物反应器生产的蛋白质药物和抗体以及研究进度#研制公司及其用途" 由于转基因动物制药的巨大发展前景!目前世界上有L=多家公司在从事这方面的研究"$]]]年全球重组蛋白药物的市场总合为$W=亿美元!抗体的市场也有$=亿美元"巨大的市场诱惑使越来越多的制药公司通过各种方式加入这一行列"0+1^G;+A)912:+1/*2公司是转基因动物制药领域的佼佼者"它在各种转基因动物中表达了六十种蛋白质!有_?种的表达水平超过$:6V!其中$_种在山羊中的表达水平达到$:6V或更高"其中抗凝血酶‘已进入‘期临床研究"0+1^G;+公司与多家制药企业及组织签署了用转基因动物生产蛋白质及抗体的协议"另外两个有进入临床研究产品的从事转基因动物制药研究的生物公司是H H V A3+)95+(4/*2%P E/1B():3!&*’4F91E<和H39);/1: U a"H H V公司的用转基因绵羊生产的用于治疗囊性纤维化 的X $Q 抗胰蛋白酶%--A<已进入b期临床"该公司正在研究用转基因绵羊生产三种凝血因子,凝血因子c#凝血因子d和蛋白M e它们也在从事在转基因兔乳汁中表达多肽的研究"L===年该公司与H+)/’E’14/f%Y94+)4’71!O-<# g’.’g’)E/2I6h G;’:+1+4/*2%M’5+139:+1!i+1;9)I91E &+944F+!Y-<及另外一家美国生物技术公司签署了合作协议"H39);/1:j’F E/1:g a公司与-;+)/*91J+EM)’22 %Y923/1:4’1!i M<#-U&0F’B9F k1*8%i+l’)+24!Yk<及k1D/:+1合作用转基因牛来生产人药用蛋白质!第一个产品 是用于治疗H’;5+m2病的X $Q 糖苷酶"$]]]年_月!加拿大最大的转基因动物公司g+f/9克隆成功三只转基因山羊M F/14#-)1’F E和i911G并发展成功U P V P%U)++EP9)F G V9*494+P9)F G<山羊技术"该公司以此技术为基础发展转基因动物制药技术和其他有商业价值的蛋白质的生产"-B Q :+1/f和O+E9)+f两家公司则用各自独有的转基因小鼠技术生产治疗用单克隆抗体"其中O+E9)+f公司与日本的n/)/1U)+7+)G有限公司%A’I G’!o9591<合作完成了A M转基因大鼠体系"该转基因大鼠通过染色体转移技术而含有人所有的产生抗体的基因"这些公司生产的一些人源化抗体正处于不同的临床阶段"-./:+1/*2公司用鸡蛋来生产商用蛋白!溶菌酶就是其中之一"溶菌酶目前的市场需求为每年$=亿美元!并以每年$=p>$?p的速率增长!-./:+1Q /*2公司希望通过转基因的方法使鸡蛋中的溶菌酶浓度提高L>W倍"A)91q+1’0+1公司的主要研究焦点是用转基因小鸡来生产各种药用蛋白质及可供人们进行异种移植时使用的器官Z L[!L K\" W @ L期沈子龙等,转基因动物技术与转基因动物制药 !"#$%&’()’"*+,’-.)"-’/’0*’1/2-*.)*,"3-4’320"325"/-+-’123*6’,"7’+*207,.*’237,.1+0*2.3 8325"/!25’.) 4’-*"*2.395.3*6:;.%.).))<-7,234!25’*. -’=+"/5"*+,2*( 95.3*6:>"0*"*2.37’,2.195.3*6:833+"/52/?7,.1+0*2.39>:833+"/(2’/1.) ,’0.5#23"3* 7,.*’237’,)’5"/’9?4 :@’0.5#23"3* 7,.*’23-’=7,’--’1 A .57"32’- B A "**/’ C D D E F F G H H H I H $J K J C J D D J D L A 620?’3-$ H $L H M (, E H %$L N.3.0/.3"/"3*2#.12’-J /(-.O (5’ J 4,.P *66.,<5.3’J 23-+/23J 6+5"3-’,+5"/#+523 I J G J D G J D C J $H J $D Q ."*-L D <$ G R F 4."*- D G G H H I 83*2*6,.5#23VJ *2--+’7/"-523.4’3"0*2W "*.,R 5.3.0/.3"/"3*2#.12’-J "D <"3*2*,(7-23J 4,.P *66.,5.3’D H JD F J D E N20’D C <$D 1 D H >M F K L H X 4 Y F 54Z 2#,23.4’3-+,)"0*"3*[,.*’23S J 7,.0.//"4’3,’0.5#23"3*"3*2#.1<2’-D J D $[24-I D H E D E F H H D %L Z "0*.,\J [,.*’23 A J 6’5.4/.#23 F J L J D I J D E J D K @"##2*-D G L K I A "/02*.323J ’=*,"0’//+/",-+7’,<.=21’12-5+*"-’J ’,(*6,.7.2’*23J 4,.P *66.,5.3’J 23-+/23 $J "<4/+0.-21"-’J 4/+0"4.3 L J D E ]6’’7L D <$G D G L H H $%L "D <"3*2*,(7-23J )"0*.,^___J )"0<*.,_‘J )2#,23.4’3J 23-+/23 4,.P *6)"0*.,D D E B D %8#4’32=9Z ,’5.3*J A 8:R$%81W "30’1A ’//!’063./.4(9a.,0’-*’,J N8:RF %8/’=2.39;’P b "W ’3J A !:RI %8W 24’320-98*6’3-J Q 8:R L %S 2.*,"3-7/"3*9A 6",/’-*.P 3J N8:R E %A 6,.5.-N./’0+/",](-*’5-9S +,3"#(J A "3"1":R K %Q "/"c ’-2439]"+?A 2*(J a_:R G %Q ’< 3’a.,?-98338,#.,J N_:R C %Q ’3’*20]"W 234-"31A /.3’9A .//’4’]*"*2.3J !‘:R D H %Q ’3O (5’!,"3-4’320-9Z ,"52346"5J N8:R D D %_3<)24’39c ’ *20-9S +,/234"5’J A 8:RD C %]25"S 2.*’063./.4(9N233’"7./2-J N;:R$H 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Y[3*5$"#等用固定化金属亲和层析分离此蛋白高效b迅速W,L Y[3’8’#’.等用c#M d J选择性沉淀法分离凝血因子>H和蛋白!R纯度超过]_‘W,M Y V ,问题及展望 结合基因打靶技术N8’#’$*.8’$%#8O R并借鉴胚胎干细胞系中较完善的技术环节R再配合上具有重要药用价值的外源基因R利用体细胞克隆技术具有高效制备转基因动物的潜力V转基因动物技术和转基因动物制药将为人类解决许多生命科学领域的重大问题R是蛋白质药物生产领域的一场革命R这就决定了在今后这方面的研究将不断的深入R 竞争也将更加激烈V国外的经济学家估计R大约在L a年后R 转基因动物生产的药品就会鼎足于世界市场R销售额将超过M_a亿美元N不包括营养蛋白质和其他产品O R成为最具有高额利润的新型工业V目前R我国e X f,g计划已将山羊乳腺生物反应器研究列为重大项目R用于生产重要的重组蛋白质药物的转基因牛b奶山羊和转基因兔等已相继诞生R这标志着我国在转基因动物制药方面的研究已达到相当的水平R为以后的研究工作打下了良好的基础V 尽管转基因动物制药R特别是转基因动物乳腺生物反应器制药给人们展示了美好的前景R但迄今还没有一个商品化的药物上市V除了转基因动物制药的研制周期较长R 前期投资大的原因外R还存在较多的技术问题需要解决h 转基因动物的成功率较低R3"55=羊的成功率为L0 M i i V随后的研究虽然使成功率有所提高R但总的成功率还是较低R限制了其在应用领域的发展W,f Y R还有待于进一步的研究V 目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题R 包括目的基因的整合位点b整合的拷贝数b整合机理及与宿主染色体之间的相互作用等问题还不是很清楚[相同的基因表达调控元件在不同的种系中差异很大R它们与宿主的遗传背景b外源基因的结构及各种调控因子结合位点之间的关系还不是很清楚V 虽然转基因动物可以对外源基因进行翻译后修饰R但毕竟与人不同R其自身的保护机制也会对外源物质产生排斥V产生诸如外源蛋白水解b j J羧基化不完全及糖基化形式与人类不同等问题V 从动物乳汁中分离目的蛋白质也不是简单的事情R加上乳汁中可能存在的细菌b病毒的影响R使目的蛋白质的检测及分离纯化更加困难R需要建立更加完善R灵敏度更高的分离纯化方法及污染物检出体系V _ X M期沈子龙等h转基因动物技术与转基因动物制药 安全性也是一个十分值得研究并给予特别关注的问题!这个问题包括两个方面"一是外源基因的插入可能会对宿主动物自身产生的影响及对其生活环境所造成的影响#即插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平$转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境#造成基因污染$二是转基因动物制品的使用安全性#即是否可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类!由于担心可能存在的基因污染及使用安全性问题#各国政府对转基因动物制药持谨慎的态度#一方面鼓励发展转基因动物制药#不断加大在这方面的研究力度$另一方面对转基因动物生产的药物的上市提出了严格的技术指标#美国%&’已经制定有关的规定#并在不断的完善#其他各国也在积极的制定有关的法律及标准! 世纪之初#我国的制药企业#特别是大型企业#应该抓住机遇#加强研究及投资力度#加快我国转基因动物制药的研究速度#尽快使其实现产业化#使我国的转基因药物在()世纪的生物医药产业革命中占有一席之地! 参考文献 *)+,-./-012#34506-7’3#89-:;0&1#<=>?@,A0A B;4B.507C D-.C E5B;-0-D E-F7AA E G.H-7G HE;4.-;0I A4B;-0-DJ F.;D;A/ &K’@L M N O P>=?Q O>RS O T@U3’#)V W X#Y Y Z)(["\]W X C\]W^@ *(+,-./-012#_F//9A%‘@a0B A6.5B;-050/7B5G9A6A.E9;0A B.507C E;77;-0-D6A0A;0I A4B A/;0B-E-F7A J.-0F49A;@S O T )V W)#c d e")(^^C)(^f@ *]+g.;07B A._h#i j A0‘k#l.F E G5F A.mn#<=>?@3-E5B;4A o C J.A77;-0-D j A.J A7B j H E;/;0A:;057A;0E;4AD-99-p;06;0I A4C B;-0-D5D F7;-06A0A;0B-A667@q=s M<#)V W)#c t e"V(C V^@ *r+n u507m1#v5F D E50m‘@n7B5G9;7j E A0B;04F9B F.A-D J9F.;J-B A0B;594A997D.-E E-F7AA E 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外源基因在转基因动物乳腺中特异性表达是转基因动物乳腺生物反应器的根本目的。有许多生物活性蛋白基因在乳蛋白调控序列的指导下已经在转基因动物乳腺中表达，其中应用较多的调控元件有牛αs1-酪蛋白、山羊β-酪蛋白、山羊β-乳球蛋白和小鼠的乳清酸蛋白等。尽管已有应用这些调控序列实现乳腺特异性表达成功的事例，但大多数实验研究中，乳腺特异性表达的成功率低，乳汁中的表达水平较低。 本研究选用山羊BLG、山羊β-酪蛋白和牛αs1-酪蛋白三种不同乳蛋白调控序列构建人乳铁蛋白乳腺特异表达载体，制备转基因小鼠并在小鼠乳腺内表达目的蛋白，从而在个体表达水平上探讨不同调控序列对外源基因表达水平的影响，筛选高水平表达载体。 本研究选用山羊β-乳球蛋白作为调控元件，构建由山羊BLG5’+CMV+hLFcDNA+Neor+山羊BLG3’组成的乳腺特异表达载体BCL。选用山羊β-酪蛋白作为调控元件，构建出鸡β-globin+山羊β-casein5’+CMV+hLF cDNA+山羊β-casein3’组成的乳腺特异性表达载体PMH。选用牛as1-酪蛋白作为调控元件，构建由牛as1-casein5’+CMV+hLF cDNA+牛as1-casein3’组成的乳腺特异表达载体ACF。 通过原核显微注射法制备转基因小鼠，来验证本实验构建的乳腺特异性表达载体的有效性。将BCL质粒用SalI.与NotI限制性内切酶消化，回收纯化约10.6kb的表达载体片段，通过原核显微注射法导入小鼠受精卵雄原核，结果获得65只G0代小鼠，经PCR检测，其中6只小鼠整合有外源基因(♀19＃、♀48＃、♀59＃、♀62、♂11＃、♂23＃)。将PMH质粒用SalI与NotI限制性内切酶消化，回收纯化约19.1kb的表达载体片段，通过原核显微注射法导入小鼠受精卵雄原核，结果获得56只G0代小鼠，经PCR检测，其中5只小鼠整合有外源基因(♀18＃、♀27＃、♀28＃、♀31＃、♂30＃)。将ACF质粒用SalI.与NotI.限制性内切酶消化，回收纯化约10.8kb的表达载体片段，通过原核显微注射法导入小鼠受卵雄原核，结果获得22只G0代小鼠，经PCR检测，其中3只小鼠整合有外源基因(♀4＃、♀13＃、♂8＃)。 采用酶联免疫法(ELISA)和蛋白印迹(Western Blot)对原代转基因小鼠及的乳汁进行目的蛋白的表达检测。ELISA检测结果表明，BCL转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性，其中平均表达量约为5.874mg/mL；PMH转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性，其中G0代平均表达量约为 3.556mg/mL；ACF转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性，其中G0代平均表达量约为3.251mg/mL。Western Blot结果表明，BCL转基因小鼠、PMH转 基因小鼠和ACF转基因小鼠的乳汁中所表达的目的蛋白的分子量大小与人乳铁蛋白标准品基本一致(约78 kD)。 本实验成功构建了能够指导目的基因在动物乳腺中高效表达的载体BCL、PMH和ACF，而且我们所构建的人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体具有很好的乳腺组织表达特异性，为下一步建立高表达的转基因山羊乳腺生物反应器奠定了基础。 2.期刊论文于致新.肖定福.胡雄贵.邓缘.燕海峰.YU zhi-xin.XIAO Ding-Fu.HU Xiong-gui.DE Yuan.Yan Haifeng 动物生物反应器的应用现状-畜禽业2008,""(10) 简要介绍了国外制作转基因动物的常用方法,如显徽注射法、逆转录病毒介导法、配子介导法、干细胞法和核移植法等方法和原理及应用上的优劣.并综述了动物生物反应器的分类及其在生产中应用的范围和效果,概括了目前国外在动物转基因生物反应器上取得的成果,为我国动物生物反应器的研究提供技术依据. 3.学位论文杨惠祥以生殖细胞为外源基因载体建立异种移植转基因供体动物的研究2007 建立转基因动物是异种移植研究中极为重要的工作基础。本文采用以生殖细胞(卵细胞和精子细胞)为外源基因载体的新型转基因技术建立转基因动物，以简化操作、降低成本、提高外源基因整合和表达的效率。 第一部分 卵巢注射法建立hCD59、hCD55、HT 单基因转移小鼠的研究 目的：探讨卵巢注射法建立异种移植用转基因动物的可行性。 方法：采用注射法将 hCD55、HT、hCD59 基因重组质粒分别导入雌鼠卵巢内，交配后产下原代(Go代)小鼠。提取Go代小鼠基因组DNA，采用PCR方法对目的基因整合进行初筛。对PCR出现特异条带的小鼠基因组DNA进行southern 印迹杂交，进一步证实目的基因整合。抽取目的基因整合阳性小鼠的外周血，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术(FCM)检测目的基因表达。对FCM表达阳性的转基因小鼠肝脏和肾脏进行免疫组织化学染色，观察目的基因在器官中的表达分布情况。对表达目的基因的Go代小鼠进行交配生产F1代小鼠，同法检测F1代目的基因的整合与表达。分离3种转基因小鼠的脾脏淋巴细胞，进行人血清溶破实验。 结果：对15只雌性小鼠进行卵巢注射，共产生Go代鼠130只。其中，注射HT基因重组质粒的小鼠产仔62只，注射hCD59基因重组质粒的小鼠产仔42只，注射hCD55基因重组质粒的小鼠产仔26只。经PCR初筛后，Southern 印迹杂交证实染色体中整合 HT、hCD55、hCD59 基因的小鼠分别有21只、4只、9只，总整合率为26.2％，高于受精卵显微注射法的整合率。经RT-PCR 检测共20只Go代小鼠阳性，包括3只hCD55小鼠、14只HT小鼠、3只hCD59小鼠。FCM检测发现外周血单核细胞表达人 H抗原、hCD55、hCD59的小鼠分别有9只、2只、2只，蛋白表达的效率为10.0％，高于受精卵显微注射法的表达率。免疫组化检测显示，在转基因小鼠的肝脏、肾脏等组织中均有相应外源基因的表达。Go代小鼠交配后产下F1代小鼠37只，PCR检测hCD55、HT、hCD59基因整合的小鼠分别为7只、6只、3只，FCM检测表达的分别为0只、1只、1只。与对照组比较，三种转基因小鼠的脾脏淋巴细胞耐受人血清溶破的能力均有所增强。 结论：采用卵巢注射法可以使针对异种移植的基因在小鼠体内整合，并可实现RNA水平和蛋白质水平的表达，其整合与表达的效率要高于受精卵显微注射法。三种转基因构件均可遗传给后代(F1代)，并在蛋白质水平表达。人血清溶破实验证实，通过卵巢注射法制备的三种转基因动物可以发挥抗异种排斥的作用。 第二部分 卵巢内共注射建立hCD59/HT双基因和hCD55/hCD59/HT三基因转移小鼠的初步研究 目的：探讨卵巢内多基因共注射建立多基因转移动物的可行性。 方法：采用hCD59/HT双基因重组质粒和hCD59/hCD55/HT三基因重组质粒共同注射卵巢的方法，得到原代小鼠。PCR和Southern印迹杂交法检测原代小鼠目的基因整合，FCM检测目的基因表达。 结果：双基因重组质粒共同注射4只雌鼠，获得Go代鼠31只。Southern印迹杂交证实仅出现hCD59/HT 双基因阳性鼠2只，无单基因整合鼠，仅1只鼠出现hCD59/HT共表达阳性，另1只鼠表达阴性。三基因重组质粒共同注射5只雌鼠，3胎共产生Go代鼠137只，Southern 印迹杂交证实仅出现hCD59/HT双基因阳性鼠2只，无其它整合情况，表达均为阴性。 结论：多基因共注射卵巢法可以得到相应的转基因动物，该方法确实可靠且周期较短。但多基因共注射后，基因之间会互相影响，整合与表达的效率比单基因注射者明显降低，提示其中有更复杂的机制参与，需要深入研究。 第三部分 PAMAM-D对hCD55基因转染猪精子细胞介导作用的研究 目的：探讨新型纳米材料PAMAM-D对hCD55基因转染猪精子细胞的介导作用。 方法：将新型纳米材料 PAMAM-D(G5)和线状hCD55 DNA按照不同氮磷比(电荷比)制备PAMAM-D/hCD55复合物。取部分复合物酶切电泳。将复合物与处理后的1×10<'6>猪精子细胞共孵育2h，原位杂交法检测hCD55对猪精子细胞的转染效率，经精子质量检测工作站检测孵育后的精子活力和精子畸形率。 结果：对PAMAM-D/DNA复合物进行酶切消化后，其中的DNA分子不被限制性内切酶降解。经原位杂交法检测，加入PAMAM-D 后可以明显提高各组猪精子细胞的转染效率，且基本上随着氮磷比的增加转染效率也随之增高。最高者(400ng，氮磷比20：1)可达对照组的 167％(47.5％±3.5％ vs 28.5％±1.5％)。经精子质量检测工作站检测 PAMAM-D 对精子细胞活力和精子细胞畸形率没有明显影响(p>0.05)。 结论：PAMAM-D作为载体可以提高目的基因对猪精子细胞的转染效率，其对猪精子细胞无明显毒性，增强了精子载体法的实用性，为生产异种移植用转基因猪提供一种可供参考的方法。 4.期刊论文杜金芳.王慧转基因猪的研究进展-猪业科学2009,26(9) 自80年代转基因动物模型建立以来,转基因动物已应用于生命科学的各个领域,尤其在生物反应器、异种器官移植和提高动物生产性能等方面得到了广泛的应用.转基因动物越来越受到人们的重视,由于猪在解剖、组织、生理和营养代谢等方面均与人类最接近,又是一种重要家畜,所以转基因猪的研究越来越受重视.本文综述了转基因猪的常用技术方法、尤其是显微注射法、核移植法等几种主要方法,评价了转基因的研究概况和转基因猪的热点应用领域等. 5.学位论文刘勤慢病毒载体介导转基因小鼠制备技术研究2008 研究目的及背景： 转基因动物模型是联系分子、细胞水平研究和整体动物研究的桥梁。自1980年Gordon首次采用原核显微注射开展动物转基因研究以来，已有十多种主要的转基因动物制作方法，如原核显微注射法、逆转录病毒侵染法、精子介导法、胚胎干细胞法，体细胞核移植法等。这些转基因动物制备方法各有优缺点：原核显微注射法制作转基因动物DNA整合效率低，整合位点不定，技术难度大，应用于高等哺乳动物时的效率很低；精子介导基因转移技术技术存在随机性和不确定性；胚胎干细胞法制备的转基因首建动物一般是嵌合体，不易实现外源基因的自然繁殖传代，且建立干细胞系的难度较大，应用受到限制；体细胞核移植法操作难度大，且外源基因的表达与否受整合位点附近基因的影响。 相对而言，慢病毒侵染法在可操作性、胚胎发育率、移植妊娠率、目的基因整合效率、目的基因表达率、阳性个体的选育等方面比上述几种技术均有显著的优势。1976年，Jaenish首次用逆转录病毒(Retroviruses)感染胚胎制作转基因动物获得成功。逆转录病毒的RNA进入细胞后，逆转录成DNA前病毒，利用逆转录病毒的整合酶及其特异的末端核苷酸序列，将DNA前病毒整合到染色体上，从而将其携带的外源基因也插入到染色体上。慢病毒(lentivirus)属逆转录病毒的亚科，具有逆转录病毒的基本结构gag、pol和env，不同之处在于慢病毒包含4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。其中调节基因tat和rev分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，Tat蛋白在慢病毒基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用 ，Rev蛋白则可促使其基因的表达由早期向晚期转化。HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，为5’LTR-gag-pro-pol-env-3’LTR，其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。慢病毒载体(Lentiviralvector，LV)广泛用于体外细胞的转染和基因治疗的研究。目前用LV成功转染的细胞有神经细胞、视网膜感光细胞、肌细胞，肝细胞、早期胚胎细胞等，用LV制作的转基因动物有小鼠、大鼠、猪，牛等。LV的优势在于：1)转染效率高，能够感染分裂期和静息期细胞 ，能转染多种组织；2)整合到宿主基因组中的目的基因能持久稳定的表达，不易形成嵌合体，一般能自然繁殖传代：3)LV经改构后，不在宿主细胞内增殖，也不会导致寄主细胞的死亡，免疫源性极小，生物安全性高。LV用于转基因动物模型制备也有一定的局限性：1)一是制备难度较大，不易获得高滴度、高纯度的病毒；2)LV在宿主基因组上的整合一般是随机的，可能干扰插入位点及其附近基因表达；3)虽可通过控制病毒的滴度来调节转入基因的拷贝数，但是不容易实现整合拷贝数的精确控制；4)携带目的基因的容量较小(＜10kb)，当需要插入大片段DNA时，会限制制备LV的滴度：5)LV前病毒 DNA在宿主基因上是多位点随机整合，当转基因启动子的表达需要多拷贝时应选择原核显微注射法。 LV技术与siRNA结合使用，可以相对容易地在转基因动物细胞中对特定基因实现RNAi效应。RNAi效应的核心是一段20-25nt的与靶基因mRNA互补或不完全互补的短RNA，通过它和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。要实现表达如此短的一段siRNA片段，转基因载体的长度可以控制在很合适的范围内(4～5kb)，对插入目的基因容量有限(＜10kb)的LV来说十分理想，因而LV在制备RNA干扰转基因动物模型上的优势更加明显。 本实验通过慢病毒介导高效地研制了eGFP转基因小鼠，建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系，并利用该技术制备了树突状细胞(DentrenticCells，DCs)特异性干扰Rab32基因表达的RNA干扰小鼠模型，进一步验证了利用该技术体系在小鼠树突状细胞实现对特定基因进行抑制的可行性与有效性。 研究内容及结果： 在第一部分，本课题开展了通过慢病毒载体介导、结合卵周隙显微注射、以eGFP为报告基因的转基因小鼠制备方法学研究，探讨了通过卵周隙显微注射重组慢病毒对胚胎发育的影响，以及通过此法研制转基因小鼠的效率。结果：1)建立并优化了三质粒慢病毒包装系统，获得了滴度达到 1×109TU/ml以上的注射用重组慢病毒；通过卵周隙显微注射，胚胎的2-细胞卵裂率为81.8％(1189/1453)，与无处理组无显著差异；在2-细胞期，每一视野下胚胎阳性率＞90％(1178/1189)，说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎；2)将注射后发育至2-细胞的胚胎通过输卵管壶腹部穿刺移植法移植后，假孕母鼠妊娠率为42.8％(12/28)，很大程度上避免了伞部移植法出血导致的胚胎存活率下降，提高了移植成功率；3)eGFP首建鼠阳性率为 60.8％(73/120)、转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0％(73/1453)，说明卵周隙显微注射对胚胎2-细胞卵裂率几乎无影响，表明慢病毒载体辅以卵周隙显微注射法制作转基因动物高效可行；4)将eGFP阳性首建小鼠采用近交方法建系，至第6个世代，荧光观察发现超排获得的胚胎全部呈eGFP阳性，且新生鼠阳性率为100％，说明eGFP基因可以通过种系传代。 在第二部分，采用了基于siRNA(SmallinterferingRNA)的RNA干扰策略、利用第一部分建立的转基因平台制作转基因小鼠模型。转基因RNA干扰载体FcdGW-Rab32的表达产物siRNA-Rab32可在小鼠树突状细胞(dendriticcells,DCs)中特异性干扰Rab32基因，报告基因为eGFP。由于DCs中并没有荧光素酶基因，构建了在DCs中特异性干扰荧光素酶基因的载体质粒FcdGW-FF3作为对照。结果：1)FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3组的2-细胞卵裂率分别为 79.8％(408/511)、75.8％(317/418)，受体妊娠率分别为35.7％(5/14)、33.3％(4/12)，移植胚胎体内存活率分别为2.7％(11/408)、2.8％(9/317)，转基因首建鼠阳性率分别为54.5％(6/11)、66.7％(6/9)，转基因小鼠总体研制效率分别为1.2％(6/511)、1.4％(6/418)，除胚胎体内存活率和总体研制效率外，其他数据与第一部分的结果相当；2)经PCR检测和耳廓皮肤真皮层DCs荧光观察结果表明，FcdGW-Rab32和FcdGW-FF3转基因小鼠已被建立，目的基因已经正确整合至转基因小鼠基因组中，且能通过种系传代；3)流式细胞仪检测BMDC表明，eGFP只在小鼠的DCs内特异性表达，说明我们所采用的 CD11c启动子具备较好的定向表达能力；4)通过相对荧光定量PCR(FluorenscentQuantitativePCR,FQ-PCR)对DCs的Rab32基因表达情况进行检测，结果显示Rab32基因的表达下调78.3％，特异性地实现了对DCs的Rab32基因产生Geneknock-down的干扰效应。 研究结论： 1.本课题成功建立了以慢病毒介导、结合卵周隙显微注射、以eGFP为报告基因的转基因小鼠制备技术体系，获得了可稳定传代的eGFP转基因小鼠 ，证实该技术体系有较高的转基因效率。 2.将慢病毒介导的转基因动物技术与RNAi技术相结合，首次建立了在小鼠DCs特异性抑制Rab32基因的RNA干扰小鼠模型，验证了该转基因技术体系的在制备转基因小鼠模型的有效性，提示此技术路线在研究树突状细胞抗原交叉递呈的调控方面有一定的应用价值。 6.会议论文吴应积.罗奋华.旭日干用精原干细胞移植技术制作转基因动物的研究前景 在生物科学、生物医学、畜牧业科学和生物反应器的研究中,转基因动物是非常有用的工具.有多种方法产生转基因动物.最通用的制作转基因动物的方法是原核显微注射法和核移植法.然而,这些方法往往效率很低,引起嵌合体(在原核显微注射法中)或产生不正常的个体(在核移植法中).1994年 ,Brinster等人发表了精原干细胞移植的新方法,实现了供体小鼠的精原干细胞在受体中进行精子发生和单倍体的生殖遗传.精原干细胞移植技术是精子发生过程研究和雄性生殖遗传研究的最有价值的工具.通过移植,供体的精原干细胞在适当的受体中定居并分化产生精子,与母体交配后,经过怀孕分娩,产生具有供体遗传特性的后代.这一发明是生殖生物学上里程碑式的建树.精原干细胞移植法不仅为精子发生过程的研究提供了有力的工具,也为转基因动物的制作指出了可能实现的新途径. 7.学位论文余琛琳运用显微注射法和体内电穿孔法制备胰蛋白酶原Ⅱ转基因小鼠的研究2006 进行胰腺外分泌功能研究是为了从生理角度观察胰腺正常分泌过程或从病理生理角度来探讨胰腺相关疾病的发病机制。胰腺外分泌部分泌的消化酶中胰蛋白酶以酶原形式释放。胰蛋白酶原是一个触发酶，可以激活胰液中许多其他的酶原，在消化过程中起关键作用。胰蛋白酶原分为胰蛋白酶原Ⅰ和胰蛋白酶原Ⅱ，其中胰蛋白酶原Ⅱ的分泌量在急性胰腺炎时比正常升高约50倍，因而胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的变化是急性胰腺炎灵敏、特异的标志和检测指标。检测胰蛋白酶原Ⅱ分泌量的变化可用于急性胰腺炎的诊断及其严重程度的评价。 本课题的目的在于建立一种能够观察胰腺外分泌功能的转基因动物，借助该动物模型通过检测活体内胰蛋白酶原Ⅱ表达水平变化(升高或降低)以监测胰腺外分泌相关疾病(如胰腺炎、胰腺癌)的发生或治愈，从而为研究胰腺外分泌功能的生理机理和与其相关的疾病发病机制以及筛选治疗上述疾病的药物提供理想的实验体系。 本研究分别运用显微注射法和曲细精管内注射辅之体内电穿孔法来制备胰蛋白酶原Ⅱ转基因小鼠。 本实验室以质粒pEGFP-N1为载体，构建以大鼠弹性蛋白酶Ⅰ启动子(PEL)驱动胰蛋白酶原Ⅱ信号肽(Pre)、并连接有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的载体质粒pPEL-Pre-EGFP。为获取转基因目的片断，本研究对已构建的载体进行酶切鉴定、测序、比对分析，并转染体外细胞进行功能性检测。 pPEL-Pre-EGFP的酶切和测序鉴定通过三酶切pPEL-Pre-EGFP获得转基因用片段PEL-Pre-EGFP(2308bp)，经测序、比对分析，PEL、Pre和EGFP均与GenBank中所提交序列同一性程度极高，表明其构建正确。 pPEL-Pre-EGFP功能性体外检测将转染剂与pPEL-Pre-EGFP混合转染SW1990细胞株(人胰腺癌细胞株)，24h后荧光显微镜下观察到绿色荧光，预示外源基因在SW1990上能够正常表达，这为下一步制备转基因动物奠定了基础。 显微注射法制备PEL-Pre-EGFP转基因小鼠本研究共取受精卵1610枚，其中可用于显微注射用的受精卵1280枚，注射DNA后成活的受精卵共507枚；每只假孕雌鼠移植约20个受精卵，共移植24只假孕雌鼠，其中7只怀孕，妊娠率为29.2％，共获得F0代小鼠18只，出生率为3.6％；F0代小鼠经检测，PCR阳性6只，SouthernBlotting阳性1只(雄性)，SouthernBlotting阳性率为5.6％。 体内电穿孔法制备PEL-Pre-EGFP转基因小鼠通过曲细精管内注射辅之体内电穿孔法共获得10只雄鼠，2周后从与之交配的20只雌鼠(1♂：2♀)中获得妊娠雌鼠14只，妊娠率70％，产下仔鼠115只；F0代小鼠经检测，PCR阳性7只，SouthernBlotting阳性1只(雄性)，SouthernBlotting阳性率0.87％。 EGFP可视化检测获得的2只Southern杂交阳性鼠经暴露胰腺组织部位，在整体成像仪下仅显微注射法获得的阳性小鼠胰腺组织观察到绿色荧光，将其胰腺组织制作冰冻组织切片，在倒置相差荧光显微镜下可观测到绿色荧光。 结论 通过对pPEL-Pre-EGFP酶切鉴定、测序、比对分析，获得确切的外源目的基因PEL-Pre-EGFP；并在体外将PEL-Pre-EGFP转染SW1990细胞观测到绿色荧光，表明其能在胰腺细胞中表达。制备的一只转基因小鼠在整体成像仪下观察到胰腺组织有绿色荧光，预示弹性蛋白酶Ⅰ启动子可驱动胰蛋白酶原Ⅱ信号肽在小鼠胰腺组织表达，这为进一步深入胰腺炎的相关研究奠定了基础。 8.期刊论文鞠丽梅.三好一郎.笠井窸雪.蔡有余显微注射法制备转基因小鼠的技术研究-中国实验动物学报 1999,7(1) 转基因技术是发生工程学或胚胎操作技术中的一部分.这一技术包括有受精卵的采集,受精卵的体外培养,胚胎移植等技术,转基因动物制作是其应用技术之一,它是将外源DNA片段用显微注射法直接注入受精卵原核,使外源DNA随机整合到寄主基因组中而形成转基因小鼠.我们建立完善这一技术的目的是在实验动物的生产中为转基因动物的生产提供稳定可靠的保证.我们将pCXTGAP、pCSLN等基因分别注入受精卵原核制备相应的转基因动物模型,并从中总结较佳的操作技术.结果经检测阳性转基因小鼠占出生幼鼠的16.38%.我们认为不仅要有精细的微注射技术、动物的选用和饲育、严密的胚胎操作都是转基因动物制作成功的重要条件. 9.学位论文黄吴键小鼠精子核内转染技术的建立及其机理的研究2005 转基因动物的制作方法有五大类,十几种方案,但是长久以来一直不甚理想,目前仍然以显微注射法为主。由于显微注射法劳动强度大、效率低、周期长、耗费多,科学界一直在寻找替代方案。精子载体法就是以精子为载体,利用精子与卵子结合的过程将外源基因带入受精卵中形成转基因动物的方法,由于方法学上的简捷、便利、又适合几乎所有物种,从1989年Lavitrano用该法建立转基因小鼠以来,备受关注。经过十几年的发展,理论上已经逐渐阐明了精子载体法建立转基因动物的原因和特点,实践上方案有近十种之多。但是除了1999年Perry使用的胞浆内单精子注射的方法,其余方案稳定性、可重复性及转基因动物的形成效率依然不甚理想。我们总结了精子载体法发展的规律,指出核内转染是精子载体法发展的方向。围绕这一方向,我们在缺少同行工作借鉴的情况下,自己探索小鼠精子的核内转染技术。我们的实验设计主要建立在目前针对原代细胞和难转染细胞最常用的两种方法上,一种是方波分组电穿孔技术;一种是阳离子多聚物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)转染技术。 10.期刊论文安靓.李振林.黄伟民.黄吴键.李进人组织型纤溶酶原激活剂牛乳腺生物反应器的研究-第一军医大 学学报2004,24(5) 目的构建组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)乳腺定位表达载体,使其在牛乳汁中高效表达,从而建立牛乳腺生物反应器.方法 RT-TD-PCR法克隆目的基因,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含t-PA-cDAN的乳腺定位表达载体;采用显微注射法和乳腺注射法将融合基因转入小鼠的受精卵和小鼠及牛的乳腺组织中.结果显微注射法和乳腺注射法转基因后,t-PA可在小鼠和牛的乳汁中表达.结论所构建的乳腺定位表达载体可有效地使t-PA基因在小鼠和牛乳汁中表达,t-PA基因的表达不受转基因方法的影响,但t-PA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异,可能受着不同的因素或调控系统的影响. 引证文献(18条) 1.张颖琦动物乳腺生物反应器的应用及研究进展[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2009(3) 2.余露露.刘帅.章嘎.佟春玲.关伟军.马月辉.卿素珠动物转基因技术的发展及应用[期刊论文]-安徽农业科学2009(5) 3.潘伟荣.霍金龙.查星琴.张清政.牛自兵.曾养志转基因动物的研究进展与应用前景[期刊论文]-畜牧与饲料科学2008(6) 4.王洪才.马巍.王军转基因技术研究进展及在动物生产中的应用[期刊论文]-中国奶牛 2008(5) 5.赵小平转基因动物与生物制药[期刊论文]-科学咨询 2008(13) 6.吴易雄.田勇泉转基因动物的伦理问题研究述评[期刊论文]-医学与哲学 2008(7) 7.李若楠.张彦才转基因动物技术及其应用[期刊论文]-华北农学报 2007(z1) 8.马瑞丽动物细胞工程制药的研究进展[期刊论文]-科技资讯 2007(14) 9.滑静.杨柳.张淑萍.王虹生物工程制药研究进展[期刊论文]-中国畜牧兽医 2006(10) 10.赵晓娥.安志兴.李向臣.高立功.吴月红.山灵.刘凤军.王永胜.张涌山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究[期刊论文]-中国农学通报 2005(6) 11.邱志芳.章孝荣.陶勇转基因动物在生物制药工业中的应用[期刊论文]-生物技术通讯 2005(2) 12.王庆忠.李国荣.尹昆.张会亮.李云龙乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景[期刊论文]-生命科学 2005(1) 13.秦粉菊.金萍.徐项桂转基因动物技术在畜牧生产上的应用[期刊论文]-河南农业科学 2005(1) 14.韦相才制作敲除β<'maj>&β<'min>基因及转入人β<'654>地中海贫血基因双转基因小鼠的研究[学位论文]博士 2005 15.刘殿峰.刘秀霞.姚伟.任文陟.张嘉保转基因动物乳腺反应器与生物制药[期刊论文]-黑龙江动物繁殖 2004(3) 16.郝捷.冯波.王建辰转基因动物研究进展[期刊论文]-动物医学进展 2004(1) 17.陈丙波.潘永全.王传广.周渝转基因动物与医学及生物医药研究进展[期刊论文]-四川动物 2003(3) 18.冯登侦.陈泽明.冯梅秀动物转基因技术及其研究进展[期刊论文]-宁夏农学院学报 2003(2) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/165203687.html,/Periodical_zgyaokdxxb200202001.aspx 授权使用：西安交通大学(wfxajd)，授权号：db9c46ce-54f8-426a-a308-9e1c00ec9c9f 下载时间：2010年10月27日