饲用纤维素酶研究进展

文章编号:1005-376X(2002)05-0308-03【论 著】饲用纤维素酶研究进展

钟发刚,王新华

(新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,新疆石河子　832000)

中国分类号:Q55 文献标识码:A

随着养殖业突飞猛进的发展,饲料行业面临资源短缺的状况愈来愈突出。然而,地球上最为丰富的可更新资源——纤维素却没有得到充分利用。因此,如何成功地开始这一资源作为饲料原料,已显得尤为迫切。纤维素酶种类繁多,来源很广。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。由于真菌纤维素酶产量高、活性大,故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。目前,利用纤维素酶降解纤维素达到其有效利用的方法,已成为国内外营养学家极为关注的课题。为此,本文就纤维素酶的特性、功能及研究现状作一综述。

1　纤维素酶的种类

自然界中很多真菌都能分泌纤维素酶,由许多具有高协同作用的酶组成,习惯上,将纤维素酶分成三类: 1.C1酶:这是对纤维素最初起作用的酶,它破坏纤维素链的结晶结构,起水化作用即C1酶是作用于不溶性纤维素表面,使结晶纤维素链开裂、长链纤维素分子末端部分游离和暴露,从而使纤维素链易于水化。 2.Cx酶:是作用于经C1酶活化的纤维素、分解β-1,4键的纤维素酶。主要包括内切-1,4-β葡聚糖酶和外切-1,4-β-葡聚糖酶。前者是从高分子聚合物内部任意位置切开β-1,4键,主要生成纤维二糖、纤维三糖等。后者作用于低分子多糖,从非还原性末端游离出葡萄糖。 3.β-葡萄糖苷酶:即为将纤维二糖、纤维三糖及其他低分子纤维糊精分解为葡萄糖。

上述三种纤维素酶在分解纤维素时,任何一种酶都不能裂解晶体纤维素,只有三种酶共同存在并协同作用时,才能完成水解过程。

纤维素酶是由多种水解酶组成的一个复杂酶系,主要来自于真菌和细菌。根据其中各酶功能的差异,被分为以下三大类:(1)葡聚糖内切酶(1,4-β-D-g lucan g iucanohydr olase 或endo-1.4-β-D-g lucanase, E.C 3.2.1.4,来自真菌简称EG;来自细菌简称Len),这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区,随机水解β-1,4-糖苷键,将长链纤维素分子截短,产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)葡聚糖外切酶(1,4-β-D-g luca n cellobio hydro la se或ex o-1,4-β-D-g lu-ca na se,E.C3.2.1.91,来自于真菌简称Cbh;来自于细菌简称Cex),这类酶作用于纤维素线状分子末端,水解β-1,4-糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子,故又称为纤维二糖水解酶(cello biohy drolase)。(3)β-葡聚糖苷酶(β-1,4-g luco sidase, E.C3.2.1.21,简称BG),这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

2　理化特性

不同来源的纤维素酶的理化特性都不尽相同。内切型酶的分子量介于23～146K Da之间,如真菌的异构酶EGⅠ和EGⅢ,EGⅠ分子量约为54KDa,EGⅢ约为49.8K Da。但也有例外,纤维酶EG有两种菌的内切酶分子量只有6.3KDa。

收稿日期:2002-01-16

作者简介:钟发刚(1971-),男,农学硕士,助理研究员外切型酶的分子量介于38～118K Da之间,如木霉的CBH 有两种异构酶CBHⅠ和CBHⅡ,CBHⅠ分子量约为66 K Da,CBHⅡ约为53KDa。

多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化。糖基与蛋白之间以共价键结合,或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解,同时纤维素酶由于糖基化,使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异,导致酶的多形式和分子量的差别。

研究人员通过对纤维素酶一级结构和三级结构的研究发现,纤维素酶分子普遍具有类似的结构,由球状的催化结构域(catalytic do mains,CD)、连接桥(linke r)和纤维素结合结构域(cellulo se-binding do mains,CBD)三部分组成。(1)连接桥:纤维素酶的连接区大多富含脯氨酸(pro)和羟基氨基酸。连接桥的作用可能是保持CD和CBD之间的距离,也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体;(2)纤维素结合结构域:它对酶的催化活力是非必需的,但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用,其结合纤维素的作用机制目前尚不是很清楚。有人认为CBD是通过氢键稳定结合结晶底物的,纤维素酶的CBD可位于肽链的N 末端或C末端。据研究发现,一些细菌的CBD顺序有一定的共同特点,即带电荷氨基酸含量较低,羟基氨基酸含量很高,均含有色氨酸、天冬酰胺和甘氨酸,而且两个胱氨酸在N和C末端的位置完全相同。不过,也有一些纤维素酶没有CBD,如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluo some)吸附纤维素的;(3)催化结构域:它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源纤维素酶的分子量大小差别很大,但它们催化区的大小却基本一致。

3　降解机制

3.1　对纤维素分子的吸附作用　纤维素酶对纤维素的降解,一般首先需要吸附到纤维素上,但并不是好的咐附才有好的催化。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关,也与底物的特性有密切相关,其能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。至于吸附过程是否可逆应视具体酶的种类而定。Nido tsky等发现,里氏木霉的CBHⅡ和EGⅢ对纤维素的吸附是个可逆过程,而CBHⅠ是个不可逆过程,同时还发现除CBHⅠ和CD外,酶组分吸附与相应的水解活力之间没有线性关系。此外,纤维素酶的吸附机制并未弄清,仍需做进一步研究。

3.2　纤维素酶中单个组分的作用机制　纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样,遵循双置换机制,即作用部分的两个色氨酸参与基质结合,而处在将被裂解的键及相邻一个非离子化的甘氨酸和一个离子化的谷氨酸残基参与催化作用。这些残基被非极性化的侧链围绕,以促进质子转移,打断N-乙酰粘质酸-N-乙酰氨基葡萄糖键。人们用定点突变技术和酶专一性抑制剂实验证明了谷氨酸位于细菌和真菌的CBH、EG和葡萄糖苷酶的催化位点,也有的纤维素酶中天门冬氨酸、组氨酸和精氨酸位于催化位点,参与催化反应。推测谷氨酸-33和天门冬氨酸-50参与葡萄糖内切酶催化;实验证明谷氨酸-

308中国微生态学杂志　2002年10月第14卷第5期　Chinese J o urnal of M icro eco lo gy,O ctober,2002,V o l14N o5 DOI:10.13381/https://www.wendangku.net/doc/185381656.html, k i.cj m.2002.05.033

65和天门冬氨酸-81,92可能是中纤维二糖水解酶的催化残基。

3.3　纤维素酶的协同降解机制　三种不同功能的纤维素酶在分解过程中存在协同作用。一般地,外切酶作用于不溶性纤维表面,使形成结晶结构的纤维素长分子链开裂,长链分子末端部分发生游离,从而使纤维素易于水化;内切酶则作用于经外切酶活化的纤维素,分解其β-1,4键,产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖,β-葡聚糖苷酶再将纤维二糖、三糖等分解成葡萄糖。但值得一提的是,该协同作用不但其作用顺序不是绝对的,就是各酶的功能也不是这样简单固定的。研究表明,EG和CBH都能引起纤维素的分散和脱纤化(沿着纤维素的经度轴方向分层,形成更薄更细的亚纤维)。这样纤维素的结晶结构被打乱,导致变形,使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间,从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙壁的压力增大,水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏,产生部分可溶性的微结晶,利于进一步被降解。

总之,纤维素酶具有以下几方面的效果:(1)补充动物内源酶。在草食动物中虽有一定量纤维素微生物存在,但产生的纤维素酶量有限,使粗纤维的消化和吸收受到一定程度的限制。添加纤维素酶可提高动物对粗纤维的利用率,同时可改善单胃动物消化道环境,使酸度增加,激活胃蛋白酶;(2)促进养分的消化吸收。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的协同作用,可破坏植物细胞壁,使细胞内容物溶解出来,由淀粉酶和蛋白酶进一步降解,提高了养分的消化,同时也增加了非淀粉多糖的消化率和饲料原料的利用率;(3)消除抗营养因子。果胶、半纤维素、β-葡聚糖酶和戊聚糖可部分溶解在水中,产生粘性,增加动物胃肠道内容物粘液,对内源酶而言是一种物理障碍,导致饲料中养分吸收率降低。而添加纤维素酶可降低粘度,增加内源性酶的扩散,提高酶与养分的接触面积,促进饲料的良好消化。

4　菌种选育

菌种选育是纤维素酶生产的基础性工作,国内外许多专家进行了大量研究,为了生产高质量的纤维素酶产品,王家林等(1996)在吸收国内外经验的基础上,先后引起了绿色木霉木10、绿色木霉Sn-91014、康氏木霉N T-15、黑曲霉X X-15A,在此基础上,采用了紫外线、特定电磁波辐射、线性加速器,亚硝基胍等物理、化学的诱变方法,获得了高产菌株N T15-H、N T15-H1、X T-15H、X T-15H1。其中木霉N T-15H 固体培养活力经轻工部食品质量监督检测中心南京站检测表明,滤纸活力为3670U/g,C1-酶活力24460L/g,Cx-酶活力1800L/g,已达到国际先进水平。此菌种在工厂化生产中性能稳定。张苓花等(1998)采用康氏木霉W-925,J-931,经过浓度为2%硫酸二乙酯和紫外线(15W、30cm、2min)复合诱变后,得到了产酶活性高的W u-932菌种,该菌种CM C糖化力达到2975,滤纸糖酶活性为531,比出发菌W-925分别提高了100%和81%。化工部饲料添加剂技术服务中心王成书等(1997)采用该中心的里氏木霉A3先进行紫外线和亚硝基胍复合诱变后,将处理过的孢子接种于纤维双层平板上,30℃培养5～8d,15℃放置7～10d,挑选透明圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再筛选,得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。

5　纤维素酶在畜禽生产中的应用

常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的纤维素。除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分外,其他动物如猪、鸡等单胃动物则很少能利用纤维素。近年来,国内外利用真菌纤维素酶成为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。

5.1　在牛日粮中的应用　焦平林等(1996)用阉牛试验,在日粮中按每头每日添加纤维素酶40g,饲喂60d,结果表明加酶组日增重892.79g,对照组日增重74

6.8g,差异有非常显著性(P<0.01)。焦平林又用30头荷斯坦奶牛进行试验,试验组按每头每日添加50g纤维素酶,结果表明,试验组15头奶牛在68d总产奶量为2916kg,而对照组15头奶牛在68d的总产奶量为2689kg,差异有显著性(P<0.05)。付连胜等(1998)报道,在瘤胃功能正常状态下,成年奶牛及育成牛饲喂纤维素酶5d后,其粪便干物质和饲喂养相比,减少30%,一周后,封闭式牛舍氨含量下降70%左右,粗饲料采食量提高8%～40%,尿中尿素下降58.9%,怀孕奶牛在产前30天始饲喂纤维素酶,分娩后,不产生生理性消化不良症状,胎儿体重可增加1.5kg,并无畸形和弱胎。产牛体质恢复快,产奶高峰维持时间长(一直至第四个泌乳月)。赵长友等(1998)综述了纤维素酶在草食动物日粮中的应用。

5.2　在鸡日粮中的应用　肉鸡日粮一般以高玉米、高豆粕为主。为减少这些常规原料的使用量,广泛采用廉价的饲料原料,秦江帆等(1996)在肉鸡日粮中提高富含纤维的麦麸比例,添加0、0.05%、0.1%纤维素酶制剂进行试验,结果表明,添加0.1%纤维素酶组比对照组在1～2、3～6、7～8周三个生长阶段日增重分别提高4.31%、4.54%、4.13%,F/G 分别下降1.56%、4.50%、4.3%。徐奇友(1998)在蛋鸡日粮中添加0.1%、0.15%、0.5%纤维素酶,结果表明,在1～10月的产蛋期间,产蛋率分别提高0.53%、1.25%、2.88%,酶水平0.15%和0.5%组的破蛋率降低34.49%、1

6.19%,蛋壳强度分别提高14.71%和8.41%。

5.3　在猪日粮中的应用　据尹清强等(1992)报道,在基础日粮中添加0.6%和1.2%纤维素复合酶,结果生长育肥猪增重比对照组分别提高1

6.84%和21.86%。Wa nk等(1993)报道,添加纤维素酶,使中性洗涤纤维消化率由30.3%提高到34.1%,酸性洗涤纤维消化率从68.8%提高到73.9%,能量消化率由69.3%提高到71.8%。

6　研究展望

我国是一个饲料资源十分紧张的国家,土地少、人口多,人畜争粮的矛盾十分突出。要保持我国饲料工业和畜牧业的持续发展,必须解决好饲料问题,否则将严重制约其发展。纤维素是自然界中十分丰富的资源,是800～1200个葡萄糖分子聚合而成。因此,可通过微生物发酵充分利用农副产品下脚料、秸秆、糠生产纤维素酶添加剂,用于提高畜禽生产性能,提高饲料利用率,改善饲料的营养价值,降低饲料成本和提高经济效益,具有广阔的开发前景,今后应进一步加强纤维素酶研究和开发工作。主要有如下几方面:

6.1　进一步加强纤维素酶的作用机制研究。纤维素酶应用于饲料,作用于动物消化道,其机制尚未清楚。从理论上决定其添加量还很困难,日前只能从实验结果来决定,受影响因素很多,往往效果不够理想。对于单用多种原料的纤维素酶最佳添加量也研究不多,这将严重制约纤维素酶的推广应用。

6.2　日前纤维素酶的产量和活性都不高,成本偏高,今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作,以提高其产量和活性,特别是要注意利用DN A基因[下转封三]

发已有近80年的历史,现已有200多种产品。我国研制、开发微生态制品较晚,但发展较快,含双歧杆菌的微生态制品较多,现已上市或正应用于临床的制剂有:口服双歧杆菌活菌制剂(回春生或丽珠肠乐)、口服双歧三联活菌胶囊(培菲康)、口服双歧杆菌三联活菌制剂(金双歧)、口服双歧四联活菌片、口服酪酸梭菌、双歧活菌胶囊和散剂等。

3.2.2　促进双歧杆菌增长因子的制剂　实验证明,寡糖主要具有促进双歧杆菌增殖、改善肠内环境、抗龋齿、升高血糖、降低血酯及促进矿质吸收等功能[9,10]。

早在1994年,Gibso n等人提出益生元(能选择刺激一种或几种细菌在宿主肠道内生长或活化,增进宿主健康而又不被宿主肠道消化的物质)的概念,并提出寡糖是一种重要的益生元[9]。选用天然植物中提取的寡糖作为微生物健康品的功能组合,与通常存在的活菌制剂相比有更大的优势:①不必保存活菌,解除了外源菌难于通过宿主胃肠道屏障的困难。②稳定性强。③有效期长。然而,在目前,制备高纯度的寡糖还存在一定技术难度。

3.2.3　双歧杆菌在食品中的应用　鉴于药品使用的局限性和食品需求的广泛性,现已在奶制品中或一些保健食品中加入双歧杆菌活菌,或加入双歧杆菌所需底物直接刺激肠道中该菌的生长。现已证明,同时使用益生元和益生菌的“合生元”,能促进外源菌的定植、肠道内有益菌生长活化,从而维持与恢复肠道内微生态平衡,促进宿主健康[11]。关于合生元的合理使用还有待于进一步研究。

3.3　双歧杆菌制剂的应用中存在的问题及展望　双歧杆菌为革兰嫌氧菌。婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌有一定的耐氧能力,而青春双歧杆菌的生长在含氧量极低时就被抑制,因此在乳制品中最好使用婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌及长双歧杆菌。

作为活菌的微生态制剂,要求在有效期内含有一定数量的存活功能菌。制剂中所有的细菌对酸、氧、水分较敏感。现代生活中乳制品和口服液占较大优势,因此选育一些既抗酸耐氧、又溶于液体制剂中较长时间存活的优质菌株是十分重要的。我国在育种方面的研究已取得了一定进展[12]。更多的优良菌种仍在进一步寻找、研究过程中。

双歧杆菌在分子生物学水平的研究、微生态调节剂的应用及抗肿瘤的应用有待进一步研究;目前双歧杆菌应用发展方向是:改良双歧杆菌现有品种、开发更优良的双歧杆菌微生态制剂,从而降低成品价格,提高产品稳定性。

随着生物技术的应用,生物制品的双歧杆菌会给人类健康带来更大福音。

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重组技术的应用,来选育出活性高、产酶量大的菌种。

6.3　加强纤维素酶检测方法研究。虽然纤维素酶的检测方法很多,但真正能适合饲料的检测方法还没有,这给实验应用工作带来困难,如无法比较不同厂家的产品质量,确定纤维素酶添加量也很困难,应组织有关力量,制订出统一的检测方法标准,供生产中应用。

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纤维素酶的作用机理及进展的研究

纤维素酶的作用机理及进展的研究 摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理； 0引言 纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。 1 纤维素酶的性质 纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。 纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。 2 纤维素酶的作用原理 （1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。 （2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。 （3）、消除抗营养因子，促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液，增加消化物的粘度，对内源酶造成障碍，而添加纤维素酶可降低粘度，增加内源酶的扩散，提高酶与养分接触面积，促进饲料的良好消化。 （4）、纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物，在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物，从而使消化道内的消化作用得以顺利进行。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素，促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外，还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化。

测定纤维素酶活实验方法总结及优化方案

DNS法测定酶活实验方法总结及优化方案 目前纤维素酶没有统一的测定方法，诸多因素影响纤维素酶酶活测定大小的比较。选择适宜的酶活测定条件，提高测定结果的准确性，可根据有关资料中采用的测定条件，以及通过控制变量法对酶活力测定中的主要影响因素进行研究。 目前实验室采用测酶活方法： 1、葡萄糖标准曲线制作： 530nm比色。 2、酶活测定方法：

考虑到酶液中培养基成分会对吸光值造成一定的影响，所以空白管0还是采用先将酶高温灭活的方法，后面保持实验条件一致，显色时间与标准曲线的显色时间保持一致。 单位酶活的计算：T n k OD ml U 1000 1 )/(???=酶活力 n ：稀释倍数； K ：曲线斜率； T ：反应时间，min ； 1000：mg 换算成ug. 以下是近期所做的实验结果： 葡萄糖标准曲线 两种产纤维素酶细菌不同测试结果

测定结果 实验结论：从以上几种对酶液的处理方法来看，183的酶活要比R2高，两种菌都是以胞外酶为主。目前尚没找到有关于加缓冲溶液并且超声破碎的文献，所得测量结果与前面三种方法均不符，这一步需另外探索。 根据《纤维素酶活力测定条件研究》（夏服宝等，《饲料工业》2005年第26卷第16期）和《影响纤维素酶活力测定的几个因素》（刘妙莲等，中国食品发酵工业研究所）这两篇文献，实验室可先从底物浓度、温度、DNS用量、显色时间以及对菌体的超声破碎时间这几方面进行探索，进而优化实验方法。 刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种， 一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板 时就加入刚果红。方法一在长出茵落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg ／mI。的CR溶液，10～15 min后，倒去CR溶液，加入物质的量浓度为l mol／I。的NaCI溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，此时，产生纤维素酶的 茵落周围将会出现透明圈。 方法二配制质量浓度为10 mg／mI。的CR溶液，灭菌后，按照每200 mI。培养基加入1 mI。的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长 出茵落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。 两种刚果红染色法的比较刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经 有超过20年的历史，课本中给出了两种方法。 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间 发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。 方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于在纤维素 粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出

真菌与细菌纤维素酶研究进展_高凤菊 (1)

第27卷第2期 唐山师范学院学报 2005年3月 Vol. 27 No.2 Journal of Tangshan Teachers College Mar. 2005 ────────── 收稿日期：2004-10-20 作者简介：高凤菊（1978-），女，河北乐亭人，四川农业大学生命科学学院硕士研究生。 - 7 - 真菌与细菌纤维素酶研究进展 高凤菊1，李春香2 （1.四川农业大学 生命科学学院，四川 雅安 625014；2.唐山师范学院 生物系，河北 唐山 063000） 摘 要：对分解纤维素真菌及细菌的种类，纤维素酶的组成和分类，分子结构、作用机理，纤维素酶基因工程及研究展望进行了综述。 关键词：真菌；细菌；纤维素酶 中图分类号：Q556+.2 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）02-0007-04 资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。生物资源是可再生性资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011~2.0×1011t ，是人类社会赖以生存的基本物质来源。其中90％以上为木质纤维素类物质，[1]其中的纤维素是地球上最丰富 的多糖物质， [2] 这类物质是植物细胞壁的主要成分，也是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量 达5.7×108t ， 约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用，主要用于燃料，畜牧饲料与积肥，不仅利用率低，还 对环境造成一定的污染。 [3] 随着世界人口迅速增长、粮食、矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。 在自然界中，许多霉菌[4]和细菌[5]都能产生纤维素酶，但有关细菌纤维素酶的报道很少。由细菌所产生的纤维素酶一般最适中性至偏碱性，因为这类酶制剂对天然纤维素的水解作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。近十几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。[6][7][8] 1 纤维素分解微生物 1.1 纤维素分解性细菌 (cellulose decomposingbacteria ) 纤维素分解性细菌是能分解纤维素的细菌。由于纤维素酶等的作用，纤维素可一直被分解到葡萄糖为止，有时在分解过程中会积累纤维二糖。这类 细菌多见于腐植土中。好氧性细菌如纤维单胞菌属（Cellulomonas ）、纤维弧菌属（Cellvibrio ）、噬胞菌属（Cytophaga ）等能分解纤维素；但在好氧条件下土壤中纤维素的分解，主要是纤维素分解真菌在起作用。而在厌氧条件下纤维素的分解，一些厌氧性的芽孢梭菌属（Clostridium ）的细菌具有重要作用。纤维素分解细菌亦可栖息于草食动物的消化道、特别是反刍动物的瘤胃中。它们在其中进行分解纤维素的活动，这些细菌是厌氧性细菌，例如产琥珀酸拟杆菌（Bacteroides succinogenes ）、牛黄瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens ）、白色瘤胃球菌（R.albus ）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens ）（程光胜 译）等。细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。但是细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶。碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有良好的应用价值，也成为研究热点，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属[9]。由于酶的耐热性在生产中具有现实意义，所以耐热细菌也是研究的热点。 1.2 纤维素分解性真菌 真菌类有黑曲霉、血红栓菌、卧孔属、疣孢漆斑菌QM460、绳状青霉、变幻青霉、变色多空霉、乳齿耙菌、腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、嗜热毛壳菌QM9381和嗜热子囊菌QM9383等[10]；丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。目前饲用纤

发酵生产纤维素酶研究进展

发酵生产纤维素酶研究进展 摘要：纤维素酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等领域。纤维素酶最主要的来源是通过微生物发酵生产。综述了纤维素酶的种类、高产纤维素酶菌种选育、发酵类型与优化等方面的研究进展，并展望了纤维素酶发酵生产的研究方向及前景。 关键词：发酵 纤维素酶 液体发酵 固体发酵 优化 纤维素原料是地球上分布广泛且含量丰富的可再生资源，其生物合成和降解过程是自然界中碳循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。随着纤维素资源越来越受到人们的重视，其能量密度低，难降解等特性却阻碍了其开发利用的进程。 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它的作用是将纤维素转化为糖类，能够降解细胞壁，使细胞内溶物释放。作为重要的工业用酶，纤维素酶广泛应用于在能源、饲料、纺织、食品、工业洗涤、石油开采、农业、医药等诸多领域。 1977年，Elwyn T. Reese 发现木霉属中的菌株具有分泌纤维素酶的能力，并将该具有分泌纤维素酶能力的菌株命名为里氏木霉（Trichoderma reese ），该发现为工业大规模发酵生产纤维素酶奠定了基础。纤维素酶广泛存在广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，其中真菌纤维素酶种类最多，最易获得和用于大规模生产，且具有较稳定的pH 、温度适应性，因此是工业用纤维素酶的重要来源。目前应用最广的纤维素酶生产菌是里氏木霉，也有曲霉属（Aspergillus ）、青霉属（Penicillium ）的菌种。 自20世纪50年代首次发现以来，便得到广泛的研究与应用。近几年来，真菌纤维素酶发酵研究主要集中在高产菌株的筛选、常规诱变育种、基因工程菌的构建、发酵工艺条件优化、发酵工艺放大和酶的分离纯化等方面。 1 纤维素酶的种类 纤维素酶(cellulase)指的是降解纤维素的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系。包括内切 1，4-葡聚糖酶（C 酶），外切葡聚糖酶 （C 酶）和β-葡萄糖苷酶（C 酶）。 X 1B 作用方式如下图：

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计_毕业设计

年产300吨纤维素酶工厂的初步设计 摘要

纤维素是年产量巨大的可再生性资源，地球上每年光合作用生成的上亿吨生物质中，纤维素占了近一半。目前，自然界中纤维素只有一小部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还会造成环境污染。利用这一年产量巨大的可再生性资源将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料，对于人类社会的可持续性发展具有非常重要的意义。 本设计采用目前认为是最好的产纤维素酶的菌种里氏木霉作为发酵菌种，液体深层发酵过程中采用变温发酵的方法分别控制菌种的生长和产酶，提取过程中采用超滤、层析等，提高产品的收率。最后采用喷雾干燥做成固态的酶制剂。 本设计的主要内容有：工厂总平面布置、全厂工艺流程设计、工艺计算、设备的计算与选型、成本核算；另外，完成设计图纸8张，有工厂总平面布置图、工艺流程图（3张）、发酵罐设计图、种子罐设计图、发酵车间设备布置图（平面图和立面图）。根据全厂工艺设计和计算结果可以看出，该设计能够达到工业生产的要求。 关键词：纤维素酶；液体深层发酵；里氏木霉

ABSTRACT Cellulose is a kind of reproducible resource of great output, it takes about a half of the hundred million biomaterial making by photosynthesis. Presently, only a few cellulose are utilized, most of cellulose are wasted and pollute environment. It is of great importance to transfer these resource to energy ,food, and so on. This design adopt Trichoderma reesei which produce cellulase best. During the liquid submerged fermentation course we chang the temperature in order to control the growth that germ grows and produce cellulase respectively. Ultrafiltration and chromatography are used In the extrace process for improve the yield. In the end we make solid zymin by spray dring . The design mainly include the contents hereinafter: the layout of the whole factory ,the craft argumentation of the whole factory，the calculation of the craft，the calculation and type choosing of main equipments, the calculation of the costs. And design 8 charts , that are the layout of the whole factory, the design of the craft process(3), the design of the fermentation pot, the design of seeding tank, the lay out for equipments of the fermentation workplace(ichnography and space).According to the craft argumentation of the whole factory and the result of the calculation, the design can come up to the request of industrialization. Keywords: Cellulase; liquid submerged fermentation;; Trichoderma reesei

纤维素酶的检测方法

纤维素CMC酶、FPA酶和半纤维素酶测定 1.纤维素CMC酶 1.0标题 用3.5一二硝基水杨酸法测定纤维素CMC酶活性单位。 2.0范围 生产分析和质量控制部门适用。 3.0原理 纤维素CMC酶（EC3.2.1.4）水解羧基纤维素分子中β－1.4葡萄糖苷键,释放出的还原糖(以葡萄糖计)与3.5二硝基水杨酸(DNS)反应,产生颜色变化,这种颜色变化与释放还原糖(以葡萄糖计)的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。 4.0试剂 4.1无水醋酸钠(分析纯) 4.2冰醋酸(分析纯) 4.3 3.5－二硝基水杨酸 4.4无水葡萄糖 4.5四水酒石酸钾钠(分析纯) 4.6氢氧化钠(分析纯) 4.7重蒸苯酚(分析纯) 4.8无水亚硫酸钠(分析纯) 4.9叠氮化钠(分析纯) 4.10羧甲基纤维素钠 5.0仪器 5.1水浴锅(恒温)50±1℃ 5.2电热干燥箱80±1℃ 5.3 722型分光光度机计 5.4分析天平感量0.1㎎ 5.5一级玻璃制品 5.6电冰箱 6．0试剂的准备 6．1乙酸－乙酸钠缓冲溶液（PH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。 以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。 6.2 DNS试剂: 溶液A:称分析纯NaOH 104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3.5一二硝基水杨酸。 溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml热水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。 将A、B溶液混合，定容至5000ml，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后可使用。 6.3 CMC溶液：用羧甲基纤维素钠（CMC）以PH4.8醋酸缓冲液配成1%的溶液。 7．0标准曲线制作： 7.1无水葡萄糖80℃烘干至恒重。 7.2准确称取1.000g溶于1000ml水中，加10mg叠氮化钠防腐，4℃冷藏备用。 7.3标准葡萄糖曲线制作

纤维素酶固体发酵工艺的改良研究

纤维素酶固体发酵工艺的改良研究 （生命科学学院，生物技术专业黄泽锦） （学号：2000302063） 摘要：纤维素酶的固体发酵对发酵培养基的要求是很严格的，如培养基灭菌，无菌操作的等等，都是限制纤维素酶应用于生产的一个重要原因。本实验通过一种对细菌抑制效果强，但对霉菌抑制能力一般的抑制剂对发酵过程进行控制，运用3，5－二硝基水杨酸法（DNS法）来测定羧甲基纤维素酶活（CMCase）及滤纸糖酶活（FPA,FPase）。探讨是否能够实现在培养基未灭菌或者在有菌操作下实现纤维素酶的固体发酵，简化实验对培养基和操作过程的操作要求，进而为纤维素酶的工业化生产提供一定实验依据。 关键词：纤维素酶，抑菌剂，CMCase，Fpase，酶活力 教师点评：本论文应用了自制的抑菌剂于纤维系酶的固体发酶工艺中，有一定抑制细菌的能力，但又不影响霉菌的产纤维素酶的活性，为简化固体发酵工艺探索了一条新的途径，有一定的实用参考价值。（点评教师：余少文，副教授） 一．前言 纤维素占全球植物总干重的30%—50%，是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物[1]，但是，纤维素分子是由葡萄糖分子通过β-1，4糖苷键连接而成的链状高分子聚合物，每个大分子中含的葡萄糖残基数一般为8000--12000个。天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成，其结晶度一般在30%—80%之间。在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55x109t，其中有89%尚未被利用或未被合理利用（如直接焚烧）目前全世界被开发利用的农林纤维副产物不足2%，我国约有50%以上的农林废弃物在田间地头被白白烧掉。全世界每年因农林废弃物焚烧不仅造成直接的经济损失达数十亿元，而且由于焚烧而产生的滚滚浓烟及排放的大量有害气体严重影响了公路、航空的安全，污染了环境，对气候、生态等也造成了严重的影响。而同时在另一方面，世界上还有十多亿人口由于粮食不足而遭受饥饿、营养不良。灾荒或战乱造成的粮食危机依然是正存在的和潜在的威胁；随着全球经济的飞速发展，地球上石油、煤炭的储量正以惊人的速度减少，能源危机成了世界大多数国家所面临的一个严峻问题；由于对资源的破坏性开采和利用，人类赖以生存的环境正在不断地恶化，对可再生资源利用的研究与开发的可持续发展战略已在世界各国逐步展开。植物纤维素资源的开发利用对解决粮食和能源短缺以及环境污染问题有极其深远的意义。 经过多年的实验研究，虽然取得不上成果，但是实验的成本却总是居高不下，使得实验成果不能很好的应用到生产中，本实验通过研究抑菌剂对霉菌的影响，实现的对实验要求的降低。本测试方法对纤维素工业应用中，对控制生产过程、产品质量及降低成本具有一定的实际指导意义。 1.1. 纤维素酶的概述 1.1.1 纤维素酶的组分：一个完整的纤维素酶系，通常由作用方式不同而能相互协同催化 水解纤维素的三类酶组成，即(1)内切葡萄糖苷酶(endo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．4，简称EG、Cx)。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β—1，4—糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。(2)外切葡萄糖苷酶(exo—1，4—β—D—glucanase，EC3．2．1．91，C1)，又称纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase，简称CBH)。这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β—1，4糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。 (3) β—葡萄糖苷酶(β—glucosidase，EC3．2．1．21，简称BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

纤维素酶的基因克隆研究进展

纤维素酶的基因克隆研究进展 摘要：纤维素酶是一种高活性生物催化剂，具有广阔的开发和应用前景。本文对纤维素酶的特性、研究进展、应用以及纤维素酶基因克隆等方面进行了综述，并对今后的研究趋势作了预测和展望。 关键词：纤维素酶；分子生物学；基因克隆；前景展望 前言 纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物干重的1/3—1/2，它是地球上分布最广、含量最丰富、生成量最高的有机化合物。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。利用纤维素酶将纤维素彻底水解是纤维素的有效利用途径。纤维素酶(cellulase)是指能水解纤维素β—l，4葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。近年来对纤维素酶的基础研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能以及酶蛋白的基因调控等诸多方面，并且均取得了显著进展。由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。 1.1 纤维素酶的组成 纤维素酶是由许多高协同作用的水解酶组成的，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。 (1)外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子的末端，一次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。对于外切纤维素酶，传统上认为是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖。可是，从一些微生物的外切酶的研究中发现了另一种纤维素酶，它们优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。这些研究说明存在两种不同功能的外切酶，它们分别从还原端和非还原端水解纤维素分子[ 1 ]。 （2）内切葡聚糖酶，这类酶是纤维素酶中最重要的酶，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。

纤维素酶的研究进展及应用前景

纤维素酶的研究进展及应用前景 摘要 我国近年来在纤维素酶研究应用领域取得了很大进展。纤维素酶是一组能够分解纤维素产生葡萄糖的酶的总称，按照功能可以分为内切葡糖聚酶，外切葡糖聚酶和β-葡聚糖苷酶。它在纺织，酿酒，食品与饲料行业的市场潜力是巨大，受到国内外业内人士的看重。本文综述了纤维素酶的组成，结构，分类，理化性质与作用机理，阐明了生产纤维素酶的微生物种类，纤维素酶的发酵工艺及高效分解菌。介绍了纤维素酶的特性，重要意义，在各领域的应用，并对其未来研究趋势进行了展望。 关键字：纤维素酶研究应用 前言：因为资源枯竭、能源短缺及环境污染等问题日益加剧，世界各国都在寻找开发新能源。纤维素类物质是自然界中分布最广泛、含量最丰富、生成量最高的有机化合物，也是自然界中数量最多的可再生类质。但这些纤维素大部分没有被开发，造成巨大的资源浪费和环境污染。近年来关于纤维素酶的基础研究获得了显著的进展，主要包括酶的组成部分和结构、发生降解的机理、基因的克隆和表达、酶的发酵和生产、应用等方面。由此可见生产纤维素酶对人类生存环境的改善和可持续发展有着举足轻重的地位。 1，纤维素酶的来源和分类 纤维素酶的最主要来源是微生物，用其生产是最为有效和方便的。不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显。对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用。而真菌具有产酶的诸多优点：产酶能力强，产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；酶之间有强烈的协同作用，降解纤维素的效率高。纤维素酶是一类能够把纤维素降解为低聚葡萄糖、纤维二糖和葡萄糖的水解酶。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。由四个部分构成：脚手架蛋白、凝集蛋白和锚定蛋白结合体、底物结合区域和酶亚基。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，如子囊菌纲和担子菌纲等的一些种属。它是由不同的三种酶所构成的混合物，即内切葡聚糖酶、外切葡苷糖酶和B一葡萄糖苷酶。 2，纤维素酶的组成与结构 因为种类和来源的不同，纤维素酶的结构存在较大差异，但是通常均具有2

纤维素酶的介绍

纤维素酶的生产方法及在食品行业的应用 纤维素酶的生产方法及在食品行业的应用 纤维素酶（cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。 纤维素酶在扩大食品工业原料和植物原料的综合利用，提高原料利用率，净化环境和开辟新能源等方面具有十分重要的意义。 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物、细菌、放线菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。 目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉属（Trichoderma）、曲霉属（As pergillus）和青霉属（Penicillium）,特别是绿色木霉（Trichoder mavirde）及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。 现已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉等纤维素酶。同时，反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可以利用瘤胃液获得纤维酶的粗酶制剂。另外，也可利用组织培养法获得所需要的微生物。 纤维素酶的生产方法 目前，纤维素酶的生产主要有固体发酵和液体发酵两种方法。 固体发酵法固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素生产

厂家均采用该技术生产纤维素酶。然而固体发酵法存在根本上的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制。目前，我国纤维素酶生产厂家只能采用直接干燥法粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，其产品外观粗糙且质量不稳定，发酵水平不稳定，生产效率较低，易污染杂菌，不适于大规模生产。 液体发酵法液体发酵生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下进行灭菌处理，然后送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70h，温度低于60℃。采用除菌后的无菌空气从釜低通入进行通气搅拌，发酵完毕后的物料经压滤机板框过滤、超滤浓缩和喷雾干燥后制得纤维素酶产品。液态深层发酵由于具有培养条件容易控制，不易染杂菌，生产效率高等优点，已成为国内外重要的研究和开发方向。 纤维素酶的应用 制酒 在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出 酒率和原料的利用率，降低溶液的黏度，缩短发酵时间，而且酒的口感醇香，杂醇油含量低。纤维素酶提高出酒率的原因可能有两方面：一是原料中部分纤维素分解成葡萄糖供酵母使用；另外，由于纤维素酶对植物细胞壁的分解，有利于淀粉的释放和被利用。 将纤维素酶应用于啤酒工业的麦芽生产中可增加麦粒溶解性，

纤维素酶研究进展及固定化技术

纤维素酶研究进展及固定化技术 摘要: 纤维素酶是一类能够水解纤维素的β-D-糖苷键生成葡萄糖的多组分酶的总称。传统上将其分为3类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶属于糖苷水解酶类，近年来，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族。本文介绍了纤维素酶的研究进展，主要包括纤维素酶的性质及作用机理，应用与发展趋势，来源及生产技术，分离纯化方法，最后介绍几种常用的纤维素酶固定化方法。 关键词: 纤维素酶；研究进展；固定化 引言： 纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的生物质，也是最廉价的可再生资源。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，它们协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解为葡萄糖。自1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现纤维素酶至今已有一百余年了，随着在工业上的广泛应用，特别是在纺织工业、能源工业上的应用，纤维素酶已成为最近十几年酶工程研究的一个焦点。近年来有关纤维素酶的研究，包括酶的氨基酸序列、基因的克隆与表达、酶蛋白的空间结构与功能，以及酶蛋白的基因调控等诸多方面都取得显著进展。到目前为止，登记在Swiss-Protein数据库的纤维素酶的氨基酸序列有649条，基因序列有433条。我国对纤维素酶的研究始于上世纪50年代，迄今已有50多年的历史。在纤维素酶的菌种开发、发酵培养、基因的克隆与表达、纤维素酶的固定化，以及纤维素酶在纺织、能源等方面的应用都取得较大进展。 1 纤维素酶的性质及作用机理 纤维素酶分子的大小因来源不同而不尽相同，三大类酶分子量一般在23Kda～146Kda之间。多数真菌和少数细菌的纤维素酶都受糖基化，糖基与蛋白之间以共价键结合，或呈可解离的络合状态。糖基化作用在一定程度上保护酶免受蛋白酶的水解，而纤维素酶正是由于糖基化，使其所含碳水化合物的比率在不同酶之间发生差异，导致酶的多形式和分子量的差别。通过比较分析，人们发现许多不同纤维素酶间表现出一定的同源性，且纤维素酶分子普遍具有类似的结构。由球状的催化结构域(CD)、连接桥和纤维素结合结构域(CBD)三部分组成。(1)连接桥，可能是保持CD和CBD之间的距离，也可能有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体；(2)纤维素结合结构域，它对酶的催化活力是非必需的，但它执行调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用，其结合纤维素的作用机理目前尚不十分清楚；(3)催化结构域，它体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。尽管不同来源纤维素酶的分子量大小差别很大，但它们催化区的大小却基本一致。 研究表明，EG和CBH能引起纤维素的分散和脱纤化。纤维素酶通过打乱纤维素的结晶结构，使其变形，深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微型隙壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被降解。（1），对纤维素分子的吸附作用：纤维素酶对纤维素的降解，一般首先吸附到纤维素上，但并不是吸附的越好催化效果约好。纤维素酶的吸附不仅与酶本身性质有关，也与底物的特性密切相关。其吸附能力大小与酶的含糖量和疏水性均有关联。此外，纤维素酶的吸附机理并未弄清，仍需做进一步研究。（2），单一纤维素酶的作用机制：纤维素酶的断键机理

生物技术生产纤维素酶及其应用研究进展

Vol.15,No.18精细与专用化学品第15卷第18期 Fine and Specialty Che m icals2007年9月21日技术进展 生物技术生产纤维素酶 及其应用研究进展 刘　颖3　张玮玮 (哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨150076) 摘　要:简要介绍纤维素酶的酶学性质、降解机制、生产工程菌的选育、纤维素酶的应用情况,以及对纤维素酶生产与应用方面存在的问题和未来发展趋势进行了分析与探讨。纤维素酶在食品、酿造行业、农副产品深加工、饲料、医药、环境保护和化工等领域有着非常广阔的应用前景和应用潜力。我国纤维素酶的生产及应用研究近年来取得了很大进展,今后必将在应用深度和广度上进一步扩展。 关键词:纤维素酶;发酵;克隆;生物技术 Cellul a se Produced by B i otechnology and Its Appli ca ti on Progress L I U Ying,ZHAN G W ei2w ei (College of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin150076,China) Abstract:The enzy mol ogical p r operties of cellulase,degradati on mechanis m,the selecting culture of engineering m i2 cr oorganis m and the app licati on p r os pect of bi otechnol ogy in cellulase industry are intr oduced briefly.The existing p r oble m s in cellulase p r oducti on and app licati on and the devel opment trend in the future are analyzed and discussed.The p r os pect and potential of app licati ons of cellulase are wide,es pecially in the fields of f ood industry,fer mentati on industry,deep2p r o2 cessing of far m ing p r oducts,f orage,medicine,envir on mental p r otecti on and che m ical industry.A great p r ogress has been made in the cellulase devel opment and app licati on recently in China,and in the future it will be certainly expanded deep ly and comp rehensively. Key words:cellulase;fer mentati on;cl one;bi otechnol ogy 纤维素是地球上数量最大的可再生资源,微生物对它的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。纤维素的生物转化与利用对当前世界能源危机、粮食短缺和环境污染等问题具有重要的意义。近年来,我国纤维素酶的应用研究十分活跃,已筛选到一批高产菌株。随着分子生物学、遗传工程的迅猛发展,国内外均在尝试应用基因工程技术来改造和构建高效纤维素降解菌。这些菌具有独特的酶学性质,扩大了纤维素酶的应用范围。根据纤维素酶遗传特性而构建的高效纤维素分解菌开辟了纤维素酶生产的新途径。 1　维素酶的性质及其降解机制 纤维素酶是一种糖蛋白,它是一个多组分的诱导酶系,采用层析分离和电泳技术等可将纤维素酶分成不同的组分。目前普遍认为,完全降解纤维素至少需要由3种功能不同但又互补的纤维素酶协同作用才能将纤维素水解至葡萄糖,它们是EG(内切葡聚糖酶)、CBH(外切葡聚糖酶)和CB(纤维二糖酶或β2葡萄糖苷酶)。纤维素的降解过程,首先是纤维素酶分子吸附到纤维素表面,然后,EG(内切 ? 8 ? 3收稿日期:2007207212 　作者简介:刘颖(19682),女,副教授,研究方向为食品生物技术。

半纤维素酶降解机制

纤维素酶（cellulase牘是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单成分酶，而是由多个酶起协同作用的多酶体系。人们已对纤维素酶的作用机制及工业化应用等方面进行了大量的研究，为纤维素酶的生产和应用打下了良好的基础。其在扩大食品工业原料和植物原料的综合利用，提高原料利用率，净化环境和开辟新能源等方面具有十分重要的意义。 纤维素酶的来源 纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、微生物、细菌、放线菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。由于放线菌的纤维素酶产量极低，所以研究很少。细菌产量也不高，主要是葡萄糖内切酶，但大多数对结晶纤维素没有活性，并且所产生的酶是胞内酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加了提取纯化的难度，在工业上很少应用。目前，用于生产纤维素酶的微生物菌种较多的是丝真菌，其中酶活力较强的菌种为木霉属（Trichoderma）、曲霉属（As pergillus）和青霉属（Penicillium）牞特别是绿色木霉（Trichoder mavirde）及其近缘菌株等较为典型，是目前公认的较好的纤维素酶生产菌。现已制成制剂的有绿色木霉、黑曲霉、镰刀霉等纤维素酶。同时，反刍动物依靠瘤胃微生物可消化纤维素，因此可以利用瘤胃液获得纤维酶的粗酶制剂。另外，也可利用组织培养法获得所需要的微生物。 纤维素酶的生产方法 目前，纤维素酶的生产主要有固体发酵和液体发酵两种方法。 固体发酵法固体发酵法是以玉米等农作物秸秆为主要原料，其投资少，工艺简单，产品价格低廉，目前国内绝大部分纤维素生产厂家均采用该技术生产纤维素酶。然而固体发酵法存在根本上的缺陷，以秸秆为原料的固体发酵法生产的纤维素酶很难提取、精制。目前，我国纤维素酶生产厂家只能采用直接干燥法粉碎得到固体酶制剂或用水浸泡后压滤得到液体酶制剂，其产品外观粗糙且质量不稳定，发酵水平不稳定，生产效率较低，易污染杂菌，不适于大规模生产。 液体发酵法液体发酵生产工艺过程是将玉米秸秆粉碎至20目以下进行灭菌处理，然后送发酵釜内发酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约为70h，温度低于60℃。采用除菌后的无菌空气从釜低通入进行通气搅拌，发酵完毕后的物料经压滤机板框过滤、超滤浓缩和喷雾干燥后制得纤维素酶产品。液态深层发酵由于具有培养条件容易控制，不易染杂菌，生产效率高等优点，已成为国内外重要的研究和开发方向。 纤维素酶的应用 制酒在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率和原料的利用率，降低溶液的黏度，缩短发酵时间，而且酒的口感醇香，杂醇油含量低。纤维素酶提高出酒率的原因可能有两方面：一是原料中部分纤维素分解成葡萄糖供酵母使用；另外，由于纤维素酶对植物细胞壁的分解，有利于淀粉的释放和被利用。 将纤维素酶应用于啤酒工业的麦芽生产中可增加麦粒溶解性，加快发芽，减少糖化液中单一葡萄糖含量，改进过滤性能，有利于酒精蒸馏。 酱油酿造在酱油的酿造过程中添加纤维素酶、可使大豆类原料的细胞膜膨胀软化破坏，使包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物释放，这样既可提高酱油浓度，改善酱油质量，又可缩短生产周期，提高生产率，并且使其各项主要指标提高3％。 饮料加工日本有专利报道，用纤维素酶处理豆腐渣后接入乳酸菌进行发酵，可制得营养、品味俱佳的发酵饮料。将纤维素酶应用于果蔬榨汁、花粉饮料中，可提高汁液的提取率（约10％）和促进汁液澄清，使汁液透明，不沉淀，提高可溶性固形物的含量，并可将果皮综合利用。目前，有报道已成功地将柑橘皮渣酶解制取全果饮料，其中的粗纤维有50％降解为短链低聚糖，即全果饮料中的膳食纤维，具有一定的保健医疗价值。 纤维废渣的回收利用应用纤维素酶或微生物把农副产品和城市废料中的纤维转化成葡萄糖、酒精和单细胞蛋白质等，这对于开辟食品工业原料来源，提供新能源和变废为宝具有

纤维素酶的发酵生产实验报告

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验 一、实验目的 1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺 3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理 纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。 以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制 1、生产菌种：黑曲霉 2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。 3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO 4·7H 2 O = 7.0 g/L ;NH 4 NO 3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH 2PO 4 = 2.0 g/ L ;Na 2 HPO 4 =3.0 g/ L ,pH7.4。 4、微量元素液：FeSO 4·7H 2 O 5.0mg/L，MnSO 4 ·H 2 O 1.6mg/L，ZnSO 4 · 7H 2 O 1.4mg/L， CoCl 2 2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。 5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。 6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水12 ml（含1%微量元素液，1%氯化铵或硫酸铵，0.05%蛋白胨），自然pH值。 7、6% DNS试剂：称取酒石酸钾钠182g溶于500ml水中，加热溶解，于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6g，20.8gNaOH,5g苯酚，5g无水亚硫酸钠，加热搅拌溶解，冷却后定容至1000ml。储存在棕色瓶中放置一周后使用。（提前配制）