Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及个人心得体会（二）

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Western操作步骤

（一）蛋白样品制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合）

4. 每瓶细胞加400 μl 含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行）

6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）

7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。

（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）

（2）组织中总蛋白的提取：

1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。

2. 弃上清，加入4ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm 离心5min。弃上清后用PBS 重复洗涤一次。

3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。

（二）蛋白含量的测定

（1）制作标准曲线

1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。

2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

3. 按下表在各管中加入各种试剂。

4. 混匀后，室温放置 2min。在生物分光光度计上比色分析。

（2）检测样品蛋白含量

1. 取足量的1.5ml 离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min 后即可用于测蛋白。

2. 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl 溶液100 μl，混匀放置2 分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank 测空白样品。

3. 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2 次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4. 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl溶液和5μl 待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample 键测样品。

注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2 次，无菌水洗一次。可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。

（上述方法只是一家之言，可以自我变通，本人就不是按照上述方法进行的）

（三）SDS-PAGE 电泳

（1）清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样

1. 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶）

2. 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml 枪吸取5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）

3. 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4. 按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1~2 次就行了，不补胶问题也不大）。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5. 用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（冲洗的话个人感觉可以使用5ml 的针筒，当然操作不能太粗暴了）

6. 测完蛋白含量后，计算含20-50μg 蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。取出上样样品至200μl的EP 管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl 样品）（其实大一点的垂直电泳槽每孔最大上

样量可以达到40μl，胶做得很好的话50μl也是问题不大的）上样前要将样品于沸水中煮5~10min 使蛋白变性。（本人心得：可以使用PCR 仪进行变性，加快速度，这样就不用将水煮沸了，同时在水中煮蛋白样品有下面弊端：1.EP管容易炸开，样品丢失；2.容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量） 7. 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染）

（3）电泳：

电泳时间一般 4~5 h，电压为40V 较好，也可用60V。（本人为了加快速度，浓缩胶时用80-100V 跑，到分离胶以后用 150-200跑，结果也不错，总时间 2h 左右）电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜（如果目的条带比较大的话，最好使用可视的蛋白marker，Fermentas 的0441 和0671比较好，就是有点贵。一般要让目的条带跑过分离胶的1/3 比较好，不要局限于此说明）。

（四）转膜

（1）转一张膜需准备6 张7.0~8.3cm 的滤纸和1 张7.3~8.6cm 的PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的PVDF膜置于水上浸2 h 才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水）（个人感觉其实转膜之前浸湿一下就ok 了，没有多大问题，可能按照上述操作结果会更好）

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起再垫于垫子上，注：个人感觉就垫1 张滤纸也没问题呀），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬（应该边撬边用流水缓缓冲洗）。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，胶很易裂，要用巧劲）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通）（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置（价格不菲，尤其是进口的），第一次做的应请老手指教）（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V 转移2 h 或40V 转移3 h。（1.实际上应该根据蛋白分子量的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫两块PVDF膜，以免转膜过头，因为如果第一张膜上蛋白质已经转过了，第二张膜上还有蛋白质可以进行检测；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，一般80-100V，时间也要延长一点，开始最好也用两块膜，特别是务必注意加强降温措施。当然转膜是要摸条件的，最好刚开始做的时候摸个转膜的时间梯度。如果由于时间原因来不及做下面实验，可以在4 度下12V 转膜过夜）（2.PVDF膜建议使用0.22μm 的小孔径膜，不容易转膜过头）（3.不同的转膜装置，转移效率是不一样的，所以换用转膜装置，最好再摸个条件）（4. 转膜时电极方向注意是膜正胶负）

（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。（一般不需要做这步）

（五）免疫反应（个人建议：还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育，节约抗体）

（1）将膜用TBS 从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 1h。

（2）将一抗用TBST 稀释至适当浓度（在1.5ml 离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1~2h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS 洗一次，10min。

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1~2h 后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次 10min；再用TBS 洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六）化学发光，显影，定影

（1）将A 和B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X-片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min 或 5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1~2min（20~25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5~10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。（如果使用柯达的显影定影液，时间很快的，显影结束后最好先用事先准备好的自来水洗一下片子，然后再放到定影液中进行定影，这样可以延长定影液使用时间，从而节约定影液）应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

Western-Blot 操作流程及个人心得体会（一）

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Western Blot原理

Western Blot是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。Western的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。仪器

高压锅、玻璃匀浆器、低温高速离心机、ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计、-20℃低温冰箱、稳压稳流电流仪、垂直式电泳槽、JY-系列半干式转移电泳槽、电热恒温培养箱、多用脱色摇床、杂交袋封口机、分析天平、pH值调节器、暗室红灯、压片暗盒、0.1~2.5μl /100μl/200μl/1000μl移液器

杂品与耗材

10μl/200μl/1000μl吸头；200μl/1000μl离心管；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；0.22umPVDF 膜；3mm滤纸；吸水纸；乳胶手套；杂交袋；保鲜膜；搪瓷盘(>20×20cm)；柯达X-OMAT BT胶片；玻璃棒；计时器；ddH2O

试剂

单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS(pH7.3)、10%分离胶、4%浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl 溶液、2×（5×）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10×丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗

脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

试剂配制

（一）母液

250ml，高温灭菌后室温下保存。

1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF

溶解后，高压灭菌，室温保存。

溶解后，4℃保存，保存时间为1 周。

（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

溶解后，用浓盐酸调pH 至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。

溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（50mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、1% Triton X-100、100ug/ml PMSF）

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。（一般实际用的比较多的其实是RIPA 裂解配方：50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1

混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为1 mM PMSF（1ml 裂解液加入1.74mg/ml PMSF100μl）。

（如果用TBST 进行洗膜的话，其实PBS 用得很少，大可不必自己配制，向试剂公司购买20×的 PBS 浓缩液即可，500ml 的浓缩液不到50 元，很方便）

高温灭菌后，室温保存。

溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用 0.15 mol/L NaCl 进行100 倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。10％分离胶和4％浓缩胶

加TEMED 后，立即混匀即可灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED 量加大，一般加至原来的2-3 倍，根据实验当时的温度适当调整）

还原型5×SDS 上样缓冲液(0.25 mol/L Tris?HCl（pH6.8），0.5mol/L二硫叔糖醇，10%SDS，0.5% 溴酚蓝，50%甘油)

溶解后室温保存，此溶液可重复使用 3~5 次。

（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成10×电泳液缓冲液进行保存，稀释10 倍使用）

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3~5 次（此溶液最好保存在4 度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。

（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris 和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris 和SDS等比较困难）

使用时将其稀释10 倍。

）

最好现用现配。

洗脱抗体缓冲液(100mmol/L 2-Mercaptoethanol，2%SDS，62.5mmol/L Tris?HCl pH6.8)

至1 倍。

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

室温保存

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的定影液，上千；没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

抗体

用TBST稀释至一定浓度使用，建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）。

化学发光试剂

分A 和B 两种试剂，有钱可以购买Amersham、Pierce 或者Santa Cruz 的，没钱的话碧云天的ECL也能凑合

westernblot详细图解

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

大数据分析的六大工具介绍

大数据分析的六大工具介绍 2016年12月 一、概述 来自传感器、购买交易记录、网络日志等的大量数据，通常是万亿或EB的大小，如此庞大的数据，寻找一个合适处理工具非常必要，今天我们为大家分学在大数据处理分析过程中六大最好用的工具。 我们的数据来自各个方面，在面对庞大而复杂的大数据，选择一个合适的处理工具显得很有必要，工欲善其事，必须利其器，一个好的工具不仅可以使我们的工作事半功倍，也可以让我们在竞争日益激烈的云计算时代，挖掘大数据价值，及时调整战略方向。 大数据是一个含义广泛的术语，是指数据集，如此庞大而复杂的，他们需要专门设il?的硬件和软件工具进行处理。该数据集通常是万亿或EB的大小。这些数据集收集自各种各样的来源:传感器、气候信息、公开的信息、如杂志、报纸、文章。大数据产生的其他例子包括购买交易记录、网络日志、病历、事监控、视频和图像档案、及大型电子商务。大数据分析是在研究大量的数据的过程中寻找模式, 相关性和其他有用的信息，可以帮助企业更好地适应变化，并做出更明智的决策。 二.第一种工具:Hadoop Hadoop是一个能够对大量数据进行分布式处理的软件框架。但是Hadoop是 以一种可黑、高效、可伸缩的方式进行处理的。Hadoop是可靠的，因为它假设计算元素和存储会失败，因此它维护多个工作数据副本，确保能够针对失败的节点重新分布处理。Hadoop 是高效的，因为它以并行的方式工作，通过并行处理加快处理速度。Hadoop还是可伸缩的，能够处理PB级数据。此外，Hadoop依赖于社区服务器，因此它的成本比较低，任何人都可以使用。

Hadoop是一个能够让用户轻松架构和使用的分布式计算平台。用户可以轻松地 在Hadoop上开发和运行处理海量数据的应用程序。它主要有以下儿个优点: ,高可黑性。Hadoop按位存储和处理数据的能力值得人们信赖。，高扩展性。Hadoop是 在可用的计?算机集簇间分配数据并完成讣算任务 的，这些集簇可以方便地扩展到数以千计的节点中。 ，高效性。Hadoop能够在节点之间动态地移动数据，并保证各个节点的动 态平衡，因此处理速度非常快。 ，高容错性。Hadoop能够自动保存数据的多个副本，并且能够自动将失败 的任务重新分配。 ,Hadoop带有用Java语言编写的框架，因此运行在Linux生产平台上是非 常理想的。Hadoop上的应用程序也可以使用其他语言编写，比如C++。 第二种工具:HPCC HPCC, High Performance Computing and Communications（高性能计?算与通信）的缩写° 1993年，山美国科学、工程、技术联邦协调理事会向国会提交了“重大挑战项 U：高性能计算与通信”的报告，也就是被称为HPCC计划的报告，即美国总统科学战略项U ,其U的是通过加强研究与开发解决一批重要的科学与技术挑战 问题。HPCC是美国实施信息高速公路而上实施的计?划，该计划的实施将耗资百亿 美元，其主要U标要达到:开发可扩展的计算系统及相关软件，以支持太位级网络 传输性能，开发千兆比特网络技术，扩展研究和教育机构及网络连接能力。

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程 （一）组织中总蛋白的提取 用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min, 段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，） 20-30s,每隔5min 后在 4℃下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80℃冰箱保存。 （二）BCA法蛋白含量的测定 (1) 从-20℃取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 (3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37℃水浴锅30min后取出。 (4)酶标仪测定OD值。 (5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。 （三）稀释蛋白及蛋白变性 如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100℃的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20℃冰箱保存。 （四）制作SDS电泳胶 ⑴清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 ⑵配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul ⑶分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 ⑷制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul

Western超详细实验步骤

Western实验步骤 1. 电泳(Electrophoresis) （1）SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶进行配制，配方试剂去离子水，Arc-HCL(29:1)，10%APS，SDS,TEMED。 一般按分子大小配胶，现实验分离胶配12%-15%的胶，浓缩胶10%的胶。 配胶步骤： 1.清洗玻璃板，装好（注意不要漏即玻璃板要对齐）。 2.按比例配分离胶（8ml-10ml） 3.加水压胶，待分离胶凝固后（可见有分离胶与水有分隔线，一般凝固时间30分钟-1小时左右），吸走上层水面 4.按比例配浓缩胶（3ml-4ml），加入分离胶上层，插入梳子，（注意别有气泡），待凝。（如果今日不上样可以放入4°C冰箱） 注意：玻璃板要洗得干净；玻璃板要装好，不要漏；制胶过程中，一定要充分混匀，而且避免有气泡；（2）样品处理 1.准备无菌EP管，向EP管内加入样品蛋白质体积的1/4体积的SDS缓冲液（5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，现样品加 3.5ul），之后加入相应蛋白样品（要制冰，蛋白质样品要放置在冰上），充分吹打混匀 2.100℃水浴加热5分钟，以充分变性蛋白。 3.12000r离心5分钟。 （3）上样与电泳 1.将玻璃板装入电泳槽中，加电泳缓冲液至泳槽的的2/3左右 2.蛋白质样品冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可，样品两边加蛋白质Maker(6ul)（注意上样蛋白质顺序，一定不要弄错）。 3.通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为100分钟（一般为90-120分钟）。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。（为了避免电泳过头，最好是在电泳设定时间的提前30分钟观察电泳） 注意：上样时尽量避免样本被上漏出孔外；注意电泳时间的把握；最重要的是一定要记录上样顺序，必要时记录在本子上。 3.转膜(Transfer) 1.物品准备，甲醇，转膜缓冲液，滤纸，转膜槽，玻璃皿3个，制冰。 2.取下胶板，用专门的板将玻璃板分离（务必不要将胶弄破，动作轻些，从下面和上面分离玻璃板），切适合大小的胶（不要切掉MAKER）。 3.用专门的板将胶转入事先放有转膜缓冲液的皿中，记录胶的顺序，剪与胶同等大小的滤纸和转膜纸PVDF膜，PVDF膜要放入甲醇中浸15秒（一般1-2分钟），胶要切角做标记（不要切到maker）,一般一个切三个角，一个切一个角，记录顺序 4.铺膜，PVDF膜铺在胶上，在PVDF膜上铺三层滤纸，然后胶的对侧面铺三层滤纸即可（滤纸要大于等PVDF膜，PVDF膜要大于等胶），赶尽气饱。 5.再将铺好的膜胶滤纸，转入转膜夹中，有PVDF膜这面放在正极侧（即无色透明夹这面），再将夹子放入转膜槽里（电极不要放错，蛋白质带负电的）

WB实验步骤

Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续

平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：

Western操作步骤

Western-Blot 操作流程及注意事项 Western操作步骤 （一）蛋白样品制备 （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2. 每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2~7.3）。平放轻轻摇动1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3. 按1ml 裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合） 4. 每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行） 6. 于4℃下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷） 7. 将离心后的上清分装转移倒0.5min 的离心管中放于-20℃保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100~200μl 的裂解液，按照上述操作，直接用200μl 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强） （2）组织中总蛋白的提取： 1. 将少量组织块置于1~2ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。 2. 加400 μl 单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。 3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。 4. 裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml 离心管中，然后在4℃下12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取： 由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取： 1. 将培养液倒至15ml 离心管中，于2500rpm 离心5min。 2. 弃上清，加入4ml PBS并用枪轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后PBS 重复洗涤一次。 3. 用枪吸干上清后，加100 μl 裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。 4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml 离心管中并置于-20℃保存。 （二）蛋白含量的测定 （1）制作标准曲线 1. 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 2. 取18 个1.5ml 离心管，3 个一组，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg ，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。

westernblot实验详细步骤(1)

Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分

2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜

PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h

（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二

western转膜条件

western 转膜条件 蛋白来源：RAW264.7 总蛋白蛋白名称（可保密）：一些转录因子蛋白分子量：40~70 KD WB用膜类型、孔径：0.45 NC 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒流400 mA 转膜时间：60~90 min PS.其实吧，以我的经验来看，除非目的蛋白特别小，或者特别大，不然转膜时间真的不是那么重要，曾经因为失误，转了15 min 就拆下来了，但从丽春红染色来看，跟平常实验也没有太大的区别。 蛋白来源：内皮细胞总蛋白蛋白名称（可保密）：occludin & AKT 蛋白分子量：65 KD & 56 KD WB用膜类型、孔径：0.45 PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压100 V 转膜时间：60~70 min 设备名字是“ Bio-Rad mini ”。 蛋白来源：乳鼠心肌细胞和成年鼠心肌组织总蛋白和核蛋白蛋白名称（可保密）：保密蛋白分子量：65 KD & 55 KD WB用膜类型、孔径：PVDF（预先用甲醇处理）转膜方式（恒压、恒流）：半干转恒压12 V 转膜时间：30-40 min 设备：“ Bio-Rad mini ” 建议：最开始做过湿转（过夜的那种），太费事费时，效果也不如半干转。 蛋白来源：293T 细胞蛋白名称（可保密）：蛋白分子量：95 KD & 35 KD WB用膜类型、孔径：PVDF 转膜方式（恒压、恒流）：湿转恒压90 V-110 V ，控制电流不要超过300 mA。转膜时间：70 min 蛋白来源：肿瘤手术标本蛋白名称（可保密）：转录因子蛋白分子量：33 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 说明：相同条件曾用于数个30-70 KDa的蛋白，都能成功转上，不过没有试缩短时间效果如何；实验时没为转膜条件苦恼，倒是电泳时胶的浓度及时间根据不同分子量而有区别。 蛋白来源：成纤维细胞 蛋白名称（可保密）：smad3 蛋白分子量：54 KDa WB用膜类型、孔径：PVDF膜 转膜方式（恒压、恒流）：350 mA 恒流 转膜时间：150 min 转膜设备：湿转Bio-Rad 蛋白来源：胰腺癌细胞 蛋白名称（可保密）： 蛋白分子量：16 KDa and 42 KDa

数据分析系统—用户操作手册

数据分析系统 操作手册 目录 一、前言 (2) 1.1、编写目的 (2) 1.2、读者对象 (2) 二、系统综述 (3) 2.1、系统架构 (3) 2.1.1系统浏览器兼容 (3) 三、功能说明 (4) 3.1、登录退出 (4) 3.1.1、登录 (4) 3.1.2、退出 (4) 3.1.3、用户信息 (5) 3.2、仪表盘 (5) 3.2.1、报表选择 (6) 3.2.2、布局方式 (7) 3.2.3、仪表盘管理 (8) 3.2.4、单个报表 (10) 3.3、应用中心 (13) 3.3.1、数据搜索 (13) 3.4、策略配置 (39)

3.4.1、数据采集 (39) 3.4.2、报表 (46) 3.4.3、数据类型 (53) 3.4.4、预设搜索 (58) 3.5、系统管理 (61) 3.5.1、代理注册设置 (61) 3.5.2、用户角色 (62) 3.5.3、系统用户 (65) 四、附件 (67) 一、前言 1.1、编写目的 本文档主要介绍日志分析系统的具体操作方法。通过阅读本文档，用户可以熟练的操作本系统，包括对服务器的监控、系统的设置、各类设备日志源的配置及采集，熟练使用日志查询、日志搜索功能，并掌握告警功能并能通过告警功能对及日志进行定位及分析。 1.2、读者对象 系统管理员：最终用户

项目负责人：即所有负责项目的管理人员 测试人员：测试相关人员 二、系统综述 2.1、系统架构 系统主界面为所有功能点的入口点,通过主菜单可快速定位操作项。系统主要分为四大模块，分别为 1）：仪表盘 2）：应用中心 3）：策略配置 4）：系统管理 2.1.1系统浏览器兼容 支持的浏览器 IE版本IE8至IE11等版本 Chrome 36及以上版本 Google chrome(谷歌 浏览器) Firefox 30及以以上版本 Mozilla Firefox (火 狐浏览器)

Western_blot_试剂配制及操作流程

Western-Blot操作流程 试剂配制 1.RIPA裂解液： 10mM Tris（MW121.14，PH7.5） 1%NP40 0.5%TritonX-100 0.2%脱氧胆酸钠 2 mM EDTA 1 mM PMSF 20%甘油 调pH值至7.5。 混匀后4℃保存，长期保存于-20℃。使用时，加入蛋白酶抑制剂cooktail。 制胶用（1-6）： 1. 1.0mol/L Tris·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。 2. 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 18.671g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。 3.10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。 如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4.10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周） 5．四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4?C保存。 6．30%丙稀酰胺： 4?C保存。 10%下层胶，即分离胶（两块胶，15ml）：胶的浓度根据自己所做蛋白的大小确定依次加入去离子水 5.9ml 30%丙烯酰胺 5ml 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml 10%SDS 150μl 10%AP 150μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。灌胶后加异丙醇（1ml）消泡 5%上层胶（两块胶，6ml）： 依次加入去离子水 4.1ml 30%丙烯酰胺 1ml 1M Tris-HCl（pH6.8） 0.75ml 10%SDS 60μl 10%AP 60μl TEMED 6μl 每加一种成分随即摇匀，为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，根据实验当时的温度适当调整，加入TEMED混匀后应即刻灌胶。 7．5X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 8．10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g

Westernblot基本操作步骤

W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜

Western Blot技术专辑之PAGE胶电泳和转膜 PAGE倒胶的仪器我们在前面WesternBlot仪器之选已经介绍过了，除了顺手的工具能防止漏胶，PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP都别用，小气病发作的后果往往是得不偿失——胶凝不好多半是这里疏忽（或者混合不匀），因为相对配胶的其他组分，AP算最活跃分子——如果还有诸如漏加某组分或者配比错误或者Buffer搞错，那绝对是你自己找骂，不值得同情。水要用去离子的纯水，MilliQ级更好。Cambrex(原来的FMC)有商品化的丙烯酰胺母液，很贵，也很好——配出的胶对200KD以上的蛋白的分辨率高于普通PAGE胶，条带清晰漂亮，可惜一直没有搞清楚配方的奥秘；但是数十倍于丙烯酰胺粉剂的价格令人却步，不过，对接触丙烯酰胺粉尘严重过敏的人可以选择这个。更加豪华的选择是已经凝好的预制胶，各种配方各种比例各种梳孔大小多少任君选择，打开即用，当然更直接方便，更吸引人的是结果漂亮，分辨率高，特别是重复性好，条带真正是"razor sharp"啊！平时都能用这么豪华的东西心情当然超爽啊，实验紧凑又轻松，效率也更高啊！如果实验都能这么“好马配好鞍”，想必更容易出结果，也就更容易拿经费吧！什么时候我们的实验才能实现这种良性循环啊！Invitrogen旗下的Norvex和Cambrex（原来的FMC）PAGEr都是首选预制胶。可是在“社会主义初级阶段”这种奢侈品平时流流口水就算了，偏偏最近Invitrogen公司推出了新的优惠活动，买3盒NuPAGE预制胶就送电泳仪或者电转移，面对这种诱惑，你难道就没有一点非份之想的冲动？ 上样电泳：上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer （别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。 电泳结果检查：如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng 蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot

系统和数据分析

第一课SAS 系统简介 一.SAS 系统 1什么是SAS 系统 SAS 系统是一个模块化的集成软件系统。所谓软件系统就是一组在一起作业的计算机程序。 SAS 系统是一种组合软件系统。基本部分是Base SAS 软件 2 SAS 系统的功能 SAS 系统是大型集成应用软件系统,具有完备的以下四大功能： ●数据访问 ●数据管理 ●数据分析 ●数据显示 它是美国软件研究所（SAS Institute Inc.）经多年的研制于1976年推出。目前已被许多 国家和地区的机构所采用。SAS 系统广泛应用于金融、医疗卫生、生产、运输、通信、政府、科研和教育等领域。它运用统计分析、时间序列分析、运筹决策等科学方法进行质量管理、财务管理、生产优化、风险管理、市场调查和预测等等业务，并可将各种数据以灵活多样的各种报表、图形和三维透视的形式直观地表现出来。在数据处理和统计分析领域，SAS 系统一直被誉为国际上的标准软件系统。 3 SAS 系统的主要模块 SAS 系统包含了众多的不同的模块，可完成不同的任务，主要模块有： ●●●●●●●● ●●●SAS/BASE（基础）——初步的统计分析 SAS/STAT（统计）——广泛的统计分析 SAS/QC（质量控制）——质量管理方面的专门分析计算 SAS/OR（规划）——运筹决策方面的专门分析计算 SAS/ETS（预测）——计量经济的时间序列方面的专门分析计算 SAS/IML（距阵运算）——提供了交互矩阵语言 SAS/GRAPH（图形）——提供了许多产生图形的过程并支持众多的图形设备 SAS/ACCESS（外部数据库接口）——提供了与大多数流行数据库管理系统的方便接口并自身也能进行数据管理 SAS/ASSIST（面向任务的通用菜单驱动界面）——方便用户以菜单方式进行操作SAS/FSP（数据处理交互式菜单系统） SAS/AF（面向对象编程的应用开发工具） 另外SAS系统还将许多常用的统计方法分别集成为两个模块LAB和INSIGHT，供用户

Western Blot 原理和操作方法(详细)资料

Western Blot 原理和操作方法（详细） 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数

最详细的WesternBlot过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解

最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】

Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

western转膜

western blot转移电泳一般操作流程 总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。

电转缓冲液和电转条件的选择 对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表： 槽式转印半干转印 Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米 转移参数 凝胶夹数 2 -

缓冲液要求450ml ≤200 ml 电极距离4cm 按夹层结构厚度确定 转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟 冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管- 凝胶容量 18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米- 13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列 8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个 凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列 8.6 x 6.8 厘米 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。 而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用

western 操作步骤

Western 操作步骤 （三）SDS——PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后放在烤箱里烤干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左右和下部封边） 2、配10%下层胶（10ml两块胶，每块胶5毫升左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶后胶上加一层甲醇（约1ml）液封，液封后胶凝的更快。 3、当甲醇和胶之间有一条折线时，说明胶已凝了。弃甲醇，并用吸水纸将甲醇吸干。 4、等待胶凝期间，准备好蛋白、细胞裂解液、上样缓冲液，上样总体积一般不超过30ul,上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白质变性，上样前在冰上放置3~5分钟。 5、配5%的上层胶（4ml两块胶，每块胶2ml），加入TEMED后立刻摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（从梳子的一头开始插）。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，所以在上层胶凝固的过程中要在两边补胶（不补胶问题也不大）。等待上层胶凝固期间配制1×电泳缓冲液。 6、加入1×电泳缓冲液，两手分别捏住梳子的两竖直向上轻轻拔出。电泳缓冲液一定要加至超过玻璃板的伤员（量要足够多），否则电泳期间会出现电流过低的现象，进而影响电泳的效果。 7、上样（注意：最外的两个泳道易跑歪，尽量不用）Marker 3ul （Marker加在最外边上的加样孔中）样本20~30ul （3）电泳：恒流25mA每块胶，两块胶50mA。电泳至溴酚兰刚跑出来即可终止电泳，进行转膜 （四）转膜 （1）转一张膜需准备四张滤纸和一张硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套（以防手上的蛋白污染膜）。将切好的硝酸纤维素膜和滤纸置于1×转膜缓冲液浸湿。 （2）夹子黑的一面：海绵—2张滤纸—NC膜—胶—两张滤纸—海绵（刘老师的顺序），将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回赶几遍以赶走里面的气泡。在垫子上垫两层滤纸（光滑面临膜），放膜于滤纸上，将玻璃板撬开，随后将浓缩胶轻轻刮去，小心剥下下层胶盖于膜上，用手调整对齐，再放两张滤纸（光滑面临膜）用玻璃棒赶去其中的气泡。最后盖下另一块海绵垫，擀几下就可以合起来了。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，否则会发生短路。如果同时做两块胶，转膜时要记住样本的位置。 （3）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的红面，夹的白面对槽的黑面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用35V过夜（刘老师）。 转膜时点击方向注意是膜正胶负转膜结束前配制封闭液（3%脱脂牛奶）及1×TBST缓冲液。 （五）免疫反应 （1）封闭：将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭30分钟。 （2）一抗 A.从封闭液中取出膜，1×TBST 5min ×4次 B.将膜蛋白面朝上放于槽中，加入抗体，室温下孵育1小时后，4度过夜，次日用1×TBST