16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用

第39卷　第4期

2003年12月

青岛大学医学院学报

ACTA ACADEMIAE MEDICINAE QIN G DAO UNIV ERSITATIS

Vol.39,No.4December 2003

[收稿日期]2002210218;　[修订日期]2003202216[作者简介]毕春霞(19692),女,硕士,主管检验师。

16S rRNA 基因及16S ～23S rRNA 基因区间在临床细菌学检验中的应用

毕春霞1,闫志勇2,王　斌2

(1　青岛市市立医院检验科,山东青岛　266011;　2　青岛大学医学院微生物学教研室)

核糖体16S RNA (16S rRNA )为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的“分子化石”之称。通过对16S rRNA 基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR )扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值。本文就细菌16S

rRNA 基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一

种新方法———16S ～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述。

1　16S r RNA 基因及16S ～23S r RNA 基因区间的基本特征

细菌的核糖体RNA 按沉降系数分3种,分别为5S 、16S 和23S 。其编码基因(rDNA )的链长依次为3300、1540和

120个核苷酸。一般来说,原核生物基因组结构不像真核生

物那样具有高度重复序列,但细菌中的rDNA 在染色体上却以多拷贝形式存在,且微生物中rDNA 的拷贝数与其生长速率相关,现已确知大肠杆菌中rDNA 的拷贝数是7,结核杆菌中为2,枯草杆菌是10,这就使针对细菌rRNA 基因进行的分子生物学检测具有较高的灵敏度。rRNA 操纵子被

转录成前rRNA 时包含以下几个成分(从5′→3′):16S 、区

间、tRNA 、区间、23S 、区间和5S rDN A 序列

[1]

。

1.1　16S rRNA 基因

16S rRNA 基因(rDNA )是细菌染色体上编码rRNA 相

对应的DNA 序列,它集保守性与变异性于一身,是目前应用最广的分子微生物学检测的靶基因。首先编码16S rRNA 的基因与细菌染色体上大多数基因相比有高度的保守性[2]。rRNA 基因比整个基因组进化得要慢,且保守。这表现在其碱基组成、碱基序列、高级结构及功能等不同层次上,例如,尽管在序列上有较多差异,真细菌与古细菌的16S

rRNA 上与核蛋白结合的位点处的二级结构仍很相似,现有

细菌的rDNA 均由其祖先一代一代传下来,虽然在长期的进化过程中有较大变化,但其祖先的某些痕迹仍留在其核酸序列中。这种痕迹为细菌的系统进化研究提供了可能。因此,有人将rRNA 称为细菌的“化石”。这一“化石”的存在,为细菌亲缘关系和系统进化研究提供了方便。其次,16S

rRNA 基因的保守性又是相对的,在保守区之间存在着9个

或10个变异区(V1～V10),不同科、属、种间都有不同程度的差异。因此,将16S rRNA 基因的保守性和特异性结合起来应用,是其在微生物分子诊断中的主要策略。

1.2　16S ～23S rDNA 区间

由于16S rRNA 的进化速度非常慢,即太保守,无法区分某些种系非常接近的菌种及同一菌种的不同菌株。而

16S ～23S rDNA 区间序列的进化速度是16S rDNA 的10

倍[3],再加上16S rDNA 端及23S rDNA 端的高度保守序列,使16S ～23S rDNA 区间成了继16S rDNA 后又一新的方法,它不但可以用于菌种间的鉴别,还可以用来分辨16S rD 2

NA 不能鉴别的非常接近的菌种和种内菌株。2　16S r RNA 基因在临床细菌学检验中的应用

临床病原菌检测常规培养方法一般要求培养8h 以上,后再作生化或免疫学鉴定,所需时间较长,常延误了临床治疗。对生长缓慢的细菌,如结核杆菌,不能培养的病原体,以及已大量用过抗生素的临床标本,这种方法更不实用。用探针杂交或PCR 等方法在体内本应无菌的组织和体液(如血液、脑脊液、膀胱中的尿液等)中检测出16S rRNA 基因,即表明有细菌感染。同时,由于16S rDNA 具有保守区和特异区并存的特点,使其在临床病原菌的检测中具有筛选和鉴别的双重作用。

2.1　16S rRNA 基因的检测方法

2.1.1　U P 2PCR 结合探针杂交　在保守区设计两条通用引

物(U P ),然后在中间的特异区中选择序列设计探针,或选择一条或两条特异性引物作套式或半套式PCR 。先用U P 作PCR 扩增,判断临床标本是否含有病原菌,然后用种或属特异性探针或引物继续检测阳性扩增产物作出最后鉴定。

Greisen 等[4]用通用引物PCR 扩增细菌性脑脊髓膜炎病人

的脑脊液,然后分别用特异探针杂交,准确地检测出脑脊液中的各种常见的病原菌。Radstrom 等[5]用半套式PCR 从脑膜炎病人的脑脊液中最低可检出3×105cfu/L 的脑膜炎球菌。闫志勇等[6]则设计了多重半套式PCR 的方法,能检测出无菌体液标本中病原菌的存在,并进一步做出革兰染色性的鉴定,也具有较高的敏感性和特异性。

2.1.2　U P 2PCR 结合限制性内切酶图谱　在保守区设计两

条通用引物,然后用限制性内切酶酶切扩增产物进行鉴定。

Jiang 等[7]设计了包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓

杆菌、流感嗜血杆菌、结核分支杆菌等十几种临床常见病原菌的通用引物进行PCR 扩增,然后将996bp 的扩增产物用

Hae Ⅲ、Mn Ⅱ、Alu Ⅰ、Dde Ⅰ等不同的限制性内切酶进行酶

切,结果产生了不同的酶切图谱,通过该方法可较好地鉴定临床标本中的细菌感染,其灵敏度达到可检测出10个大肠杆菌或250个金黄色葡萄球菌。

2.1.3　特异性引物直接PCR 扩增　将一对引物中的一条

494青　岛　大　学　医　学　院　学　报39卷

设在变异区,另一条设在保守区,或直接在16S rDNA变异区中设计引物,直接检测某一个种(属)的病原菌,也有很高的特异性,可检测各种特定病原菌。该法已广泛应用于军团菌、幽门螺杆菌的检测。

2.1.4　逆转录PCR(RT2PCR)直接检测　通过RT2PCR直接检测16S rRNA。该方法灵敏度高,并且由于rRNA的存在是细菌具有生命的标志,所以在临床上检测出rRNA,更直接反映了感染的存在。但RNA易降解,需要严格操作,并需逆转录步骤,比检测rDNA步骤繁琐,价格昂贵。

2.2　16S rRNA基因在临床细菌学中的实际应用

2.2.1　临床病原菌的检测　Widjojoatmodjo等[8]根据PCR2单链构像多态性分析(SSCP),用荧光标记的细菌共同引物对178株细菌PCR扩增后进行单链DN A自动化多态性分析。可直接鉴别不同种或属的细菌,避免了扩增后测序以及杂交作进一步鉴定的繁杂。Turenne等[9]则用2组荧光标记的通用引物对血标本中最常见的25种病原菌的标准株进行PCR2SSCP分析,通过荧光毛细管电泳得到这25种细菌种特异性SSCP模式,与常规培养阳性的血标本的PCR2 SSCP结果进行比较,从而能直接从临床标本中将感染的病原菌鉴定到种。

2.2.2　感染性疾病的研究　16S rRNA基因对感染性疾病的研究主要包括对培养阴性的病原菌和培养阳性但常规不能鉴定的病原菌检测两方面。金黄杆菌广泛存在于自然界中,是革兰阳性条件致病菌,由于常规实验室方法很难鉴定,因而常被误诊为棒状杆菌等其他细菌。Saweljew等[10]成功地利用细菌16S rRNA基因高度保守序列引物行PCR,并通过产物序列比较,将1例75岁死于暴发性全身多脏器严重感染的男性病人体内培养出但常规生化等方法不能鉴定的病原菌确定为金黄杆菌。Whipple病是一种以游走性多发性关节炎、腹泻、肠系膜淋巴结病和皮肤色素沉着等为主要临床表现的综合征,由于病理组织银染色找到杆状微生物而认为是一种细菌感染性疾病,但细菌培养却一直阴性。Relman等[11]用3对细菌共同引物进行多重引物PCR,比较3种扩增产物序列,设计出特异引物,同时检测5例Whipple 病病人,并以10例非Whpple病病人作对照,结果证明此菌为放线菌,解开了困扰微生物界的一个持久谜团。

2.2.3　耐药菌株的辅助检测　耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)对β2内酰胺抗生素耐药主要是由于MRSA特有基因mecA编码青霉素结合蛋白的产生而导致耐药,成为医院感染主要病原菌之一。MRSA的检测多用双倍药敏稀释法从表型上进行鉴定,易受温度和药物浓度等因素的影响,结果往往不够准确,而用PCR扩增mecA基因则由于DNA提取不理想,可能造成假阴性。G eha等[12]利用多重引物PCR,即同时用一对mecA基因特异引物及一对细菌共同引物进行PCR扩增,如mecA基因PCR阴性,共同引物PCR 阳性,为真阴性结果;若mecA基因PCR阴性,共同引物PCR也阴性,则可能是DNA提取不成功造成的假阴性,这样就提高了检测的可靠性,并可用于指导临床治疗。2.3　16S rRNA基因在临床病原菌检测中的优势

一般PCR方法通常仅用于特定病原体检测,而在病原菌未明时,需用多种不同引物进行PCR扩增,往往费时费力,而临床上不可能应用PCR逐一探测每种可能的病原菌,使得检测病原菌的PCR技术受到了限制。对细菌核糖体16S rRNA基因进行PCR扩增,可早期判断细菌感染的存在与否,是感染性疾病诊断的又一个突破口。对于高度疑诊但细菌培养阴性的病例,16SrRNA基因高度保守序列PCR,提供了可靠的诊断依据。其特点是:①灵敏度高,且不受抗生素治疗的影响。一般细菌培养所需标本中的细菌量大,但在细菌感染的血液、脑脊液标本中,尤其是新生儿血液中,细菌量一般不超过10×103cfu/L,这是常规细菌培养法很难检测出的。而针对16S rRNA基因进行的各类PCR检测,其灵敏度大多能达到这一浓度。②快速。血培养时间长,尤其是生长缓慢的细菌,用PCR4～6h即可判断血中是否存在细菌。③大大增加了检测细菌的种类,包括要求特殊培养(如厌氧菌、细菌L型等)、甚至根本不能培养的细菌。

3　16S～23S r RNA基因区间在临床细菌学检验中的应用

3.1　方法和应用

在最近研究中,利用16S及23S rRNA的保守序列作引物,分析16S～23S rRNA基因区间序列,已成功地用于菌种之间及同种异株之间的鉴别。采用的方法有:①利用两边的保守序列对区间序列进行扩增,然后根据PCR产物长度及序列的多态性来区分菌属及菌株;②如果PCR产物单一,可以利用RFL P得到不同的酶切片段加以分析或单键构相异构性(SSCP)加以区分。Je nsen等[13]已利用16S～23S区间序列成功地鉴别了300株代表28个种和8个属的细菌,包括李斯特菌属、葡萄球菌属、沙门菌属等。Hookey等[14]等将其用于形态学上极其相似、血清学无法鉴别的军团病杆菌属某些菌种鉴别,并取得满意结果。

3.2　16S～23S rRNA基因区间在病原菌检测中的特点

16S rRNA虽已广泛用于快速准确地鉴别各种菌种,但由于16S rRNA内所含的多态性位点较少,一些菌种可能含有相同或相似的序列,有时往往需测序才能鉴别,限制了其应用。而16S～23S区间序列因两端被高度保守的rRNA 所包围,该序列既保守又相对可变,且片段小,重复性好,被认为是细菌分型探针合成的合适部位。此外,它还有两个特点:①不像在16S rR NA基础上的PCR扩增,属特异性引物扩增的片段一般大于500bp,而区间序列基础上的PCR扩增产物片段较短,所以对模板的扩增相当高效和敏感。②有被临床作为重要菌株鉴定的潜能。Nathalie等[15]利用16S rRNA及l6S～23S rRNA基因区间序列对双歧杆菌分析时发现,16S～23S区间更适合种内菌株间的鉴别。

然而,16S～23S区间的种系鉴别能力也因其高度变异性和高度进化率而受到限制。相反16S r RNA却相当稳定,序列同源性达99.2%。产生这种假阳性的原因极有可能是两株在进化过程中,其区间序列上的位点被多碱基替换,造

4期毕春霞,闫志勇,王　斌116S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用495

成将本该属于同一种的菌错判为无关的两个菌[16]。因此, 16S rRNA和16S～23S rR NA区间是在不同水平上提供细菌种系发育鉴别的两种分子。16S rRNA由于高度保守及变异性较小,适合于属内种间的鉴别,而16S～23S rRNA区间由于具有高度变异及相对保守性,更适合那些16S rRNA无法鉴别的而关系非常密切的某些菌种和种内菌株的鉴别,因此,这两种分子各有所长,后者是前者的很好补充。目前, 16S～23S rDNA区间的长度和序列尚未全部搞清楚,但随着人们对16S～23S rDNA区间的深入研究,定会使其在鉴别细菌种系方面变得更加完美。

4　检测16S r RNA基因存在的问题和对策

正因为16S rRNA基因具有高度保守性的特点,决定了它在实际应用中易存在污染造成假阳性的缺点。环境中的细菌无处不在,所以,当16S rRNA基因PCR运用于临床标本检测时,如何控制细菌污染(包括标本采集及PCR操作过程中各个环节)是亟待解决的关键性问题。反应体系中试剂污染了16S rRNA基因经常发生,特别是Taq DNA聚合酶产于细菌,故经常带有rDN A模板,得出假阳性结果。但要避免这一问题并不困难,Meier等[17]在扩增前加入82甲氧补骨酯素,它不干扰引物的复性和Taq酶的活性,且对热稳定,扩增后在打开EP管前用长波紫外线照射,它激活82甲氧补骨酯素但不损害DNA,活化的补骨酯素形成环丁烷加在被扩增的DNA的嘧啶残基上,从而阻止了Taq酶对扩增子的再次扩增。Radstrom等[5]和G oldenberger等[18]将未加模板DNA的反应混合物在紫外线透射仪下照射,均可以破坏非特异性模板。Carroll等[19]在PCR扩增前将双蒸水、缓冲液、MgCl2和Taq酶混合后,用1.0U的Sau3A1在37℃作用30min,然后95℃灭活,可将Taq酶中污染的DNA去除。此外,只要在各个环节均严格无菌操作,选择恰当的扩增循环次数,DNA提取、扩增和产物分析采取隔离措施,以及尽量使用一次性耗材,每次试验均设立阴性和阳性对照等,就可提高诊断的正确性和可靠性。

鉴于培养法的缺陷,临床上对于一些可疑感染病人,尤其是疑有脑脊液、血液感染,以及其他一些严重感染的病人,临床医生往往来不及等待细菌的培养结果,就盲目根据经验给病人使用大剂量广谱抗生素,这无疑会造成实际未感染者的经济负担,更严重的是很可能导致菌群失调的发生。国内外现在出现很多新的全自动微生物培养、检测仪器,这些仪器尽管都不同程度地缩短了检测时间,但是,目前一般仍需要培养至少48h,且成本也大大提高。而且,细菌作为一种有生命的细胞,繁殖速度虽然远远快于其他生物,但却不可能无限制的缩短,这就决定了以细菌繁殖为基础的培养鉴定法,无论使用何种先进仪器都不可能最终克服其耗时长的缺陷,而分子生物学方法的检测对象是细菌的核酸,正可以克服这一缺点,能快速、准确地检测、鉴定标本中病原菌的感染。我们断言,它将很快替代现在的培养法,成为病原菌检测新的“金标准”。

[关键词]　细菌;rRNA;基因

[中图分类号]　R37 [文献标识码]　A

[文章编号]　167224488(2003)0420493204

[参考文献]

[1]Volker G,Vilma A.New approaches to typing and identification

of bacteria using the16S223S rDNA spacer region[J].Microbiol2 ogy,1996,142(1):3.

[2]Gray MW,David S,Robert J C.On the evolutionary of organisims

and organelles:a global phylogeny based on a highly conserved structural core i n small subunit ribosomal RNA[J].N ucleic Aci ds Res,1984,12(12):5837.

[3]Nathalie LB,Herve P,Irene M,et al.16S rRNA to23S internal

tran scribed spacer sequence analyses reveal inter2and interaspecif2 ic Bidobacterium phylogeny[J].Int J S ys Bacteriol,1996,46

(1):102.

[4]Greisen K,Loeffelholz M,Purohit A,et al.PCR primers and

probe s for the16S rRNA gene of most species of pathogenic bac2 teria,including bacter ia found in cerebrospinal fluid[J].J Cli n Microbiol,1994,32(2):335.

[5]Radstrom P,Backman A,Kragsbjerg,et al.Detection of bacteri2

al DNA in cerebrospinal fluid by assay for simultaneous detection of Neiseria meng initidis,heamophilus influenzae,and streptococ2 ci using a seminested PCR s trategy[J].J Cli n Microbiol,1994, 32(11):2738.

[6]闫志勇,王　斌,苏维奇,等.多重半套式PCR检测脑脊液中细

菌16S rRNA基因[J].中华生物与免疫学杂志,2001,21(4): 316.

[7]Jiang JL,Chreng L P,Shi Y L,et https://www.wendangku.net/doc/146129779.html,e of PCR with universal

pri mers and restriction endonuclease digestions for detection and identification of common bacterial pathogens incerebrospinal fluid [J].J Cli n Microbiol,2000,38(6):2076.

[8]Widjojoatmodjo M,Fluit AC,Verhoef J,et al.Molecular identif

ication of bacteria by fluorescence2based PCR2single2strand confor2 mation p olymorphism analysis of the16S rRNA gene[J].J Cli n Microbiol,1995,33(10):2601.

[9]Turenne CY,Wttwicki E,Hoban DJ,et al.Rapid identification

of bacteria from positive blood cultures by fluorescence2based PCR2single2strand conformation polymorphism analysis of the16S rRNA gene[J].J Cli n Microbio l,2000,38(2):513.

[10]Saweljew P,Kunke J,Feddersen A,et al.Case of fatal systemic

infection with an Aureobacterium sp.:identification of isolate by 16S rRNA gen e analysis[J].J Cli n Microbiol,1996,34(6): 1540.

[11]Relman DA,Schmidt RP,MacDermott RP,et al.Identification

of the uncultued bacillus of Whippleπs disease[J].N Engl J Med,1992,327(2):293.

[12]G eha DJ,Uhl J R,Gustaferro CA,et al.Multiplex PCR for iden2

ti fication of methicillin2resistant staphylococci in the clinical labo2 ratory[J].J Cli n Microbiol,1994,32(7):1768.

(下转第498页)

498青　岛　大　学　医　学　院　学　报39卷

6　PubMed中的循证医学信息查询

MEDL IN E是重要的循证医学数据库,PubMed与MEDL IN E光盘数据库比较,检索循证医学信息更为方便。在基本检索界面中的“Limits”检索页面,文献类型限定中设立了“Clinical Tri al”、“Meta2Analysis”、“Practice Guideline”、“Randomized Controlled Trial”等文献类型限定,均为重要的循证医学信息查询限定。另外,“Clinical Queries”实际上是一个方便的临床循证医学资源检索系统,由加拿大MC Mas2 ter大学临床流行病和生物统计学系Haynes等学者于1994年设计,它根据检索者的检索需要,将检索词进行自动匹配,并通过“Sensitivity”和“Specificity”两个选项来调整查准率和查全率,例如要检索关于Epilepsy治疗的文献,选择“Sensi2 tivity”,系统提供的检索式为:(epilepsy)AND(ran domized controlled trial[PT YP]OR drug therapy[SH]OR therapeutic use[SH:NOEXP]OR random3[WORD])。若选择“speci2 ficitys”,系统提供的检索式为:(epil epsy)AND((double [WORD]AND blind3[WORD])OR placebo[WORD])。

系统综述(Systemic review)是临床实践的重要指导性文献,由已故的临床流行病学家Arc hie Cochrane于1979年提出。其方法是针对某一具体的临床问题,系统全面地收集全世界所有已发表或未发表的相关的临床研究文章,用统一的科学评价标准,筛选出符合标准、质量好的文献,用Meta 分析方法进行分析综合,并加以说明而得出的可靠的结论。其目的是为某一专业或领域提供大量新的知识信息,使读者能在短时间内了解其研究概况和发展方向,获得解决某一临床问题的正确、合理的方法。为方便临床医疗科研人员查询系统综述,PubMed在“Clinical Queries”界面专门设立了系统综述查询功能,如关于“Epilepsy”临床治疗的系统综述文献的检索式为:(EPIL EPSY)AND systematic[sb]。

7　PubMed检索过程中应注意的问题

虽然PubMed提供了界面友好、简单快捷的检索方式,但是,如果不注意检索技巧,往往会使检索得不到如期的效果。因此,在选择检索词时应意以下问题:①若要检索最新文献(PreM EDL IN E或Publisher),应选择自由词检索;对一些还没有准确的主题词表达的最新名词术语,自由词检索可以有较好的检索效果;②若希望提高检索准确率,最好选择主题词检索,用主题词检出文献较少时,若要提高检全率,可以选择自由词检索;③选择自由词时,尽量不要把检索词设定的过长,这样容易漏查或扑空,一旦检索不到文献, PubMed会利用自动转换功能,将词组分成几段,用AND连接再次检索,切开后的检索词可能会不符合要求,所以应该尽量根据自己的需要预先把词分开,当然也不应该把词分得过细,以免增加误检率。④主题词、副主题词的选择要准确,必要时应查询印刷的或者网上的主题词表(MeSH)加以核对。例如,检索“骨髓干细胞移植治疗白血病”,选择“Bone Marrow Cells”或“Bone Marrow Trans plantation”都不合理,而应选择“Hematopoietic Stem Cell Trans plantat ion”。

⑤合理运用逻辑组配以及各种字段的限定,准确理解AND、OR、NO T以及各种限定的含义,例如在“Preview/Index”状态下,检索关于“乳癌遗传学研究”的英文文献,其检索式应该是“English”[Language]AND“breast neoplasms/genetics”[MeSH Terms],在“Limit”状态下的检索式则应该是“breast neoplasms/genetics”Limits:“Eng lish”。

[关键词]　信息存贮与检索;因特网;MEDL IN E; PubMed

[中图分类号]　G252.7 [文献标识码]　C

[文章编号]　167224488(2003)0420496203

(本文编辑　黄建乡)

(上接第495页)

[13]Jensen MA,Wester JA,Straus N.Rapid identification of bacter

ia on the basis of polymerase chain reaction2amplified ribosomal DNA spacer pol ymorphism[J].A ppl Envi ron Microbiol,1993, 59(3):945.

[14]Hooky J V,Birtles RJ,Saunders NA.Intergenic16S rRNA gene

(rD NA)223S rDNA sequence length polymorphism in members of the family Legionellac eae[J].J Cli n Microbiol,1995,33

(10):2377.

[15]Nathalie LB,Herve P,Irene M,et al.16S rRNA to23S internal

tr anscribed spacer sequence analyses reveal inter2and interaspecif2 ic Bidobacteri um phylogeny[J].Int J S ys Bacteriol,1996,46

(1):102.

[16]Roth A,Fischer M,Hamid ME,et al.Differentiation of phy2

loge netically related slowly growing mycobacteria based on16S2 23S rRNA gene intern al transcribed spacer sequences[J].J Cli n Microbiol,1998,36(1):139.

[17]Meier A,Persing DH,Finken M,et al.Elimination of contami2

nat ing DNA within polymerase chain reaction reagent:implica2 tions for a general app roach to detect of uncultured pathogens[J].

J Cli n Microbiol,1993,31(3):646.

[18]G oldenberger D,Altwegg M.Eubacteria PCR:contaiminating

DNA in primer preparation and its elemination by UV light[J].J

Microbiol Method s,1995,21(1):27.

[19]Carroll NM,Adamson P,Okhravi N.Elimination of bacterial

DNA from taq DNA polymerase using restriction endonuclease di2 gestion[J].J Cli n Microbiol,1999,37(12):3402.

(本文编辑　黄建乡)

临床细菌学检验的质量控制流程

临床细菌学检验的质量控制流程 1、质量的概念和质量保证 影响检验结果质量的因素很多,实验过程中,仪器、试剂和操作等均会引起试验结果的误差,衡量检验结果的质量常用准确度和精确度,或特异性和灵敏度。具体采用哪一种指标应根据实验的性质决定,目前临床细菌学检验的工作内容大致有3类,衡量起质量的技术指标不完全相同。 第一类是检出细菌的实验,包括标本直接涂片检查和细菌分离培养。现代的细菌感染,混合菌较常见,一份标本中,会有2种以上细菌存在。无论标本直接涂片还是分离培养,检验结果必须如实反映感染病灶中细菌的真实情况。这类实验的质量,应该用细菌检出率或细菌分离率来衡量。 第二类是鉴定细菌的实验。通过一系列生理生化及形态学、血清学的手段来鉴定病原菌。对分离到的病原菌都做出准确的鉴定,是反映细菌事工作质量的一个重要方面。 第三类是药敏实验。有稀释法和纸片法,前者是半定量的实验,可以用准确度和精密度来衡量,后者以敏感或耐药的形

式报告,属于定性的实验,但实验过程中测量抑菌环是定量的指标。也应以准确度和精确度衡量。 所以实验室人员必须清楚认识到以上这一点,在实验室的设计和管理方面就应该主动设置误差检测系统,实验中一旦出现误差及时发出警报,查明原因及时纠正。 2、室内质量控制 2.1在职人员 2.1.1须受过细菌学检验的专门基础教育以及相关的生物交全防护知识,并以细菌检验为专业,及时终结并积累工作经验。 2.1.2作人员必须具有严谨的工作态度,技术操作须完全遵守操作规程,并直接参与质量控制工作。 2.1.3工作人员应不断加强自身的业务学习,及时了解本领域的新进展,将所掌握的新知识应用到实际工作中。 2.1.4实验室管理人员应注意利用一切机会培养技术人员,积极参加国际、国内学术会议、专业培训班,获取新信息。因为细菌学检验,投资人员培训远比投资与仪器设备更重要。 2.2操作手册及参考书

临床基因扩增检验实验室基本设置标准

临床基因扩增检验实验室基本设置标准 根据《临床检验扩增检验实验室管理暂行办法》，制定本标准 一、临床基因扩增检验实验室区域设置原则 （一）临床基因扩增检验实验室区域设置原则 1、试剂储存和准备区 2、标本制备区 3、扩增反应混合物配制和扩增区 4、扩增产物分析区 如使用全自动分析仪，区域可适当合并。 （二）各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。 （三）进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区—>标本制备区—>扩增反应混合物配制和扩增区—>扩增产物分析区。 （四）不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。 二、工作区域仪器设备配置标准 （一）试剂储存和准备区 1、2-8C和-15C冰箱 2、混匀器 3、微量加样器（覆盖1-1000ul） 4、移动紫外灯（近工作台面）

5、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 6、专用工作服和工作鞋 7、专用办公用品 （二）标本制备区 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱 2、高速台式冷冻离心机 3、混允器 4、水浴箱或加热模块 5、微量加样器（覆盖1-1000ul） 6、可移动紫外灯（近工作台面） 7、超净工作台 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） 9、专用工作服和工作鞋 10、专用办公用品 如需处理大分子DNA，应具有超声波水浴仪。 （三）扩增反应混合物配制和扩增区 1、核酸扩增仪 2、微量加样器（覆盖1-1000ul） 3、可移动紫外灯（近工作台面） 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管

医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则

附件 医疗机构临床基因扩增检验 实验室工作导则 一、临床基因扩增检验实验室的设计 (一)临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验 室应当设臵以下区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的,各区域无论是在空间上还是在使用中,应当始终处于完全的分隔状态,不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能,区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪,扩增区、扩增产物分析区可合并;采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪,则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。各区的功能是: 1.试剂储存和准备区:贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备,以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。 2.标本制备区:核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作,应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。 3.扩增区:cDNA合成、DNA扩增及检测。 4.扩增产物分析区:扩增片段的进一步分析测定,如杂交、酶切电泳、变性高 效液相分析、测序等。 (二)临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气 流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行,防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区

→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装臵或其他可行的方式实现。 (三)工作区域仪器设备配置标准。 1.试剂储存和准备区。 (1)2~8℃和-20℃以下冰箱。 (2)混匀器。 (3)微量加样器(覆盖0.2-1000μl)。 (4)可移动紫外灯(近工作台面)。 (5)消耗品:一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。 (6)专用工作服和工作鞋(套)。 (7)专用办公用品。 2.标本制备区。 (1)2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。 (2)高速离心机。 (3)混匀器。 (4)水浴箱或加热模块。 (5)微量加样器(覆盖0.2-1000μl)。

临床基因扩增检验实验室工作规范

为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保证检验质量,特制 定本规范。 一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理 临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002】10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染,必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。 临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 (一)试剂贮存和准备区 下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂

原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增 的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。 主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术(在第一个高温变性步骤后加入酶),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。 在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸 如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm 波长),在工作完成后调至实验台上60~90em 内照射。由于扩增产物仅几 百bp,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好 是照射过夜。实验室及其设备的使用必须有日常记录。 (二)标本制备区 下述操作在该区进行:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入 至扩增反应管和测定RNA时eDNA的合成。

微生物学检验题库及答案

微生物学检验题库及答案

《微生物学与检验》题库及答案 一.名词解释 1.医院感染 2.肥达反应 3.内基小体 4. 噬菌体： 5.血浆凝固酶 6.败血症 7.灭菌 8.药物敏感试验 9.外 - 斐氏试验 10.L 型细菌 11.菌群失调： 12.微生物 13.细菌 14.最小抑菌浓度 15.菌落 16.汹涌发酵 17.无菌操作 18.流感杆菌“卫星现象” 19.培养基 20.包涵体 21.正常菌群 22. 内毒素 23. 干扰现象： 24.菌血症 25菌丝： 二.填空题 1 L 型细菌是指（）。 2 杀灭物体上所有微生物的方法称为（）。 3 细菌 H-O 变异是指（）。 4 药敏试验所用标准培养基是，所用菌液相当于（）个细菌／ ml ，细菌接种采用（）划线接种法。 5 细菌致病因素包括（）、（）和（）。 6 细菌引起的全身感染包括（）、（）、（）和（）四种类型。 7 不染色标本检查主要用于观察细菌的（）。 8 影响革兰染色结果的关键步骤是（）。 9 有动力细菌在半固体培养基中的生长现象是穿刺接种线（），无动力细菌穿刺接种线（）。 10 糖发酵试验用于观察细菌分解糖是否产（）和（）。 11 靛基质试验的原理为，细菌产生的色氨酸酶分解蛋白胨中的色氨酸而生成（），此代谢产物与加入的试剂反应，生成（）。 12 链球菌根据溶血现象分为（）、（）和（）三种类型。 13 葡萄球菌触酶试验结果为（）性，链球菌触酶试验结果为（）性。 14 呈现脐窝状菌落的球菌是（）。 15 抗 O 试验是测定病人血清中（）抗体效价的试验，用于风湿热等疾病的辅助诊断。 16 血平板上呈现草绿色溶血环的病原性球菌是（）和（）。 17 IMViC 试验包括（）、（）、（）和（）四项试验。 18 分解乳糖的细菌在肠道选择平板上呈现（）菌落，不分解乳糖则为（）菌落。 19 KIA 斜面红色表明，底层黄色、有气泡表明（）、（），有黑色沉淀表明（）试验阳性 20 霍乱弧菌生物型包括（）和（）。 21 AIDS 的传染源是（）和（），传播途径主要有（），（）和（）。 22 真菌菌落有（）、（）和（）三种。 23 病毒培养方法有（）、（）和（）。 24 病毒的基本结构由（）和（）组成，有些病毒还具有（）。 25 流感病毒根据抗原结构不同分（）、（）、（）三型，其中容易引起流感大流行的是其中的（）型。

12.《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》

《医疗机构临床基因扩增管理办法》 （卫办医政发〔2010〕194号） 第一章总则 第一条为规范医疗机构临床基因扩增检验实验室管理，保障临床基因扩增检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性，根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》，制定本办法。 第二条临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的DNA或RNA，进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室，医疗机构应当集中设置，统一管理。 第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。 第四条卫生部负责全国医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。各省级卫生行政部门负责所辖行政区域内医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。 第五条以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告，不得向患者收取任何费用。 第二章实验室审核和设置 第六条医疗机构向省级卫生行政部门提出临床基因扩增检验实验室设置申请，并提交以下材料： （一）《医疗机构执业许可证》复印件； （二）医疗机构基本情况，拟设置的临床基因扩增检验实验室平面图以及拟开展的检验项目、实验设备、设施条件和有关技术人员资料； （三）对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析。 第七条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定的其他机构（以下简称省级卫生行政部门指定机构）负责组织医疗机构临床基因扩增检验实验室的技术审核工作。 第八条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核办法，组建各相关专业专家库，按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》对医疗机构进行技术审核。技术审核办法报请省级卫生行政部门同意后实施。

CNAS-GL42 2016《基因扩增领域检测实验室认可指南》

CNAS-GL42 基因扩增领域检测实验室认可指南Guidance on the Accreditation in gene amplification Testing Laboratory 中国合格评定国家认可委员会

前言 本文件是对CNAS-CL62:2016《实验室认可准则在基因扩增领域检测实验室的应用说明》的解释和说明，并不增加其他的要求。 本文件为首次发布。

基因扩增领域检测实验室认可指南 1 适用范围 本指南旨在促进基因扩增领域检测实验室对认可技术的理解与执行。适用于申请认可的基因扩增检测实验室建立质量管理体系，已经认可的基因扩增检测实验室规范其质量和技术活动，也可供CNAS评审员在基因扩增检测实验室认可评审过程中参考使用。 2 引用文件 GB/T 6682 《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T 20001.4 《标准编写规则第4部分：试验方法标准》 4 管理要求 4.1 组织 4.1.2实验室有责任和义务保护本国的物种信息资源和基因资源，包括动物、植物和微生物等物种资源。 4.1.5 c）适用时，实验室应在保护客户的机密信息和所有权的政策和程序中体现医学伦理，在采集、接受样本及结果报告期间均应充分保护客户隐私。 4.4要求、标书和合同的评审 4.4.3 评审的内容应包括被实验室分包出去的任何工作，如基因测序工作等。4.4.5当核酸提取或基因扩增无法完时，应向客户做出说明。 注：测试样品过度加工、测试核酸样品含量不足或降解等原因，可能导致基因扩增无法进行。 4.6 服务和供应品的采购 4.6.2 分析过程所有实验仅用不含DNA酶和RNA酶的分析纯或生化试剂，所用的水应符合GB 6682一级水的要求。适用时，自制试剂使用前应高压灭菌，不宜高压灭菌的试剂应使用超滤设备（孔径0.22μm）除菌。 4.13 记录的控制 4.13.2 适用时，基因扩增检测中应包括以下技术记录信息：

临床基因扩增检验实验室工作规范

临床基因扩增检验实验室工作规范 为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。 一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理 临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。 临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。 清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。(一)试剂贮存和准备区 下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。 主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。 在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。

医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则

医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 一，临床基因扩增检验实验室的设计 （一）临床基因扩增检验实验室区域设计规划。原则上临床基因扩增实验室应当设置以下区域：试剂储存和准备区，标本制备区，扩增区，扩增产物分析区。这四个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分割状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区，扩增产物分析区可合并；采用标本处理，核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区，扩增区，扩增产物分析区可合并。各区的功能是：1，试剂储存和准备区：贮存试剂的制备，试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管，吸头等消耗品的贮存和准备。 2，标本制备区：核酸（RNA ,DNA）提取，贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床标本操作，应符合生物安全二级实验室防护设备，个人防护和操作规范的要求。 3，扩增区：cDNA合成，DNA扩增及检测。 4，扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交，酶切电泳，变性高效液相分析，测序等。 （二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存的准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇，负压排风扇装置和其他可行的方式实现。（三）工作区域仪器设备配置标准。 1，试剂存储和准备区。 （1）2~8℃和-20℃以下的冰箱。 （2）混匀器。 （3）微量加样器（覆盖0.2~1000ul）。 （4）可移动紫外灯（近工作台面）。 （5）消耗品：一次性手套，耐高温处理的离心管和加样器吸头。 （6）专用工作服和工作鞋（套）。

临床基因扩增实验室建设方案

临床基因扩增实验室建设方案 1、概述 临床基因扩增实验又称PCR实验,是专门用来检验新型冠状病毒、艾滋病、乙型肝炎、人乳头状瘤病毒等病毒感染性疾病的一种检测手段。它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法,测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。由于该检测方法可以测出普通检验难以检测岀的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点,因此被临床医生广为认可,已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的疾病诊断。 新型冠状病毒（2019-nCoV）是人类分离的第七类冠状病毒。该病毒属于β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径 60-140nm。其基因特征与SARS-CoV 和MERS-CoV 有明显区别。目前研究显示与蝙蝠SARS 样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。病毒对紫外线和热敏感，56 度30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。基于目前的流行病学调查和研究结果，新型冠状病毒潜伏期为1-14 天，多为3-7 天；传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源；主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在经气溶胶传播的可能，其他传播途径待明确；人群普遍易感。 2020 年01 月20 日国家卫健委公告：将新型冠状病毒感染的肺炎纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取

甲类传染病的预防、控制措施。并纳入《中华人民共和国国境卫生检疫法》规定的检疫传染病管理。实验活动暂按第二类病原微生物进行管理。因此，开展新冠病毒核酸检测需要在法律条规、人员环境、生物安全与防护以及质量控制等方面满足并符合国家相关技术规范要求。

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法.doc

如对你有帮助，请购买下载打赏，谢谢！ 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 第一章总则 第二章实验室设置和验收 第三章实验室监督管理 第四章附则 第一章总则 第一条 为规范临床基因扩增检验实验室管理，保证临床基因扩增检验质量，使临床诊断和治疗更为科学、合理，特制定本办法。 第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术，如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的放大系统(TAS)自主序列复制系统(3SR)和链替代扩增(SDA)等。 第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。 第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。 第五条 卫生部临床检验中心(以下简称卫生部临检中心)和省、自治区、直辖市临床检验中心(以下简称省临检中心)负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。 第二章实验室设置和验收 第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》(见附件)筹建实验室；筹建完成后，由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料： (一)《医疗机构执业许可证》复印件； (二)可行性研究报告； 1、拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析； 2、拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图； 3、拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料 第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组(以下简称专家组)，按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后，在20日内将验收报告寄送至申请机构。 第八条 经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见，方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。 第九条 未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案的医疗机构不得擅自开展临床基因扩增检验项目。 第三章实验室监督管理

《医疗机构临床基因扩增管理办法》

《医疗机构临床基因扩增管理办法》 (卫办医政发〔201０〕194号） (2010年1２月13日发布施行) 第一章总则 第一条为规范医疗机构临床基因扩增检验实验室管理,保障临床基因扩增检验质量和实验室生物安全,保证临床诊断和治疗科学性、合理性,根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》,制定本办法。 第二条临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的DNA或RNA,进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室，医疗机构应当集中设置，统一管理。 第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。 第四条卫生部负责全国医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。各省级卫生行政部门负责所辖行政区域内医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。 第五条以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告，不得向患者收取任何费用。 第二章实验室审核和设置 第六条医疗机构向省级卫生行政部门提出临床基因扩增检验实验室设置申请，并提交以下材料： (一）《医疗机构执业许可证》复印件; （二)医疗机构基本情况,拟设置的临床基因扩增检验实验室平面图以及拟开展的检验项目、实验设备、设施条件和有关技术人员资料; (三)对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析。 第七条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定的其他机构(以下简称省级卫生行政部门指定机构）负责组织医疗机构临床基因扩增检验实验室的技术审核工作。 第八条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核办法,组建各相关专业专家库，按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》对医疗机构进行技术审核。技术审核办法报请省级卫生行政部门同意后实施。 第九条医疗机构通过省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构组织的技术审核的，凭技术审核报告至省级卫生行政部门进行相应诊疗科目项下的检验项目登记备案。 第十条省级卫生行政部门应当按照《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗机构临床检验项目目录》开展医疗机构临床基因扩增检验项目登记工作。

临床基因扩增检验实验室工作规范

临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床，更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务，保证检验质量，特制定本规范。一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10号文)附件《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》。为避免污染，必须严格遵循《临床基因扩增检验实验室设置标准》设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记，以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。此外，当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因，因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进

行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。 (一)试剂贮存和准备区下述操作在该区进行：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用，避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂，应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于"热启动"技术(在第一个高温变性步骤后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经

天津市临床基因扩增检验实验室验收规程

附件１ 天津市临床基因扩增检验实验室验收规程 一、目的 加强全市临床基因扩增检验实验室的管理，确保检验工作质量和医疗安全。 二、适用范围 全市拟开展临床基因扩增检验项目的实验室。 三、准备工作 （一）人员要求 1.具有检验或检验相关专业资质的本单位在职人员及多点执业人员，其中，本单位在职人员不得少于该实验室工作人员总数的一半。 2.具有一定的分子生物学知识及实验操作经历，了解防污染和生物安全要点并熟练掌握相关仪器设备的使用操作。 3.必须经天津市临床检验中心或其它具有培训资质的机构培训并考核合格，获得《临床基因扩增检验实验室技术人员上岗证》。 4.实验室人员配备应能满足日常工作需要，至少配备有2名以上的实验技术人员。 1

5.实验室专业主管应为本科以上学历、中级以上职称，具有检验或检验相关专业资质的，并从事本专业工作2年以上者。 （二）环境要求 1.按照临床基因扩增检验实验室区域设计原则筹建实验室。设置基本原则为有4个独立且完全隔离的工作区域，包括试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区以及产物分析区，如使用全自动分析仪，后二个区域可适当合并；各区有明确标识及专有仪器设备和清洁用具等，人流和物流单向流动。 2.所需的电源、水源和温湿度符合实验工作要求。 3.不得与其他实验室混用，无尘、无磁场干扰及无同位素污染。 4.必须有明示生物危害的标志及禁止无关人员入内的标志。 5.有独立的通风设施、生物安全措施，保障实验人员身体健康。 （三）医疗机构要求 1.申请临床基因扩增检验实验室的医疗机构应当具备相应功能和临床需求。 2.经行政审批部门核准登记医学检验诊疗科目的二级以上医疗机构或能够出具临床检验报告的医学检验所（独立实验室），有涉及生物安全的样本采集和处理的相应安全等级的实验室。 2

临床基因扩增检验技术教学的点滴体会

临床基因扩增检验技术教学的点滴体会 临床基因扩增检验技术即我们常说的PCR技术，是分子生物学教学中的一项重要内容，也是临床应用非常广泛的一项技术。这项课程的学习和学生在临床的实习往往是分开进行的。学生在校学习的主要是临床基因扩增检验技术的核酸基本生物化学知识，PCR反应的基本原理、质量控制，临床应用等。当学生进入临床基因扩增实验室实习工作后，他们会感觉到在学校学过的和实际看到的有很大区别，这是由于教学的侧重点不同造成学生对临床基因扩增检验技术的认识不足，操作不够严谨、规范。作为一名在临床PCR实验室工作的技术人员，我们的体会是临床基因扩增检验技术的教学要紧密结合临床，通过对临床基因扩增实验室各个环节地介绍实现对基本理论知识地讲解，这样更有利于学生融会贯通。 1、临床基因扩增实验室开展PCR技术必须具备的基本条件 教育学生对临床基因扩增实验室有一个总体的认识，对学生实行规范、严格的入室教育,是顺利完成教学实习任务的前提和保证[1]。使他们明确临床基因扩增实验室开展PCR技术必须具备的基本条件，即规范的PCR实验室（经卫生部临检中心验收合

格）；编写适合本实验室的质量手册；具备经PCR专业知识培训的技术人员；使用有生产批文的PCR试剂。通过对规范的PCR实验室的介绍，使学生了解PCR实验室是要经过国家验收的，实验室的设计、安排都是有严格要求的。 2、通过讲解PCR实验室的操作流程，加深他们对实验室的认识。 PCR实验室有严格的操作流程，进入各工作区域必须严格按照单一流向进行，即准备区→标本制备区→产物分析区，我们在教学过程中一定要重点强调这一流程，在学生头脑中强化这一概念。 3、通过讲解PCR实验室的操作规程，提高学生的生物安全意识。 PCR实验室有严格的操作规程，我们某些实验室人员由于怕麻烦，自己本身就不严格按照PCR实验室的操作规程去做，比如进入实验室不换大衣，不换拖鞋，不带口罩、帽子，随意乱扔污染性废物等。在教学过程中，应对看似小的细节进行强调，加强学生的认识。作为带教老师，我们一定要严格要求自己，给学生作出榜样，同时要严格要求学生做到，使他们有一个严谨的工作

临床医学检验技术(中级)-微生物和微生物学检验(B1型题)_0

临床医学检验技术（中级)-微生物和微生物学检验 (B1型题) 1、不会通过母婴途径传播的RNA病毒是 A.HAV B.HSV C.HCMV D.HIV E.HPV 2、通过性接触传播的RNA病毒是 A.HAV B.HSV C.HCMV D.HIV E.HPV 3、接种左旋多巴-枸橼酸铁和咖啡酸培养基，新型隐球菌呈棕黑色菌落的是 A.芽管形成试验 B.厚壁孢子形成试验 C.酚氧化酶试验

D.尿素酶试验 E.毛发穿孔试验 4、假丝酵母菌属中仅白假丝酵母菌阳性的试验是 A.芽管形成试验 B.厚壁孢子形成试验 C.酚氧化酶试验 D.尿素酶试验 E.毛发穿孔试验 5、医院感染最重要的感染源为 A.患者 B.医院工作人员 C.探视者 D.陪同人员 E.未彻底消毒灭菌的血液制品 6、可作为共同传播媒介物引起医院感染的为 A.患者 B.医院工作人员 C.探视者 D.陪同人员

E.未彻底消毒灭菌的血液制品 7、不属于钝化酶的是 A.乙酰转移酶 B.核苷转移酶 C.磷酸转移酶 D.红霉素酶 E.CTX-M型酶 8、细菌对氯霉素的耐药机制为 A.乙酰转移酶 B.核苷转移酶 C.磷酸转移酶 D.红霉素酶 E.CTX-M型酶 9、具有高度变异性的肝炎病毒是 A.HAV B.HBV C.HCV D.HDV E.HEV

10、可形成包涵体的肝炎病毒是 A.HAV B.HBV C.HCV D.HDV E.HEV 11、耐碱不耐酸的细菌是 A.结核分枝杆菌 B.痢疾志贺菌 C.伤寒沙门菌 D.霍乱弧菌 E.脑膜炎奈瑟菌 12、细胞壁含脂类最高的细菌是 A.结核分枝杆菌 B.痢疾志贺菌 C.伤寒沙门菌 D.霍乱弧菌 E.脑膜炎奈瑟菌

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法

临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 第一章总则 第一条为规范临床基因扩增检验实验室管理，保证临床基因扩增检验质量，使临床诊断和治疗更为科学、合理，特制定本办法。 第二条临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的，以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的放大系统（TAS）自主序列复制系统（3SR）和链替代扩增（SDA）等。 第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。 第四条临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检验项目。 第五条卫生部临床检验中心（以下简称卫生部临检中心）和省、自治区、直辖市临床检验中心（以下简称省临检中心）负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。 第二章实验室设置和验收 第六条拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》（见附件）筹建实验室；筹建完成后，由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料： （一）《医疗机构执业许可证》复印件； （二）可行性研究报告； 1、拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析；

2、拟设临床基因扩增检验实验室的设置平面图； 3、拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料 第七条卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组（以下简称专家组），按照《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后，在20日内将验收报告寄送至申请机构。 第八条经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见，方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。 第九条未经专家组验收合格并报省级卫生行政部门备案的医疗机构不得擅自开展临床基因扩增检验项目。 第三章实验室监督管理 第十条临床基因检验实验室必须按照《临床基因扩增检验实验室工作规范》（另发）开展临床基因扩增检验工作。 第十一条临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合格者，由培训单位发给合格证书，并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。 培训单位为卫生部临检中心，或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。 第十二条以科研为目的的基因扩增检验项目。不得向临床出具检验报告，不得向病人收取任何费用。 第十三条临床基因扩增检验实验室必须按照《临床基因扩增实验室工作规范》开展室内质量控制，并参加卫生部临检中心组织的室内质量评价。

临床细菌学检验的质量控制

临床细菌学检验的质量控制 目的研究临床细菌学检验质量控制措施。方法本组抽取我院于2012年8月～2013年8月从各科室采集的4500例细菌标本进行临床实验。分析检验结果的准确性。结果经临床病理证实，临床细菌学检验质量优良为2412例，合格为1778例，不合格为310例，合格率为93.11%。结论规范管理程序，保证标本质量采集的质量，对提高临床细菌学检验的质量具有重要意义。 标签：样本采集；检验质量；细菌学 随着医疗技术的快速发展，细菌学检验逐渐成为临床医学中重要的组成部分。通过对入院患者进行标本采集、研究等，可为临床治疗提供依据。由于临床细菌学检验内容非常复杂，包括标本采集、运送、保存、药物过敏检验等多方面的内容，任一环节出错，都会对检查质量造成影响，因此我们必须格外注意各环节的操作标准。现对我院采集的4500例细菌标本的检验过程进行综合分析，得出如下结论。 1资料与方法 1.1一般资料本组抽取我院于2012年8月～2013年8月从各科室采集的细菌标本4500例，其中559例血液标本，678例粪便标本，894例尿液标本，686例脓液标本，759例生殖道分泌物，924例痰液标本。 1.2方法将采集的标本进行分类处理，对不同的标本进行临床细菌学检验，记录检验结果。 1.3临床评价标准参照医学微生物检验规范对本组实验进行综合评价。根据检验结果的准确性进行综合评价，以优良、合格、不合格作为评价等级。对不合格标本进行研究，分析其影响因素。 2结果 本组4500例标本，其中优良为2412例，合格为1778例，不合格为310例，合格率为93.11%。其中，以粪便标本和血液标本的检查合格率最高，见表1。本组310例不合格，不合格率为6.89%，其具体影响因素见表2。 3结论 随着医疗技术的进步，细菌学开始广泛的应用于临床诊断中，为临床治疗提供准确的依据。临床细菌学检验的过程主要包括细菌采集、运送、管理、检验等，在这一系列的过程中，往往会受到其他因素的干扰，影响检验质量。 3.1影响临床细菌学检验质量的因素

临床基因扩增(PCR)诊断实验室工作规范(试行)

附件2 临床基因扩增（PCR）诊断实验室工作规范（试行） 为使基因扩增诊断技术规范有效的用于临床，保证检测质量，更好地为临床疾病的诊疗服务，特制定本规范。 1．临床基因扩增实验室的设置：和仪器设备 临床PCR实验室应分为四个隔开的工作区域，每一区域都应有专用的仪器设备。即1）试剂贮存和准备区；2）标本制备区；3）扩增反应混合物配制和扩增区和的扩增产物分析区。如使用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR方法或全自动分析仪如Cobas－T （Anplicor）等，则3）和4）两个区可合并。 与上述特定实验区有关的各个房间必须有明确的标记，以避免不同工作区内的设备物品如加样器、试剂等的移出或不同的工作区间发生混淆。进入各个工作区必须遵循一严格的）顺序，只能按单一方向进行，即从试剂贮存和准备区～标本制备区～扩增反应混合物配制和扩增区～扩增产物分析区。不同的工作区必须使用不同的工作服，可以不同的颜色来区别。此外，当工作人员离开各工作区时，不得将各区特定的工作服带出。 1．l．试剂贮存和准备区 本区用于贮存溶液的制条、溶液的分装和主反应混合液的制各。本区仪器设备配置：（l）4 冰箱和一20 冰柜；（2）混匀器；（3）微量加样器若干支（覆盖1～1000pl）；（5）专用工作服和工作鞋；（6）专用办公用品；（7）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离。心管和加样器吸头（带滤心）；（8）可移动紫外灯（近工作台面）。 1．2．标本制备区 标本贮存、核酸提取及贮存均在本区内进行。RNA测定时的单键。cDNA合成也在本区进行。本区仪器设备自己置：（l）4冰箱、－20 或-70 冰柜三（2）高达台式冷冻离心机；（3）混匀器；（4）水浴箱或加热模块；（5）微量如排器若干支（覆盖l～1000μl）；（6）专用工作服和工作鞋；（7）专用办公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（9）可移动紫外灯（近工作台面）；（10）超净工作台；（11）超声波水浴（处理大分子DNA适用）。 1．3．扩增反应混合物配制和扩增区 模板材料（来自标本制备区）和主反应混合液（来自试剂贮存和准备区）的加入以及扩增反应等专门在本二．作区内近行。本区仪器设备自己置：（l）核酸扩增仅三（2）微量加样器（覆盖1～1000 μl）；（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水纸、高压处理的部心管和加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。 1．4. 扩增产物分析区 本区面积应为6～8m 。扩增严物的分析在本区进行。本区仪器设备配置：视检测方法不同而定，如为PCR�ELISA，则需（l）微量加样器若干支（覆盖l～2s（2）酶标权、洗报机和恒温箱;（3）专用工作服和工作鞋；（4）专用办么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水纸、加样器吸头（带滤心）；（6）可移动紫外灯（近工作台面）。

医疗机构临床基因扩增管理办法

卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增管理办法》的通知 卫办医政发〔2010〕194号 各省、自治区、直辖市卫生厅局，新疆生产建设兵团卫生局： 为进一步规范临床基因扩增检验实验室管理，保证临床诊断科学、合理，保障患者合法权益，根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》，我部对《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发〔2002〕10号）进行了修订，制定了《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》。现印发给你们，请遵照执行。 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法 第一章总则 第一条为规范医疗机构临床基因扩增检验实验室管理，保障临床基因扩增检验质量和实验室生物安全，保证临床诊断和治疗科学性、合理性，根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗技术临床应用管理办法》，制定本办法。 第二条临床基因扩增检验实验室是指通过扩增检测特定的DNA或RNA，进行疾病诊断、治疗监测和预后判定等的实验室，医疗机构应当集中设置，统一管理。 第三条本办法适用于开展临床基因扩增检验技术的医疗机构。 第四条卫生部负责全国医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。各省级卫生行政部门负责所辖行政区域内医疗机构临床基因扩增检验实验室的监督管理工作。 第五条以科研为目的的基因扩增检验项目不得向临床出具检验报告，不得向患者收取任何费用。 第二章实验室审核和设置 第六条医疗机构向省级卫生行政部门提出临床基因扩增检验实验室设置申请，并提交以下材料： （一）《医疗机构执业许可证》复印件； （二）医疗机构基本情况，拟设置的临床基因扩增检验实验室平面图以及拟开展的检验项目、实验设备、设施条件和有关技术人员资料； （三）对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增检验实验室运行的预测分析。 第七条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定的其他机构（以下简称省级卫生行政部门指定机构）负责组织医疗机构临床基因扩增检验实验室的技术审核工作。 第八条省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核办法，组建各相关专业专家库，按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》对医疗机构进行技术审核。技术审核办法报请省级卫生行政部门同意后实施。 第九条医疗机构通过省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定机构组织的技术审核的，凭技术审核报告至省级卫生行政部门进行相应诊疗科目项下的检验项目登记备案。 第十条省级卫生行政部门应当按照《医疗机构临床实验室管理办法》和《医疗机构临床检验项目目录》开展医疗机构临床基因扩增检验项目登记工作。 第十一条基因扩增检验实验室设置应符合国家实验室生物安全有关规定。 第三章实验室质量管理 第十二条医疗机构经省级卫生行政部门临床基因扩增检验项目登记后，方可开展临床基因扩增检验工作。 第十三条医疗机构临床基因扩增检验实验室应当按照《医疗机构临床基因扩增检验工作导则》，开展临床基因扩增检验工作。 第十四条医疗机构临床基因扩增检验实验室人员应当经省级以上卫生行政部门指定机构技术培训合格后，方可从事临床基因扩增检验工作。