石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)
4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g
枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)
5. PBS浸洗2次各5min
6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次
8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）
9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要）
9.滴加一抗4℃过夜
10.PBS浸洗3次各5min
11.滴加二抗室温或37℃孵育30min
12.PBS洗3次各5min
15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗
16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗
17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；
18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)
19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干
二、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：
二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）
2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。
5、PBS冲洗5min×3次。
6、5%BSA封闭液20min，甩去。
7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。
8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。
9、自来水冲洗，封片，观察。
注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可
. 评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。
1.1、方法操纵不难，最大的易处是出现非常后果时怎样处理?这就
需要把握免疫组化实行道理，每步晓得为何这样做，这样你才敢斗胆地变革先前的不合错误的方法步骤。如抗体孵育条件次要是抗体浓度、温度、时间，这三者通常为互相成反比的(相对)，此中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速率、时间决定反应的量。就拿温度来讲，可以有4度、室温、37度，我保举4度最好，反应最暖和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；
室温我不太倡导，除非你每次都把情况温度掌握在必然的范畴，不然，尽可能选择前两者。
2、免疫组化最大的上风是定位和定性。比拟于其他蛋白检测方法，
免疫组化具有定性灵活度高、定位较直接正确，是定位检测分析尾选方法。特别对于有些因子的转位研究十分有效。
3、免疫组化结果定量分析的条件是高质量的染色切片。免疫组化
结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们平常审稿时鉴定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对比通常
为用必定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替换一抗来进行反应，其他步骤均一致。前者是解除方法和实验体系有无问题；后者是扫除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用普遍，是当前实验研究的最重要方法之一。现
在发SCI论文时，显着觉得仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分接待，多是怕你学术造假吧。固然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的审定尺度是同统统片或不同切片中不
同抗原均从摸索浓度或条件而做出良好的染色切片。我在日常平凡带教中就发现很多研究生把我已经摸索很成生的反应条件、浓度、方法步骤，反复使用于同一性子的切片和同一种抗体，做出来后就感觉本人已经把握了免疫组化方法，调换一种抗体后，竟然连二抗的种属来源都拿错了。失利常常促进你去思测验验原理
和过程，乐成有时也加速你自负。
1、观点战经常使用办法先容
1、界说
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的漫衍和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学(immunohistochemistry)技术或免疫细胞化学(immunocytochemistry)技术。
2、原理
按照抗原抗体反应和化学显色道理，组织切片或细胞标本中的抗本来和一抗结合，再操纵一抗与标识表记标帜生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用符号辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AKP)等的抗生物素(如链霉亲和素等)结合，最后通过呈色反应或荧光来显现细胞或组织中化学身分，在光学显微镜或荧鲜明微镜下可清楚瞥见细胞内产生的抗原抗体反应产品，从而可以在细胞爬片或组织切片上原位肯定某些化学成分的散布和含量。
3、分类
1)按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2)按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3)按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法；亲和毗连，如蛋白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶保持(SP)法等，个中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4、现在几种常用免疫组化方法简朴引见
1)免疫荧光方法是最早成立的免疫组织化学技术。它哄骗抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下考察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激起光的照耀后即会收回一定波长的荧光，从而可肯定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简洁，所以在临床病理诊断、查验中利用较广。
2)免疫酶标方法
免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年月成长起来的技术。基来源根基理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后到场酶的
底物，天生有色的不溶性产品或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞轮廓和细胞内的各类抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是今朝最常用的技术。本方法与免疫荧光技术相比的主要长处是：定位精确，比照度好，染色标本可持久留存，合适于光、电镜研究等。免疫酶标方法的开展十分敏捷，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的精益求精和立异，其特异性和敏捷度都在不息提高，使用也愈来愈便当。今朝在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。
3)免疫胶体金技术
免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特别的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能疾速而不变地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有显著的影响。是以，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同巨细的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以避免疫胶体金技术分外得当于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈浓至深白色，因此也适合进行光镜窥察。如运用银加强的免疫金银法例更便于光镜视察。
5、被检测的物资
组织或细胞中但凡能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
6、特性
1)特异性强。免疫学的根本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白(keratin)显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。
2)敏感性高。在利用免疫组化的肇端阶段，由于手艺上的限定，只有直接法、直接法等敏感性不高的手艺，当时的抗体只能稀释几倍、几十倍；而今因为ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍乃至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法愈来愈便利地运用于通例病理诊断事情。
3)定位正确、形状与功用相结合。该技能通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的精确定位，因此可同时对差别抗原在统一组织或细胞中进行定位调查，这样就能够进行形态与功效相结合的研究，对病理学范畴展开深切研究是非常成心义的。
7、从蛋白程度检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA 的异同
1)Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是操纵抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能越发准确；当然Western blotting 也可定性和定位(通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白离别检测其中抗原含量，进而间接反应它们的定位)，但敏感性远远低于免疫组化技术。
2)ELISA：酶联免疫吸附实验，也是使用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最正确，是排泄性蛋白检测首选方法之一。
实验流程简介
1、SP三步法
1)石蜡切片，常规脱蜡至水。
2)0.3%或3%H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。
3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟
4)候选步调：采取抗原建复：微波(发起30分钟内4次中水)、高压、酶修复要领。天然热却，再用3分钟×3次.
5)血清封闭：室温15-30分钟，尽量与二抗来历分歧。倾往，勿洗。
6)滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜(最好复温)。PBS冲洗，3分钟×5次。
7)滴加生物素标志的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。
8)PBS冲洗，3分钟×5次。
9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育30分钟-1h。
10)PBS冲洗，3分钟×5次。
11)显色剂显色(DAB等)。
12)自来水充裕冲洗。
13)可进止复染，脱水，通明。
14)选择适当的封片剂封片。
2、即用型二步法
1)脱蜡、水化组织切片。
2)根据所应用的一抗的非凡要求，对组织切片进行预处置。
3)0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。
4)滴加一抗，室温或37℃孵育30~60分钟，或4℃留宿，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。
5)滴加enhangcer加强剂，37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5
次。
6)滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟×5次。
7)应用DAB溶液显色。
8)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
3、免疫荧光技术(略)
枢纽环节分解(较前有所更新)
1、酶免疫组化的环节环节
1)标本固定：固定的目的是①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于取得杰出的染色结果；③固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用4%多聚甲醛，但睾丸组织、眼可能要选用Bouin's液或mDF液效果较好。
2)脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水、对组织要完全浸蜡、切片时刀片要干净和厉害。否则，容易裂片和脱片等。
3)脱蜡和水化：这是为了前面的抗体等试剂可以或许充实与组织中抗原等结合反映。脱蜡可以先60度20min，然后当即二甲苯1-3别离10min(这个时间是由二甲苯新颖水平和室温等综开决议的)，但当天造好的切片一般先60度3-4h。水化用梯度乙醇(由高到低)。若脱蜡和shui化不全易出现局灶性回响反映和浸洗不齐，而产生非特异性后台着色。
4)抗原修复：因为组织中部门抗原在甲醛或多散甲醛牢固进程中，发作了蛋白之间交联及醛基的封闭感化，从而落空抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决意族从头表露，进步抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为多少种(详细的可以查阅相干材料，年夜量的：中性的、高pH的等)。我们实行室一般用微波修复中火6min*4次，效果不错。留意微波修复后天然冷却30min阁下(只要你感觉修复液的温度达室温便可)。
5)细胞通透：目标是使抗体可以或许充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子构造的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为保举使用，这样抗体就可以顺遂进入胞内与相应抗原结合。在免疫组织化学(10um厚切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上打孔。同时也是一种去污剂，一般在PBS中插足后终浓度是0.05%即可，而前者末浓度是0.5%-1%。石蜡切片4um左左可以欠亨透，因为细胞曾经被切开了。
6)灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易支到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，可以10min左右，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间，一般10~30min；用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS可能好在回护抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片；现用现配，配好后4度避光保存。不过，目下当今已有"第二代即用型免疫组化试剂盒"避免内源性生物素的干扰，引荐使用。
7)血清封闭：组织切片上有盈余的位点可以与一抗非特异性结合，造成后绝结果的假阳性；封闭血清一般是和二抗同一来历的，血清中动物本身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合；也能够用小牛血清、BSA、羊血清等，但不克不及与一抗来源一致。一般室温10-30min。但也要防止封闭过分
8)一抗和二抗浓度和孵育时间：一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包罗孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要摸索。二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。建议一抗反应在4度最佳，反应温文，但时间最好超过16~24h。
9)抗体稀释液：其实许多实验室抗体稀释液就用一般PBS即可，但专用的抗体稀释液中除PBS成分外，还加了叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等组份，反抗体的多次收受接管行使较好。正因为这种原因，我一向用国产的公用抗体稀释液，一段时间在更换新抗体稀释液时实验结果出现了阴性结果(提醒可能一抗没有结合)，最后从抗体浓度和孵育时间、封闭时间等原因排除后，发现是新抗体稀释液的PH值偏酸，而使抗原抗体反应不佳，终而出现假阴性结果。
10)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，
以是适本地增强清洗(延长时间和增屡次数)尤其重要，我一般在一抗孵育前的洗濯是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。留意：①单独冲洗，防止交叉反应造成污染。②温顺冲洗，防止切片的脱落。我喜好用浸洗方法；③冲洗的时间要充足，才气完全洗来结合的物资。④PBS的PH和离子强度的运用和要供。
这方面我有惨重教导，其时我买的抗体稀释液偏酸，成绩配景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有益于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于剖析；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于合成)
11)DAB显色：背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，首要由显微镜下节制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗；DAB 显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这极可能说明你的抗体浓度太高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；另外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；DAB 显色时间很长(如跨越十几分钟)才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度太低或孵育时间太短(最好一抗4度过夜)；另一方面就是封闭时间过长。
12)复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，常常用苏木素复染(胞核染料)。注意苏木素复染时间要看当时的室温、溶液的新旧、目标抗原的定位等情况，一般数秒-数分钟，胞浆蛋白可以适事先间长一点，而胞核蛋白则要短。不过这个如果染色不睬想可以弥补的。方法是：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色即可。盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用不同。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒(一定动作要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。13)封片：为了历久保存，我们一般用中性树胶等封片，避免产生机泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的谁人拐角，接近封片液近真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在接续弥散时，则可以迟缓降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。
2、免疫荧光方法中的重要环节
1)冰冻切片制备：建议用新陈组织，否则组织细胞内部布局粉碎，易使抗原弥散。选用洁净尖利的刀片、组织必定要冷冻适度等，防止裂片和脱片宽重。
2)组织切片固定：切好片风干后立刻用冰丙酮等固定液进行固定5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要实时固定和适当保存。
3)血清封闭：为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清(与二抗起原同等)封闭，削弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min。
4)一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要，包孕孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，个中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有闭，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。具体条件还要试探。
5)二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，如果稀释液还要摸索浓度，切纪要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后，荧光素标记的二抗跟着生存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素残留，需要注重配制时小包装和并进行适当的离古道热肠。
6)复染：目标是形成细胞表面，从而更好地对方针蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。
7)封片：为了恒久保存，我们一般用缓冲苦油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产活力泡，方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一脚拿劈面的阿谁拐角，靠近封片液远真个拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体打仗面在不休弥散时，则可以迟缓降低另一拐角，这样一般不会产气愤泡。
8)切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增加次数)尤为重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。注意(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式；(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。(4)PBS的PH
和离子强度的使用和要求。这方面我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄(未见特异性染色)，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。(中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解)
9)摄影：有条件的话最好当即拍照，若不能实时照相，也要封好片和用指甲油封固，连结避光和干度。使用荧光显微镜注意严酷依照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随便改动法式；应在暗室中进行查抄；防止紫外线对眼睛的侵害，在调整光源时应戴上防护眼镜；搜检时间每次以1~2h为好，凌驾90min，超高压汞灯发光强度逐步降落，荧光削弱；标本受紫外线映照3~5min后，荧光也明明减弱或退色；激起光长时间的照耀，会发生荧光的衰加和淬灭现象；所以最多不得超过2~3h；荧鲜明微镜光源寿命有限，标本应集合搜检，以节流时间，庇护光源。天热时，应加风
扇散热降温，新换灯胆应从最先就记实使用时间。灯燃烧后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次扑灭光源。封闭汞灯最少在开启15-30分钟后；标本染色后立即观测，因时间暂了荧光会逐步减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；使用的玻片等载体，都必须厚度匀称，无显明的自觉荧光，如果使用油镜，还必须包管镜油为无荧光镜油；电源最好装稳压器，否则电压不稳不但会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
3、免疫组化和免疫荧光成果阐明：见第一场实验讲座。
案例一DAB染色后切片着色一片黄/背景深
背景：
奥运会时代我们课题组研究生都在实验室做实验，许多从北京采办的试剂买不到，对我们的许多实验产生了很大的影响。我以前一向用中杉金桥的SP三步法染色试剂盒，效果不错，在奥运会时期我筹办做同批实验分不同批次酶免疫组化实验，第一批组化实验结果很好，抗体浓度感受比较符合(Santa Cruz公司1：200)，等做第二批时发现封闭血清不够了，为了保证实验顺遂进行，我又从祸州迈新顶了一个SP试剂盒，同时抗体稀释液也不够了，我又从新从专士德公司买了一小瓶10ml。从第二批实验开端，组化实验结果不断显示强背景着色，特异性染色很难分辨。问题及其解答：产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?
1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条。
2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。
3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织)，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；
4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；
5、DAB孵育时间过长或浓度太高；
6、PBS冲洗不充分，残留抗体结果加强着色，在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要；
7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。
我的实践解决方案：
以上的剖析可能对付初学者仍是不简单的，上面我就把我的清扫尝试的具体过程与各人进行分享、交换和会商。
1、起首清除抗体孵育条件。一般来讲，着色效果的黑白与抗体的
孵育条件是稀弗成分的，由于用SP法已做出来过一次且效果不错，因而对于一样组织的同一抗原进行分析，这种因素可以先清扫。
2、其次，DAB孵育时候是不是太少?做出去那一次我是孵育8min，厥后也是8-10min，我零丁做了一次尝试来解除该身分。成果孵育2、5min时先泛起布景，而特异性染色较浅，故那没有契合常理，普通先出现特同性染色，然后跟着工夫的耽误，会呈现非特同性后台着色。
3、最后，血清封闭的问题?从前我一般孵育15-30min，所以我单独做了一次实验用血清封闭室温1h，其它条件同做出来的那一次，结果也一样背景着色很深。
4、此外，我在改良的同时，也对PBS清洗不竭地延长时间和增加次数，乃至完全参照试剂盒仿单来进行操作(我之前一般一抗4度过夜且室温复温45min、二抗37度30min、SP反应37度30min)，和过氧化氢灭活加强等等均未起到效果。我沉着地分析了一下整个实验流程，与第一次做出来比拟，只有两个处所做了窜改：因血清不敷而改换了不同厂家试剂盒、因抗体稀释液用完而从头买了抗体稀释液。
5、我用PBS替换一抗稀释液(我之前借收受接管抗体，自我以为抗体稀释液中含防腐剂和蛋白不变剂)，别的步调和组织切片完整与第一次做出来的一致(包罗血清也是老试剂盒内残剩的一点)，古迹出现了：成效很好。--由于抗原抗体反应除温度、抗原/抗体浓度中，然后就是PH值，因而我测了新抗体稀释液、老抗体稀释液和PBS的PH值，了局是前者偏酸性(
6、0)，然后二者均在
7、5阁下。
6、看来重要祸端是抗体稀释液的PH值出问题了，因而我又用PBS 替换抗体稀释液和新试剂盒内的试剂对组织切片做了免疫组化，效果照旧没有做出来：背景很深。这实把我搞惨了。莫非另有什么缘故原由吗?通过细心分析：一抗必然是结合上去了(老SP试剂盒结果很好)，题目是二抗没有结合上去也差池(因为最后背景很深，这阐明二抗可能也结合上去了)，DAB孵育时间此刻只用1、5min也是背景深而特异性染色浅，那我又思疑封闭血清了。
7、我做了两张切片：一张用老试剂盒内还剩下一点的血清而另一张用新试剂盒内的封闭血清，别的试剂(二抗、SP)均用新试剂盒供给的，结果是前一张效果很好，尔后一张能够看到特异性染色，但背景太深，拍照效果欠安。--看来封闭血清也是功会罪魁之一。结果分析表现：抗体稀释液的PH值偏低和封闭血清的shi效导致了我的免疫组化结果的不佳，看大师在今后的组化实验中也要注意这两个不太惹人注意的要害问题。--凄惨的教训，值得引觉得鉴。
案例二DAB染色后切片着色呈阳性后果
背景：
实在免疫组化在DAB染色后一般有四种情形：阳性染色效果很好、阴性染色、非特异性染色很深、阴阳脸(染色不平均)。而阴性染色是很多初学者常常碰到的头痛问题。我身旁有个研讨生同窗在我们真验室初度涉入免疫组化，传闻步骤不难，跟我背面做了几回以后，就本身起头做了，持续做了三次，结果均是阴性染色。很失望，不知是什么缘由招致的。
问题及其解问：免疫组化染色呈阴性结果的原因有哪些?
1、抗体浓度和质量问题和抗体来源选择毛病。不知抗体是入口的照样国产的工作液，怎样这
么高稀释度也没能做出阳性结果?另外，不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必需探索最佳浓度。
2、抗原修复不全，对甲醛固定的组织必需用充分抗原修复来翻开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min 尝尝。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不可，还可高压修复。
3、组织切片自己这种抗原含量低；
4、血清封闭时间过长。
5、DAB孵育时间过短。
6、细胞通透不全，抗体已能充实进进胞内介入反应。
7、入手下手做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。
我的现实办理计划：
1、起首，破除组织切片内的抗原有没有丧失及其含量几多。免疫组化中两个最紧张的身分是抗原和抗体。(1)抗原有没有丢得首要看组织切片的奇怪水平，一般切片室温保留超越3-6个月，可能切片内的抗原丢掉很严峻(有文献撑持)，此时可以通太重新用白腊块切片来进一步考证(蜡块需要高温留存)。(2)白腊切片在建造历程中大概果醛基对立原决定族的封闭，这需要通过抗原修复来充裕露出，从而删加抗原抗体结合反应，提高阳性率，我一般用6min*4次中火微波抗原修复，用枸橼酸钠缓冲液。(3)组织切片中自己抗原含量的几?这方面我有经验的，我做胎鼠睾丸间质细胞判定，用1：200一抗效果很好；但我用1：200一抗孵育成年睾丸间质细胞检测，几近呈阴性，后来证明是由于二者抗原含量相差甚近，则一抗也要适当进步浓度。
2、其次，检查抗体有无选择错误和抗体孵育条件能否不适。(1)
一抗选择单克隆抗体易出现阴性结果，因为灵敏度低但特异性好；一抗的species reactivity中无检测组织的种属，这是比较常见的错误；一抗选择rat，而二抗是抗mouse/rabbit等均有可能出现阴性结果。(2)抗体孵育时间过短，容易导致阴性结果。一般一抗我建议4度孵育过夜和37度复温45min；二抗我一般37度30min。我不喜欢参照二抗染色试剂盒说明书。(3)抗体浓度过低。这是阴性结果的最可能原因。必须提高稀释度，我一般首次做一种新抗体，必须先用说明书建议的低浓度和高浓度做一次，然后决定是向高照样低标的目的摸索。一般先决定二抗的浓度(工作液就好办了，直接滴加)，重点摸索一抗的最适浓度。注意：免疫反应中存在前带和后带效应，这提醒不是浓度越高，阳性率就越高，反之亦然。
(4)重要原因排除之后，也不要无视抗体的质量：原装抗体一般比较稳固，效果较好；而入口分装次之；工作液可能要注意质量问题。
3、同时，DAB的孵育时间可能要适当延长，在镜下察看，偶然可延长至30min。但一般3-10m in最好，此时背景也较浅。可则，申明抗体浓度不适宜。
4、最初，血浑封闭时间也可响应缩短。一般10-30min，但这个时间可以调解，启闭主如果下降切片的整体配景着色。
5、此外，细胞通透也不成轻忽。很多战友以为石蜡切片一般不需细胞通透，因为切片时可能已经把细胞切开了，但对于胞核蛋白，建议照旧通透一下，增进抗体等试剂充分进入到场反应。
6、以上原因，都是针对现实中常见原因来进行分析的，条件是排除操作者的操作错误而引起阴性结果，这就需要新手仍是要设置阳性对照以排除方法的问题。还有抗体稀释液的PH值过低等其它原因的滋扰。总之，要想把免疫组化做好，可能每个环节都很重要，但也存在主次之分，出现问题了，需要通过先排除主要的，再顺次排除主要的--这是权衡你对免疫组化原理把握与否的枢纽地点。
案例三石蜡切片免疫荧光染色呈阴性结果或非特异性结果
背景：
因实验需要，于2008年07月04日初次做肝脏组织ZO-1(一种胞膜蛋白，慎密毗邻蛋白)免疫荧光染色，以前我对酶免疫组化很是熟习，在园子内也有很多置顶贴和精髓帖，但免疫荧光一直还没做过(原理知道，但细节不太认识)。我先用石蜡切片做了5次，结果不停不幻想(表示为未见特异性强染色)；近几日，我又切了冰冻切片，做了2次，终究根基成功了。在这个过程中，我对免疫荧光染色技术有了全新的熟悉，而前些天发出免疫荧光乞助揭，答
复的很少，所以有需要加强对免疫荧光方面的计议)，不当的地方敬请斧正。有人会问酶免疫组化做的好好的，为什么要做免疫荧光?其实，这也是我以前思虑的困难，如今我认为可能胞膜蛋白含量不高，用通俗免疫免疫组化可能做不出来，需要敏感的免疫荧光方法来进行蛋白检测(我是看许多外文文献都是这样做的，因此选择免疫荧光染色。)
问题及其解答：如何降低非特异性荧光染色和避免阴性着色?
1、非特异性染色产生原因及其解决方案：
(1)游离荧光素残留在二抗中。一部门荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不克不及被透析除去。二抗设置装备摆设时用透析法或层析法别离荧光素符号的二抗和游离的二抗。购置高质量、高纯度的荧光素二抗。
(2)抗体之外的血清蛋黑与荧光素连系构成荧光素脲卵白，可与组织成份分离。
(3)组织抗原封闭不全。撤除查抄的抗原之外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman氏抗原)，可与组织中特异性抗原之外之之响应抗体结合。延长血清封闭时间。
(4)从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中常常混同一些抗其他组织成分的抗体，乃至容易混合。
(5)抗体分子上标志的荧光素份子太多，这类过量标识表记标帜的抗体分子带过量的阳离子，可吸附于一般组织上而显现非特异性染色。
(6)荧光素不杂、标本流动不妥等。
(7)一抗和二抗孵育前提和浓度分歧适。调剂一抗和二抗孵育条件和浓度至最好。
(8)一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次数和延长清洗时间。
2、阴性染色产生的缘由有：
(1)一抗和二抗浓度不适合或孵育前提不当。
(2)荧光素提早阑珊。荧光本质量欠安或操纵过程当中出有留意躲光等避免荧光素阑珊的事项。
(3)血清封闭时间过长。
(4)抗体稀释液PH值分歧适，影响抗原抗体反应。
(5)组织切片不服、裂片或脱片很严重，易引起大块阴性着色。
(6)组织标本不新颖或已冷冻组织制成的切片中抗原易弥集，易引发原本表达的部位阴性染色或弱着色。
(7)荧光显微镜不会使用，引发波长选择错误。
已有的常见免疫组化困难散锦
1、石蜡切片和冰冻切片的比较?
(1)要求做冰冻切片的纷歧定能做石蜡切片，这是明天我背一教员就教得出的结论。因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会毁坏组织的抗原性，假如组织的抗原性较不乱，则可作石蜡切片；然则要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
(2)冰冻切片的劣点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。错误谬误是细胞内易形成冰晶而破损细胞布局，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的标致。当你买一抗时，目次上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
(3)石蜡切片的长处可以连结组织细胞的形态构造，且容易寄存在室温，而冰冻切片对照费事，一定要存在-80度的低温冰箱中，特别是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保留一向很重要。由于石蜡切片可以切到4微米摆布，所以原位纯交探针容易渗入到组织中去，轻易胜利，并且得到的色彩/形态都较冰冻切片好。
2、一抗的选摘要点和技能是甚么?
(1)单克隆和多克隆抗体的挑选。由一种克隆发生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能方针明白地取单一的特异抗原决议簇连系，就像导弹切确天射中目的一样。另外一方面，即便是统一个抗本决意簇，在机体内也能够由好几种克隆来发生抗体，构成好几种单克隆抗体稠浊物，称为多克隆抗体。正在抗原抗体反响中，一样平常单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原活络度相对便低；而多克隆抗体特异性稍强，但抗体的亲和力强，活络度下，但易出现非特异性染色(能够经由过程封锁等制止)。
(2)使用规模的选择。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；以至讲明石蜡切片或冰冻切片。
(3)种属反应性的选择(species reactivity)。这一点很重要，表白这类抗体可能存在种属差
异，且这种抗体合适检测哪一种种属动物体内的抗原。
(4)种属起原，一般兔滥觞的多是多克隆；而小鼠泉源的多是单克隆，但也有别的。凭据此根源来选择相应的二抗。
(5)出产厂家的选择。如santa Cruz公司抗体一般1ml，价钱2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，价钱2800元左右。这两个厂家的同一种抗体它的实际效价不乱是不同的，我一般用后者抗体做免疫组化效果较好，而前者做Western blotting效果还可以。
3、在甚么环境下利用TritonX-100?
(1)Triton X-100化学称号为聚乙二醇辛基苯基醚，是一种去污剂。在免疫组织化学(10um
薄切片)和免疫细胞化学中一般用Triton X-100作为细胞通透剂，在膜上挨孔。
(2)其作用原理：Triton X-100可以消融细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能逆利进入胞内与相应抗原结合。
(3)Triton X-100既是一种概况活性剂，也有抗氧化作用，具体参阅：、封闭血清的选择原则是什么?
(1)膜上或切片上有残剩的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！
(2)封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物本身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。
(3)也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。
5、抗体孵育条件的比力?
(1)一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，此中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min。
(2)二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。
6、一抗4度孵育后为何要进行37度复温?
(1)一圆里，防备切片从4度间接放进PBS易脱片；
(2)另一方面，使抗原抗体结合更波动。一般不需要,但对表达较弱的抗原可能有效,4度和37度时分子活动体式格局不同,前者分子碰碰机率和活动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性也提高了并易造成非特异染色。
(3)实在，我更附和后一种道法，因为我测验考试把肝脏或睾丸电影从4渡过夜拿出后，曲接用PBS洗没收生过脱片征象。究竟胜于雄辩！
7、DAB显色时间如何掌控?
(1)DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；
(2)DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度
过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间；
(3)此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；
(4)DAB显色时间很长(如跨越十几分钟)才出现阳性染色，一方面能够申明您的抗体浓度太低或孵育时间太短(最好一抗4度留宿)；另外一方面就是封闭时间太长。
8、免疫组化成绩若何阐发?
(1)阳性着色细胞计数法。在40*光镜下，随机选择不堆叠的10个视家，野生或机械计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然落后行组间比拟即可。
(2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择沟通地区、不异条件下用image j进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。
(3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片划分按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性局限进行评分(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%)，
终究可以分数相加，再举行对照。关于以上这几种方法，各有益弊，请仔细选择。要念获得准确效果的条件是你要做出着色平均、靠山很浅的高质量切片。
9、在什么环境下进行组织抗原修复，抗原修复的条件是什么? (1)由于组织中部份抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而落空抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族从新表露，提高抗原检测率。
(2)修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种(具体的可以查阅相干资料，大量的：中性的、高pH的等)。
(3)微波修复，我们一般用6min*4次，结果不错。
10、内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度是什么?
(1)一般3%过氧化氢灭活时间短面，可以10min摆布；而0.3%过氧化氢则可以恰当耽误关闭时间，一般10~30min。
(2)用甲醇设置过氧化氢比单蒸水或PBS可能好在护卫抗原和固定组织作用，过氧化氢孵育时间过长易引起脱片.
(3)现用现配，配好后4度避光保存。
11、如何才能充分脱蜡?
(1)蜡不溶于水，如果脱蜡不干净，少量蜡存留于切片上，将会引发染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等。为领会决上述的问题，切片在染色前必须彻底脱蜡，目前用于脱蜡的试剂主如果二甲苯，因它脱蜡力强，脱蜡时间较短；
(2)脱蜡的时间要根据季候，室平和试剂的新鲜碰面是在不同。若
是在炎天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需许多，3-5分钟就已足够。假如在冬季，室温较低，脱蜡试剂也较陈腐，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长。
(3)当天切的切片，烧烤2小时后进行染色，切片带有温度进行脱蜡这将可加快脱蜡的过程，如果预先切好烤好的切片，在染色前，还必须对切片进行加温10-20分钟，然后再行脱蜡，这样脱蜡速度放慢，效果魁梧更好。
总之，操作时应根据不同的时节，不同的室温，不同的试剂来决定，脱蜡的时间，原则上是要彻底、清洁、完全地脱去切片上的蜡。
12、如何最大限度地降低组织非特异性染色?
(1)收缩一抗/两抗孵育时间、密释抗体来节制。这是最主要的一条。
(2)一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，倡议试用单克隆抗体看看。
(3)内源性过氧化物酶和死物素在肝净、肾脏等构造露量很高(含血细胞多的组织)，需求经由过程延伸灭活时间和增添灭活剂浓度来低落布景染色；
(4)非特异性组分与抗体联合，这必要经过延长二抗滥觞的植物免疫血清封闭时间和得当增添浓度来增强封闭结果；
(5)缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等；
(6)恰当增长PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育以后的浸洗尤其主要；
(7)防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。13、苏木素复染时间的掌握?
(1)苏木素复染时间要看那时的室温、溶液的新旧、目的抗原的定位等状况，一般数秒-数分钟。不外这个假如染色不睬想可以解救的。即：染色深则分化时间稍长些即可；染色浅则再置于苏木素中染色便可。
(2)盐酸酒精是分化，氨水是返兰。作用分歧。电影复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒粗中数秒(肯定行动要快)后拿出流水振洗，在放入氨水中返兰即可。
(3)如果分化的色彩过浅，可以复置于苏木素中染色。
14、PBS的清洗体例选择、次数和时间的选择?
(1)单独冲洗，防行交叉反应制成污染。
临床上天天检测的病例良多，所用的抗体品种及项目也多，若是在插手一抗孵育完后，将它们在一个缸内洗，如许就会形成交织污染，影响末了的成效。准确的做法是独自地停止冲刷，冲刷的PBS为一次性，包管切片没有彼此穿插净化的机遇。
(2)温顺冲洗，防止切片的脱降。
冲洗切片，掏出切片，将PBS从上悄悄地冲洗，让PBS自上而下贱下来，不要拿起切片将PBS瞄准切片冲洗，这样由于冲出的PBS 有一定的打击力，很容易使切片周边惹起紧动，致使切片的脱落。
(3)冲洗的时间要足够，才能完全洗去结合的物质。
冲洗切片有人提出用微振荡器振染，振下未结合的种种物，使之不产生背景，此种做法一是华侈时间，二是很容易导致切片的脱落。切片的冲洗据实践以为，用一小烧杯温和地于切片上冲洗，就可以彻底冲洗去未结合的物质，无需附加其它条件，冲洗好过切片上再注入PBS，延续2分钟左右就完全足够了。
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求。
刘彦仿指出：中性及弱硷性条件(PH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。[]免疫组化P56我们目前常用的PBS 的PH在7.4-7.6浓度是0.01M，根据本室十几年来的使用情况，认为该溶液代价廉价配制方面，使用效果好。
(5)常用试剂的配制和使用。
在免疫组织化教的染色过程当中，用得最多的试剂就是缓冲液，由于切片在全部染色中，抗体的减、换、切片的冲洗，DAB的配制皆离不开缓冲液。可睹缓冲液在全部染色中都起至关头的感化，缓冲液的过酸或偏偏碱，都将影响染色的了局。
15、脱片产生的原因和如何防止脱片?
(1)多聚好氨酸玻片质量的问题。我本来是买的，迈新按说也是不错的，但是都脱成什么模样了。后面补做第二批时用的病文科先生本身做的片子，要好一点。
(2)组织切的欠好，切片机的问题比方比较老的旧的机械切的厚大概不均匀，或者切片者手法不好等。
(3)组织的问题，我用的组织癌症的良多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。
(4)没烤好，时间短温度不敷之类。
(5)操作的时辰甩的太猛了，有脱片怀疑的片子最好不甩或轻沉甩，用卫生纸从边沿上渐渐吸水。
(6)修复的成绩：抗原修复的时刻高压时间太长了，或放进100度的修复液时伎俩欠好，咚的一声就拾出来了，如许超轻易脱片。别的，用EDTA修复比柠檬酸轻易脱片，可是你要用到EDTA的时辰也没法子，只要从别的的题目上动手。
(7)此外，一旦见到有组织漂起来操作就愈加要谨严，用PBS的时分只管用泡的，不冲要。根基上把这些方面都注意到了，能改擅
的尽量改进，脱片可以削减许多。
16、背景染色较深的原因有哪些?
(1)抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原因之一。解决法子是，每次使用新抗体前该当对其工作浓度进行测试，使每抗体个别化，找到适合自己实验室的幻想工作浓度，既使是即用型的抗体也应如斯，不能只简单的按说明书进行染色。
(2)抗体孵育时间过长或温度较高：解决设施是，严厉履行操作规程，最好随身佩戴报时表或报时钟，及时提示，避免因忘记而造成时间延长。目前风行的二步法(Polymer)敏感性很高，要求一抗孵育的时间不是传统的1小时，而是30分钟，因此，要根据染色结果进行调整。
(3)DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用现配，若有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不该存放时间太长，因为在没有酶的情形下，过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效率，未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种仿佛节俭的门径是不成与的。DAB的显色最幸亏显微镜下监控，到达抱负的染色程度时立刻停止反应。不外当染色片太多时或用染色机时，这样做仿佛不实际，但最少应对一些新的或罕用的抗体显色时进行监控，避免显色时间过长。
(4)组织变干：修复液溢出后未实时弥补液体、染色切片太多、举措太缓、健忘滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的举措是操作要当真认真，接纳DAKO笔或PAP Pen在组织四周绘圈，可以有用的防止液体流掉，也能提高操作速度。
(5)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)：原因上不清晰，但现象存在。
有的实验室喜好前一天将切片脱蜡至修复，第二天加抗体进行免疫组化染色，如果将拆有切片和修复液的容器放在4oC冰箱过夜，对结果无较着影响，如果放在室温，出格是酷热的炎天，会出现背景着色，是以，不行存放时间太长。
(6)一抗变量、质量好的多克隆抗体：注重抗体的有用期，过时的抗体要末不隐色要末靠山着色。用新购抗体时最好设坐阳性比较和用利用过的抗体做比力。
17、苏木素复染后氨水返蓝这一步如何做、浓度几何、时间多长? 答：返蓝可以用碱性溶液(PBS/Na2HPO4/淡氨水)或45度温水、冷水蓝化都可。一般蓝化5~10 min。淡氨水有人用50ml自来水+三四滴的氢氧化铵。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤
HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程
石蜡切片免疫组化染色实验操作流程_ 1．石蜡切片脱蜡至水： （石蜡切片染色前应置60℃1小时）。 ①二甲苯I、II，各30分钟。 ②梯度酒精：100%I、II，各10分钟;95%，5分钟;80%，5分钟;70%5分钟。 ③蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。 2抗原修复： 根据待检测的抗原，选择适当的方法。 附： 抗原修复液（10mMpH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制： ①储备液的配制： A液： 枸橼酸三钠-2H2O 29.41g+蒸馏水1000ml；B液： 枸橼酸21g +蒸馏水1000ml；②工作液的配制： A液82ml+ B液18ml+蒸馏水900ml 抗原修复的方法： 高压锅处理技术： 枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH
6.0），淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。晾至室温抗原修复的注意事项： ①组织不能干。②选择抗原修复方法要因抗体而异。③该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。 3．PBS：5分钟，2次（置于摇床） 4．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温20分钟（避光）。 5．PBS水洗：5分钟，2次。 6．正常血清封闭： 从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片 正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态,）滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。 附： 正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)： 按1:10比例，用PBS配制，每张切片需要量按50μ+5μl (10%抛洒量)计算。 7．滴加第一抗体： 用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体50μ，（也可置于4℃冰箱过夜）。 第二天片子晾至室温 8．PBS：5分钟，2次。 9.滴加聚合物增强剂（试剂A），37℃孵育30分钟， 0.01 M PBS洗涤三次，5分钟/次，振洗。
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
石蜡切片的基本操作流程
石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及
石蜡切片、HE、免疫组化步骤
石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太
石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤 1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。 2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min) 4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g 枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml) 5. PBS浸洗2次各5min 6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。肝组织过氧化物酶含量高。需增加浓度或增长时间。蒸馏水洗2minx3次 8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要） 9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。（pv法不需要） 9.滴加一抗4℃过夜 10.PBS浸洗3次各5min 11.滴加二抗室温或37℃孵育30min 12.PBS洗3次各5min 15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗 16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗 17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵； 18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min) 19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干 二、操作流程 1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行： 二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min） 2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。 4、抗原热修复：将切片置于装有抗原修复液的玻璃容器中（耐高温），进入微波炉内，容器内液体温度达到95～100℃后断电，连续三次。 5、PBS冲洗5min×3次。 6、5%BSA封闭液20min，甩去。 7、用0.1mol/L PBS稀释一抗100倍，滴加后4℃过夜。 8、PBS冲洗2min×3次，滴加二抗37℃20min，PBS冲洗2min×3次，滴加SABC 37℃20min，PBS冲洗5min×4次，显色剂显色。 9、自来水冲洗，封片，观察。 注意：如果需要做双标记法，则在操作完步骤8后，重复步骤3～8即可
组织切片石蜡切片过程
石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块
二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。
免疫组化HE染色步骤
免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
石蜡切片详细步骤
石蜡切片 1.仪器 石蜡切片机、烘箱、显微镜、染色缸、小培养皿、镊子、毛笔、吸水纸、纱布、载玻片、盖玻片等。 2. 试剂 FAA固定液(70%酒精90ml、冰醋酸5ml、福尔马林5ml)、10%番红水溶液、0.5%固绿（用95%的酒精配制）、酒精（100%、95%、80%、70%、50%）、二甲苯、蒸馏水、甘油、中性树胶等。 3.取材 幼嫩的油菜植株叶片和茎 4.方法与步骤(参照) 1．固定： FAA固定液固定48小时以上。 2．脱水： 50%酒精→70%酒精→83%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精。每级2h。100%酒精中1.5h。其中70%酒精处可长期保存。 3．透明： 1/2二甲苯+1/2无水乙醇 (2h) →纯二甲苯(1.5h) →纯二甲苯(1.5h) 4．浸蜡： 将处理的材料置于1/2石蜡(固体粉末状)+1/2二甲苯中，40℃烘箱敞口过夜。 5．包埋： 先提升恒温箱的温度至60℃，换纯蜡3次，每次1-2h，用硬的电光纸、牛皮纸叠纸盒，置于45-60℃的烫板上，倒入材料，摆放好材料，把标签（正面向外置于底部），补足石蜡，倒好后轻轻的置于冷水盆中，注意底面要接触盆中凉水，待石蜡全部凝固后可取出晾干，也可在凉水盆中放置过夜。 6．切片 对包埋的材料进行修块、粘块、整修后，保证材料四周都有石蜡包围。但不可太多。切面的上、下边平行。用加热的解剖刀蘸取少许石蜡碎屑，并迅速将石蜡块四周的碎屑烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。检查切片机，安装切片刀、调整好刀的角度，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置后开始切片。
7．粘片 将粘贴剂置簿玻片上，再取切片浮置粘片剂上，然后置烘片台上，使切片展开烫平，材料不现皱纹为度。最后将切片依次排好，用滤纸吸去多余水分，同时以记号笔在玻片上编号，放入温箱中烘干，温度30～40℃中过夜。 8．脱蜡 脱蜡用二甲苯，把烤好的载玻片放于盛二甲苯的染缸中：纯二甲苯(10-20min)→纯二甲苯(5-10min) 9．染色 将纯二甲苯脱蜡完全的材料，1/2 二甲苯十1/2纯酒精→100%酒精→95％酒精→85％酒精→70％酒精→50％酒精→1%番红染色(4h以上) →50％酒精→70％酒精→85％酒精→95％酒精→0.5%固绿(1min)→95％酒精→100%酒精→100％酒精(未注明时间各级均为3min) 10．胶封 滴加加拿大树胶封藏。 11.镜检，拍照
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤 Prepared on 22 November 2020
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理:应用基本原理——抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使的（、酶、、）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和），对其进行定位、定性及定量的研究，称为或. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液配成1000毫升溶液 应用液BNa2HPO4·配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A枸橼酸配成1000毫升溶液 应用液B柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠）配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝蒸馏水750毫升，碘酸钠，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras1:50-1:500 H-Ras1:50-1:500 K-Ras1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2切片脱蜡水化程序 ⑴二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各12分钟； ⑵无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各3分钟；（洗二甲苯） ⑶95%乙醇3分钟； ⑷85%乙醇3分钟； 3自来水漂洗3分钟，洗涤一定要充分。 4组织修复采用高温高压法：压力锅中加入，抗原修复液约1000ml，切片插入塑料架上，放入压力锅，盖上锅盖（此时不扣上压力阀）1600W预热至沸腾，扣上压力阀1300W，待高压锅阀门喷气开始计时，修复时间为2分钟。 5停止加热并用流水冲洗高压锅以降温，室温冷却。 6将抗原修复后切片置自来水中，浸泡2分钟。将样本置于内源性过氧化物酶阻断剂 3%H2O2，室温放置4分钟。（需要盖盖子）自来水洗2分钟，PBS缓冲液洗涤2分钟。
石蜡切片步骤
石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法 一、原理及应用 免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。 二、操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。 （4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。 注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。微波法最为常用。（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。 （10）次日取出切片，室温下复温30min。 （11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。 （12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。 （13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。（15）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （16）中性树胶封片。 三、免疫组化结果分析原则及具体方法 （1）必须同时设对照染色。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。 （2）抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上; CK应定位在细胞浆内; PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内; EMA应定位在细胞膜上等等。不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤 This manuscript was revised by the office on December 10, 2020.
免疫组化操作流程试剂准备 1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。 2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液 3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较