宏基因组实验计划
宏基因组实验计划
————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：
宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘:环境应激和应答基因的多态性。
探究：多态性基因的功能。
实验大体步骤:
I.环境样品的采集:
1）避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。
2) 样品的迅速处理保存。有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液（多为PBＳ)重悬，离心收集沉淀。分装成小份,冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。
3）如果后续用间接法提取总ＤＮA 的话,此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。
IＩ.DNA提取方法的选择：
总ＤNＡ的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。
间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点:直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等）总DNA 的试验中。其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA 提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DＮA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采用此法。其缺点同样明显,所得DＮA的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得ＤNＡ呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBiｏ和Ｅpicenｔre的DＮＡ提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。
间接提取法的优缺点:间接提取法则既可以用来提取固相样品总ＤNA也可以用来提取液体样品总DNＡ。在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取ＤNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DＮA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DＮA 得率低。?
土壤ＤNA 直接提取法：
(1)从超低温冰箱中取出保存样品(5 ｇ）;
(２) 于室温融化；
（３)加入1３.５ml CTAＢ抽提缓冲液和5０μl 蛋白酶Ｋ贮存液;
(4) 离心管于37oC ２25 ｒpm 水平振荡30 mｉn;
(５) 加入1．5 mL20%ＳDS;
(6) ６5oC 水浴2 h,每隔15 mｉn 轻轻颠倒数次;
(7) 室温6,0０0g 离心1０min,收集上清液,转移至一个新的50ml 离心管中;
(8) 沉淀中再加入4．5 ｍｌ提取液和０.5 ｍl 2０%SＤS，轻轻涡旋至混匀;
(9)浸入液氮中冷冻3 mｉｎ后，于沸水中煮沸3 min;
(１0)室温6,000g离心10 miｎ，收集上清液，与上次上清液合并；
(1１）重复(8)、(９)、(1０)一次;
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:氯仿(1:１v/v) 混合,摇匀后于4 ℃
12，０0０g 离心10 min；
(１3) 将上层水相转移至一新的50 ｍｌ离心管中,加入等体积的氯仿：异戊醇（24:１)，混匀后于4℃１２,000g 离心10 miｎ；
（14）再次转移上清至一新的离心管中，加入0.６倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h; (１5）室温12,00０g 离心２０min；
(16) 收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入１ml TＥ，于4 ℃放置过夜,分装保存于‐20℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧:??(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。?(2）用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。?(３)酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4）异丙醇沉淀时不要放在低温,０.7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) ＤNA溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。?(6)水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DＮA 间接提取法:
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
（2)采取差速离心取得水样中的菌体。
（3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如:用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有ＤNＡ的丢失等等。
Ｅｐｉcｅｎtre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（MｅｔａgｅnｏｍiｃDNＡＩｓoｌa
ｔion Kit for Watｅr),能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmiｄ克隆的DＮA片段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取4０ｋb大小的DNA。提取的DNＡ可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Ｅpiceｎtre的ＰCC １ＦＯS载体上。
优势:
１．无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。
2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。
３.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
4．Fosｍｉｄ载体与DＮA的克隆只需要90分钟。
下图为方法与流程：
粗提DＮA 的纯化
采用直接提取法提取的总DNA或多或少都含有腐殖质的存在。它的存在对后续的分子生物学操作会有影响,时常会导致ＰＣR 扩增不出来,酶切困难,连接转化率低。需要进行纯化。纯化的方法包括:胶回收，柱纯化,电泳/电洗脱，梯度离心。
a 胶回收
胶回收最大的优点在于快捷,可以在很短的时间内完成。纯化后的DＮA往往能够满足ＰCR要求。但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DＮA分子造成机械损伤,使得DNＡ弥散，完整度下降。如果后续的实验室分析16S r DNA,则这种纯化方式不失为一种好方法。?
b柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速,十几分钟内可完成。与胶回收相比，其纯化效果要差一些。但通常情况下，纯化之后的ＤNA也能够满足ＰCＲ需求。这种方法也会造成ＤNＡ分子的机械损伤，使得DNA 弥散,完整度下降。?
c 电泳／电洗脱
电泳／电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一,其价格低；其二,整个过程都很温和,能够保证DNA 的完整性;其三,纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。但是其亦有些许不便:其一,过程耗时长，包括透析袋的准备,电洗脱,洗脱液的浓缩等;其二,DNＡ损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metａgenoｍic 研究，这种方法不失为一种好方法。如果有脉冲场凝胶电泳系统,用此方法可以得到高纯大片段DNＡ,可以满足后续的metagenomiｃC／Fosｍｉｄ文库构建。
d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心
如果实验室有超速离心机(1０0,０0０ｇ以上),那么这种方法无疑也是一种好方法。与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DＮA。纯化得到的DNＡ经过低熔点凝胶电泳切胶回收,可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的ｍｅtagｅnｏmｉc C／Fｏｓmｉｄ文库构建。
纯化质量的检测
ＤNＡ纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一,完整度判断；其二,纯度判断。
a完整度判断
完整度判断同前所述,千万要记得的是加纯化之前的DＮA样品做对照。结果可以告诉我们纯化得率及完整度。同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。
b 纯度判断
纯度判断通常可以采用两种方法:分光光度计法和PCR 扩增法。分光光度计可以测定双链D ＮＡ在2６0nｍ处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。通过不同波长吸收值的比,可以对DNＡ纯度做出判定。通常这种方法由于灵敏性较高,所以在存在杂质时误差较大。
IIＩ．所提ＤNＡ完整性检测
ＤNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。最好采用0．8％琼脂糖凝胶电泳,低电压长时间跑。至少要用laｍbｄa DＮA／Ｈｉnd III 做marker,如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。如有条件,可以采用脉冲场凝胶电泳对提取ＤNA的完整度进行分析。用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个ｍaｋeｒ，至少还应该有完整lambｄａDNA (约４8 kb)充当另一个makeｒ。
以上为送测序前样品的采集，DNA的提取,验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。
Ｉllumina所进行的测序是由Gｅnome Ａnaｌyzer测序仪所完成的：
以上为GenoｍeＡnalyzer技术的基本原理IV.在DNA提取,检验完成后送BGI进行后续测序。