植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用

2004-08-24收到，2004-09-22接受。

*通讯作者(E-mail: ydwang@https://www.wendangku.net/doc/188427154.html,; Tel: 010-********; Fax:

010-********)。

缩写　BCH: Carotene b-hydroxylase (胡萝卜素β-环羟化酶); CCS:

Capsanthin-capsorubin synthase (辣椒红素-辣椒玉红素合酶); CrtB:

Phytoene synthase (八氢番茄红素合酶); CrtI: Phytoene desaturase

(八氢番茄红素脱氢酶); CRTISO: Carotenoid isomerase(类胡萝卜

素异构酶); DMAPP: Dimethylallyl pyrophosphate (二甲基丙烯焦磷

酸); ECH: Carotene ε?hydroxylase (胡萝卜素ε-环羟化酶); GGPP:

Geranylgeranyl pyrophosphate (牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸); GGPS:

GGPP synthase (牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶); IPP: Isopentenyl

pyrophosphate (异戊二烯焦磷酸); IPPI: IPP isomerase (异戊二烯焦

磷酸异构酶); LYCB: Lycopene β-cyclase (番茄红素β-环化酶);

LYCE: Lycopene β-cyclase (番茄红素ε-环化酶); NCED: Nine-cis-

epoxy-carotenoid dioxygenase (VP14，9-顺式-环氧类胡萝卜素双

氧合酶); PDS: Phytoene desaturase (八氢番茄红素脱氢酶); PSY:

Phytoene synthase (八氢番茄红素合酶); VDE: Violaxanthin de-

epoxidase (堇菜黄质脱环氧化酶); ZDS: ζ-carotene desaturase (ζ-胡

萝卜素脱氢酶); ZEP: Zeaxanthin epoxidase (玉米黄质环氧化酶)。植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用

朱长甫2　陈　星1　王英典1*

(1北京师范大学生命科学学院，北京100875；2东北师范大学生命科学学院，长春130024)

综　述Review

摘要：近年来类胡萝卜素生物合成基因的分离与功能

鉴定，为应用基因工程技术改变植物体内类胡萝卜素

成份和提高类胡萝卜素含量提供了新的基因资源。有

关类胡萝卜素合成的生物化学及其在体内调控研究的

新进展，使通过遗传操作调控植物体内类胡萝卜素生

物合成途径成为可能。该文综述了类胡萝卜素生物合

成途径及其相关基因的研究现状，并结合作者的工作

介绍了应用转基因技术改变植物体内类胡萝卜素成份

与含量的最新成功的事例。

关键词：类胡萝卜素；类胡萝卜素合成基因；基因工

程；转基因技术

中图分类号：Q74

类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径

合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类萜类色

素物质。所有的光合生物以及许多非光合细菌和

真菌均可在体内合成类胡萝卜素。除极少数非光

合细菌合成的C

30

、C

45

和C

50

类胡萝卜素外，类

胡萝卜素主要是含有40个碳原子的萜类色素。迄

今，在自然界中已发现600多种C

40

类胡萝卜素，

主要作为高等植物、藻类和蓝细菌(cyanobacteria)

光合膜的重要组成份。类胡萝卜素在植物光合作

用中担负着光吸收的辅助色素的重要功能，主要

存在于植物叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色

体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光

合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离

子等自由基方面起着重要的作用(Bartley和Scolnik

1995, Tracewell 等2001)。植物类胡萝卜素生物合

成途径中的堇菜黄质(v i o l a x a nt hi n)和新黄质

(neoxanthin)这两个环氧类胡萝卜素还是植物激素

脱落酸(ABA)生物合成的前体(Olson和Krinsky

1995)。植物类胡萝卜素也是许多花和果实中的主

要色素，用以吸引昆虫、鸟类或其它动物来帮助

授粉和传播种子(Bartley和Scolnik 1995)，对园艺

植物的观赏性和经济价值也起着重要的作用。此

外，β-胡萝卜素和含β-环的胡萝卜素是人类及动

物体内维生素A(retinol)合成的前体(van Vliet等

1996, von Lintig和Wyss 2001)。许多其它非维生

素A类胡萝卜素如叶黄体素(lutein)和玉米黄质

(zeaxanthin)对人体也是非常有益的，它们具有抗

癌和抗心血管疾病等作用(Landrum 和Bone 2001)。

通过对参与类胡萝卜素生物合成基因的遗传操作可

改良植物品质，如提高蔬菜(如番茄)和农作物种

子(如水稻)中的β-胡萝卜素含量或改变植物花的颜

色等。

高等植物类胡萝卜素生物合成途径最早是由

Porter和Lincoln(1950)提出来的。由于类胡萝卜

素生物合成酶主要位于膜上，量少，且在体外不

稳定，类胡萝卜素生物合成酶的纯化颇为困难。

然而，Armstrong等(1989)首次用功能互补法从一

种光合细菌荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中

分离出类胡萝卜素生物合成基因。随后Misawa等

(1990)从噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)中也克

隆到参与类胡萝卜素生物合成酶的基因。这些基因不仅可用于利用异源基因来克隆与高等植物类胡萝卜素生物合成途径中的其它基因，并可通过基因操作，在不具有类胡萝卜素生物合成途径的大肠杆菌中合成这些类胡萝卜素物质。迄今，应用反向遗传学技术(Bird等1991)、转座子标签法(Marin等1996)、异源基因作探针筛选基因组或cDNA文库(Romer等1993，Mann等1994，Ronen 等1999)、图位基因克隆技术(Isaacson等2002，Park等2002)及其利用可合成各种类胡萝卜素的工程大肠杆菌作为酶的底物的“颜色互补”等技术(Cunningham等1996，Moehs等2001)，使得参与类胡萝卜素生物合成的基因都已从高等植物中分离出来。本文结合作者的工作，主要介绍近年来高等植物类胡萝卜素生物合成途径及其调控的分子生物学研究进展，以及利用类胡萝卜素生物合成基因在植物基因工程中所取得的成就和应用的前景。

1 植物类胡萝卜素生物合成途径及其相关的酶与编码基因

高等植物类胡萝卜素主要是在细胞的质体中合成的。在叶绿体中类胡萝卜素主要分布于镶嵌天线色素和光合反应中心复合体的光合膜上，而在成熟果实和花瓣的有色体中则主要积累在膜、油体(oil body)或间质内的其它结构上。类胡萝卜素合成酶类是由细胞核基因编码的，编码翻译成蛋白质后转运至于质体中(Cunningham和Gantt 1998)，从而参与类胡萝卜素的生物合成。

1.1　类胡萝卜素的生物合成

类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，生物合成的前体是含有5个碳的异戊二烯焦磷酸(IPP)。绝大多数类胡萝卜素是由8个IPP 单位聚合而成的含有40个碳的碳氢四萜类(胡萝卜素)及其含氧的衍生物。IPP在IPP异构酶(IPPI)作用下，异构化生成二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。然后在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)催化下，DMAPP与3个IPP分子缩合而生成含有20个碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)(Kuntz等1992，Zhu等2002)。IPPI在植物体内可能是一个限速酶(Kajiwara等1997)。GGPP是类胡萝卜素生物合成的第一前体物质。由GGPP还可合成许多其它类异戊二烯聚合而成的化合物，如赤霉素(GA)、叶绿素中的植醇、生育酚及其它天然化合物(图1，Chappell 1995)。

类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合酶(PSY)催化两个GGPP分子聚合成具40个碳原子的八氢番茄红素(phytoene)。在番茄中有2个PSY基因，其中PSY1基因在果实和花中特异性表达，而P S Y2基因则主要在叶片中表达(Bramley 等1992；Fraser等1994，1999)。在黄花龙胆中至少也有2个PSY基因，PSY1基因在花中特异性表达(Zhu等2002)。在玉米中也有2个PSY基因(Palaisa等2003)。PSY是番茄果实、油菜种子、金盏草和黄花龙胆花等植物中类胡萝卜素生物合成中的一个限速酶(Bra mley等1992，Fraser等1994，Moehs等2001，Shewmaker等1999，Zhu等2002)。因此，PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键调节酶，其编码基因成为应用植物基因工程技术改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。

1.2　番茄红素(lycopene)的生物合成

番茄红素是一种红色的类胡萝卜素，主要存在于番茄果实中，在其它水果和蔬菜中含量则很低。人们曾认为在植物体内由八氢番茄红素合成番茄红素是由八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)所催化的。此外，Isaacson等(2002)和Park等(2002)分别从番茄和拟南芥中分离和鉴定了类胡萝卜素异构酶(CRTISO)基因，并确认了在植物体内由八氢番茄红素转化番茄红素是PDS、ZDS和CRTISO三个酶共同作用的结果。这三个酶的催化产物分别是9,9'-二顺式-ζ-胡萝卜素(9,9'-di-cis-ζ-carotene)、7,9,7',9'-四顺式-番茄红素(7,9,7',9'-tetra-cis-lycopene)和全反式番茄红素(all-trans-lycopene)(Mann等1994，Albrecht等1995，Isaacson等2002， Park等2002，Zhu等2002)。然而，在细菌(如噬夏孢欧文氏菌)中的八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)可催化八氢番茄红素生成全反式番茄红素(Misawa等1990)。因此，在植物基因工程中，可以用一个细菌CrtI基因替代植物中的PDS、ZDS和CRTISO这三个基因，而且由于细菌中的C r t I基因编码的氨基酸序列与高等植物PDS基因编码的氨基酸序列仅有约30％的同源

图1　植物类胡萝卜素生物合成途径

Fig.1　Carotenoid biosynthesis pathway in plants

Summarized by authors basing on Cunningham and Gantt 1998, 2001; Isaacson et al. 2002; Park et al. 2002; Zhu et al. 2002, 2003.

性，所以可减少在转基因植物中经常出现的共抑制(co-suppression)现象。

1.3　胡萝卜素的生物合成

番茄红素环化是植物体内胡萝卜素生物合成途径的一个重要分枝点。植物体中存在番茄红素ε和β-两种环化酶(Cunningham等1996，Pecker等1996，Cunningham 和Gantt 1998， Ronen等1999，Zhu等2003)。番茄红素ε-环化酶(LYCE)只能催化番茄红素的一端形成δ-环，生成δ-胡萝卜素；而番茄红素β-环化酶(LYCB)可使对称性的番茄红素两个末端均形成β-环，生成β-胡萝卜素。δ-环和β-环的差异仅是环己烷环双键位置的不同(图1)。此外，番茄红素还可在LYCE催化下，生成δ-胡萝卜素，继而在LY C B催化下，在其另一个末端形成β-环，生成δ-胡萝卜素。β-胡萝卜素和含β-环的胡萝卜素(如α-胡萝卜素和β-隐黄质)是人类及动物体内维生素A生物合成的前体。在人体和动物体内，β-胡萝卜素中部可裂解生成两个分子的维生素A，而含有一个β-环的α-胡萝卜素和β-隐黄质的裂解只能产生一个分子的维生素A(van Vliet等1996，von Lintig 和Wyss 2001)。此外，在莴苣中还存在一种功能特殊的番茄红素ε-环化酶(Cunningham 和Gantt 2001)。尽管莴苣ε-环化酶的氨基酸序列与拟南芥ε-环化酶的氨基酸序列有77％的同源性，但前者具有催化在对称性的番茄红素两个末端均形成δ-环的功能，而使番茄红素生成具有两个δ-环的ε-胡萝卜素(图1)。拟南芥和莴苣中的LYCE的差异仅仅取决于一个氨基酸残基，从而决定催化番茄红素是合成δ-胡萝卜素还是ε-胡萝卜素(Cunningham和Gantt 2001)。在自然界中仅在莴苣等极少数几种植物中含有两个δ-环的ε-胡萝卜素和莴苣黄素(lactucaxanthin)。

1.4　含氧类胡萝卜素的生物合成

在胡萝卜素分子中引进羟基、酮基、甲氧基和酯键等即将其转化为含氧的衍生物(图1)。α-胡萝卜素在胡萝卜素β-环羟化酶(BCH)和胡萝卜素ε-环羟化酶(ECH)共同作用下生成叶黄体素(Tian等2004)。叶黄体素是植物光合器官内天线色素复合体中的主要类胡萝卜素；而β-胡萝卜素在BCH作用下转变成β-隐黄质β-cryptoxanthin)，进而生成玉米黄质(Bouvier等1998，Sun等1996，Zhu等2003)。玉米黄质在玉米黄质环氧化酶(ZEP)作用下生成花药黄质(antheraxanthin)，进而生成堇菜黄质(Marin等1996，Zhu 等2003)。在植物叶片中还存在与玉米黄质环氧化酶功能正好相反的堇菜黄质脱环氧化酶(VDE)(Bugos和Yamamoto 1996)，它催化堇菜黄质向花药黄质的转化，后者再转化为玉米黄质。玉米黄质、花药黄质和堇菜黄质在ZEP和VDE催化下的相互转化，称为叶黄素循环(xanthophyll cycle)(Yamamoto 1985)。堇菜黄质在新黄质合酶的催化下转化为新黄质(neoxanthin)(Al-Babili等2000，Bouvier等2000)。堇菜黄质和新黄质是植物脱落酸生物合成的前体，它们在9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶(nine-cis-epoxy-carotenoid dioxygenase，NCED，VP14)的催化下，裂解生成一个含有25个碳的化合物和一个含有15个碳的黄素(S c h w a r t z等1997)。黄素(xanthoxin)是ABA生物合成的前体。

1.5　辣椒红素(capsanthin)与辣椒玉红素(capsorubin)的生物合成

辣椒红素和辣椒玉红素是辣椒(C a p s i c u m annuum L.)红色果实中存在的主要色素。在辣椒果实中，存在一种辣椒红素-辣椒玉红素合酶(CCS)(Bouvier等1994，Hugueney等1995)。花药黄质在CCS催化下生成辣椒红素，然后在ZEP 作用下转变为辣椒红素-5，6-环氧化物(capsanthin-5,6-epoxide，图1)。辣椒红素-5，6-环氧化物在CCS催化下，转化为辣椒玉红素，堇菜黄质在CCS催化下也转化为辣椒玉红素。

2　高等植物中类胡萝卜素生物合成调控的分子机制

类胡萝卜素生物合成的调节和植物发育中的质体转化受环境因子的影响。类胡萝卜素作为光合作用的辅助色素以及保护叶绿素免受强光破坏的物质，广泛存在于绿色光合组织中。迄今，人们对叶片中的类胡萝卜素生物合成的调控机制还了解甚少(Simkin等2003)。研究表明，玉米白化体(etioplasts)内的类胡萝卜素含量明显比叶绿体的低。白化体在光诱导下转化为叶绿体的过程中，类胡萝卜素和叶绿素同时被诱导合成，但当类胡萝卜素代谢途径被抑制时，光照下的白化幼苗叶

片中积累八氢番茄红素，表明光调控的步骤是位于八氢番茄红素的生物合成途径中。研究证明光照只诱导玉米叶片黄化质体内IPPI的活性，而对其GGP S和PS Y的活性则无影响(Albr echt和Sandmann 1994)。此外，在番茄幼苗的脱黄化过程中，类胡萝卜素含量增加了许多倍，但PSY和PDS的活性未发生改变(Giuliano等1993)。因此推测，IPPI是玉米和番茄白化体内类胡萝卜素合成的限速酶。在发育的白芥幼苗中，光通过光敏色素的调节诱导了PSY基因的mRNA增加，而GGPS 和PDS基因的mRNA却保持恒定(von Lintig 等1997)。光照强度对叶黄素循环有很大影响，在弱光条件下，ZE P催化玉米黄质转化为花药黄质，进而生成堇菜黄质；而在强光条件下，VDE 催化堇菜黄质转化为花药黄质，进而生成玉米黄质。玉米黄质起着清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基的重要作用，从而保护光合器官免受强光的破坏(Demmig-Adams 等1996)。

植物花和果实中的类胡萝卜素合成调控机制明显不同于绿色光合组织。叶片光合组织中的类胡萝卜素合成主要受光等环境因子的影响，而花和果实中类胡萝卜素的合成则主要受花和果实发育因子的调控。由于番茄果实具有明显的颜色变化以及有大量的颜色突变体可供研究，对番茄果实中类胡萝卜素的生物合成及其调控研究取得了很大进展。未成熟的绿色番茄果实中的类胡萝卜素成份与绿色叶片中的相似，主要为大量的叶黄体素、胡萝卜素和堇菜黄质。在番茄果实成熟过程中，叶绿体转化为有色体，类胡萝卜素含量上升10至15倍，这主要是由于番茄红素含量增加300多倍的结果(Fraser等1994)。用番茄PSY、PDS、LYCB和LYCE的cDNA作探针，检测其果实发育过程中这些基因在转录水平的变化。结果表明，在果实进入番茄红素积累的转色期后，PSY 基因的mRNA增加10至20倍，PDS基因的 mRNA 则增加近3倍，而LYCB和LYCE基因的mRNA 却明显下降直到消失(Giuliano等1993，Pecker等1996，Ronen等1999)。这些结果证明，番茄果实中的番茄红素积累显然是由于转色期后合成番茄红素上游的PSY和PDS基因表达增强以及转化番茄红素生成胡萝卜素的LYCB和LYCE基因表达减弱的结果。在番茄Delta突变体中，LYCE基因转录水平的提高，导致果实积累大量的δ-胡萝卜素(Ronen等1999)，而在番茄Beta突变体中，由于其果实中有色体特异性LY CB基因的大量表达，使其果实积累大量的β-胡萝卜素(Ronen等2000)，从而进一步证实了番茄果实中类胡萝卜素的积累主要是相关基因在转录水平上差异表达的结果。柑橘果实成熟过程中的情况也相同(Kato等2004)。此外，研究结果证实了番茄、金盏草和黄花龙胆花中类胡萝卜素的积累也是在转录水平受到调控的。番茄花瓣中积累大量的堇菜黄质，在番茄花发育过程中，花瓣中PSY和PDS基因的mRNA增加10倍(Giuliano等1993，Fraser等1994)，LYCB基因的 mRNA也大量增加，而LYCE的 mRNA则几乎检测不到(Pecker等1996，Ronen等 1999)。金盏草花瓣中类胡萝卜素合成基因转录水平差异或mRNA稳定性决定了不同金盏草品种中类胡萝卜素含量的差异(Moehs等2001)。在黄花龙胆花发育过程中，花瓣中的叶绿体转化为有色体，叶绿素含量迅速降低，类胡萝卜素总量逐渐增加，其中由α-胡萝卜素代谢生成的叶黄体素占类胡萝卜素总量的比例逐渐降低，而由β-胡萝卜素代谢生成的玉米黄质和新黄质占类胡萝卜素总量的比例逐渐增加。我们用克隆到的黄花龙胆类胡萝卜素合成基因作探针检测花瓣发育过程中的mRN A变化，结果表明PS Y、PD S、ZD S、LYCB、BCH和ZEP基因的mRNA量逐渐增加，而LYCE基因的mRNA量逐渐减少(Zhu等2002，2003)。可见，黄花龙胆花瓣中类胡萝卜素含量的积累是由PSY、PDS、ZDS、LYCB、BCH 和ZEP等基因大量表达的结果。LYCE和LYCB 基因表达的相对强弱，决定了由α-胡萝卜素代谢生成叶黄体素和由β-胡萝卜素代谢生成玉米黄质和新黄质在类胡萝卜素总量中的比例(Z h u等2002，2003)。为了进一步阐明由有色体发育诱导的龙胆PSY、PDS、ZDS、LYCB、BCH和ZEP等基因表达的分子调控机制，我们从龙胆基因组DNA中克隆到ZDS和ZEP两基因的启动子，并构建ZDS和ZEP两基因的启动子全长与GUS融合基因的载体，应用农杆菌介导转入番茄，通过GUS组织化学和活性分析技术对转基因番茄进行检测，从而证明了在叶片和含有大量叶绿体的未

成熟绿色番茄果实中，ZDS和ZEP两基因的启动子驱动的GUS基因几乎不表达；伴随番茄果实的发育，果实中的叶绿体逐渐转化发育成有色体，则ZDS和ZEP两基因启动子驱动的GUS基因表达量逐渐增加, 并在成熟番茄果实中的有色体和花中表达量最大，即ZDS和ZEP两基因的启动子表达与有色体的发育相关, 而且ZDS和ZEP两基因的表达是在转录水平受调控的。

3　类胡萝卜素生物合成相关基因在植物基因工程中的应用

胡萝卜素转化而成的维生素A是人体和动物体内必不可少的营养物质。一些类胡萝卜素(如番茄红素)在人体内还具有抗氧化的功能。在工业上，类胡萝卜素可用于食品的颜色添加剂以及水产养殖的鱼(如鳟鱼)的食饵添加剂，以增强鱼和鱼卵的颜色，也可用于化妆品和药物的生产。在自然界中，类胡萝卜素使植物的果实(如番茄)、根(如胡萝卜)、叶和花呈现多彩的颜色，使之具有较大的经济价值。近年来，应用类胡萝卜素合成相关基因的转基因植物研究取得了很大的进展。在油菜和番茄等许多植物中，催化类胡萝卜素代谢途径第一步反应的八氢番茄红素合酶(PSY)被证实是这一代谢途径的关键调节酶，而由GGPP生成八氢番茄红素这一步骤已成为类胡萝卜素代谢途径的“瓶颈”。因此，P S Y基因现已成为植物类胡萝卜素遗传工程中的首选目的基因。在转基因番茄中，番茄PSY的cDNA组成型过量表达，导致植株矮化(Fray等1995)。这是由于合成赤霉素(GA)的GGPP大量转向合成类胡萝卜素，而使GA合成减少的缘故。与野生型番茄相比，这些转PSY基因的番茄植株在种皮、子叶和胚轴中积累了较多的类胡萝卜素。将噬夏孢欧文氏菌的八氢番茄红素合酶(CrtB)基因在番茄果实特异性启动子驱动下导入番茄，转基因番茄植株中的类胡萝卜素含量较野生型番茄增加2至4倍(Fr a ser等2002)。将CrtB基因在油菜种子中特异性过量表达，转基因油菜种子中的类胡萝卜素含量较野生型油菜增加了50倍，而种子中的叶绿素和α-生育酚含量明显降低(Shewmaker等1999)。但当将水仙PSY基因在水稻种子胚乳中过量表达时，仅积累八氢番茄红素(Burkhardt等1997)。这可能是由于水稻种子胚乳中生成类胡萝卜素的代谢途径是被钝化了的，而油菜种子中的类胡萝卜素生物合成代谢途径则是被活化了的。CrtB基因在油菜种子中过量表达克服了此代谢途径的“瓶颈”，使转CrtB基因的油菜种子中生成大量的α-和β-胡萝卜素，同时使将α-和β-胡萝卜素转化为含氧类胡萝卜素的胡萝卜素羟化酶来不及将其转化，从而在转基因油菜种子中积累了大量的α-和β-胡萝卜素。如将噬夏孢欧文氏菌八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)基因在组成型表达启动子驱动下在番茄中过量表达，番茄果实中类胡萝卜素总量减少一半，但β-胡萝卜素含量增加3倍 (Romer等2000)，这是由于转基因番茄果实中的PDS、ZDS和LYCB 基因被诱导表达的结果。将拟南芥LYCB基因在番茄果实中特异性过量表达，番茄果实中β-胡萝卜素含量增加7倍，而类胡萝卜素总量未发生改变或仅略有提高 (Rosati等2000)。

提高水稻种子胚乳中的β-胡萝卜素含量，可大大减轻主要以水稻为主食的亚洲、非洲和南美州人维生素A摄取的不足。水稻种子胚乳可合成GGPP，但不能合成类胡萝卜素。因此，常规育种技术不可能育成在水稻种子胚乳中具有类胡萝卜素的水稻品种。然而，近年通过类胡萝卜素基因工程提高水稻种子中β-胡萝卜素含量的研究取得了突破性的进展(Ye等2000)。在转基因水稻的胚乳中，最大积累量达1.6 μg类胡萝卜素每克种子干重(Ye等2000)。然而转基因水稻种子胚乳中的类胡萝卜素含量仅是转基因油菜种子中类胡萝卜素含量的1％~2％(Shewmaker等1999)，可见提高转基因水稻种子中的类胡萝卜素含量有更大的潜力。

玉米黄质是人类食物中含量很低、但非常重要的食用类胡萝卜素，它是人视网膜黄斑中的主要色素，具有清除单线态氧和防止老年性弱视等功能。最近，应用基因工程技术提高番茄果实和马铃薯块茎中玉米黄质含量的尝试获得了成功(Dharmapuri等2002，Romer等2002)。番茄果实中含有大量的番茄红素，Dharmapuri 等(2002)为提高番茄果实中的玉米黄质含量，在番茄果实特异性启动子驱动下的番茄LYCB和辣椒BCH基因被导入番茄，使转基因番茄果实中玉米黄质和β-隐黄质含量增加100多倍，β-胡萝卜素含量和总

的类胡萝卜素含量均增加近10倍，番茄红素含量则减少一半。马铃薯块茎中含有堇菜黄质，Romer 等(2002)通过反义RNA等技术使内源ZEP 基因沉默，导致转基因马铃薯块茎中的玉米黄质含量提高了130多倍，而堇菜黄质含量明显降低，总的类胡萝卜素含量提高了近6倍。玉米黄质通过清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基，在保护光合器官免受强光破坏方面起重要的作用。Davison 等(2002)使拟南芥BCH基因在转拟南芥植株中组成型过量表达，导致叶黄素循环中的玉米黄质含量增加了2倍，从而提高了转基因拟南芥植株对强光和高温胁迫的耐受性。因此，通过BCH的基因工程提高农作物对强光和高温胁迫的耐受性，有望使胁迫条件下的农作物增产。

脱落酸是一种重要的植物激素，它对植物的生长发育过程包括胚胎形成、种子成熟和萌发、气孔开闭及植物对逆境的响应具有重要的调控作用，在农业生产与细胞工程中有很大的应用价值。脱落酸生物合成途径的第一步特异性反应是玉米黄质在ZEP催化下经两步环氧化反应转化为堇菜黄质(图1)。由于类胡萝卜素在光合器官中大量存在，使得由八氢番茄红素生成玉米黄质、花药黄质、堇菜黄质和新黄质这些步骤不是光合器官中ABA生物合成的限速步骤。然而在非光合组织和器官中，ZEP在ABA的生物合成中则起着非常重要的作用。在35S启动子驱动下的烟草ZEP 基因在烟草中过量表达时，转ZEP基因的烟草种子中ABA含量明显增加，种子萌发延迟；反之，如果反义ZEP基因在烟草中过量表达时，种子中的ABA含量减少，种子萌发提早(Frey等1999)。因此，植物种子的休眠特性可通过ZEP基因的遗传操作来改变，这可广泛地应用于粮食贮藏和种子保存中休眠期的调控。

蓝细菌(集胞藻，Synechocystis sp. PCC6803)的β-胡萝卜素酮醇酶基因在蓝细菌和积累β-胡萝卜素的工程大肠杆菌中可催化β-胡萝卜素生成红色的海胆紫酮(echinenone)(Fernandez-Gonzalet等1997)。我们将蓝细菌β-胡萝卜素酮醇酶基因在35S启动子驱动下导入烟草，结果使烟草花的蜜腺中有色体β-胡萝卜素大部分转化为海胆紫酮，积累的海胆紫酮使花的蜜腺由黄色变为红色，但是在含有叶绿体的叶片和含有花青素的花瓣中仅积累了极其微量的海胆紫酮(Zhu 和Sandmann，未发表数据)。在野生型烟草中，粉红色的花瓣中含有大量花青素，而类胡萝卜素含量甚微，因此在花瓣中表达β-胡萝卜素酮醇酶基因仅生成极其微量的海胆紫酮。但是，烟草叶片含有大量的β-胡萝卜素等类胡萝卜素，在β-胡萝卜素酮醇酶基因大量表达的烟草叶片中却也是仅合成极其微量的海胆紫酮。目前，正在对这一调控机制作进一步的解析。由上述可见，通过基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径，完全有可能在主要农作物(如玉米、小麦和大豆)以及牧草和蔬菜生产中，改善类胡萝卜素的含量和通过改变类胡萝卜素的含量与种类而改造花卉的颜色。

4　展望

植物类胡萝卜素生物合成途径中几乎所有的基因均已被分离和鉴定，并且植物类胡萝卜素基因工程也取得了可喜的进展。然而，目前人们对植物体内类胡萝卜素生物合成的调控机制以及类胡萝卜素生物合成基因的表达调控机制还不甚清楚。因此，在应用遗传工程技术提高植物靶器官中某一特定类胡萝卜素含量时，存在很大的盲目性。如前所述，水仙PSY和细菌CrtI基因在水稻胚乳中过量表达，由于诱导了水稻胚乳中的LYCB、LYCE、BCH和ECH活性，使得胚乳中积累的不是番茄红素，而是β-胡萝卜素、叶黄体素和玉米黄质(Ye等2000)。那么究竟什么原因诱导了转基因水稻胚乳中的番茄红素环化酶和胡萝卜素羟化酶的活性目前尚不清楚。为了增加番茄果实中的番茄红素，在转化了细菌CrtI基因的番茄中因诱导了转基因番茄果实中的PDS、ZDS和LYCB基因的表达，结果果实中β-胡萝卜素含量增加了3倍(Romer等2000)。可见，为了减少类胡萝卜素基因工程中的盲目性，对植物体内类胡萝卜素合成相关基因表达调控机制的阐明是非常重要和迫切的。此外，在应用基因工程技术操纵类胡萝卜素生物合成途径时，组织或器官特异性表达启动子的选择是关键。同时，由于类胡萝卜素是在质体中合成的，如何增加靶器官或组织中的质体数量和(或)大小，以及对植物体内类胡萝卜素合成基因的顺式作用元件(如启动子和增强子等)和反式作

用元件的研究也非常重要。相信在不久的将来，将会有越来越多令人振奋的类胡萝卜素含量高的转基因植物问世。

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Abstract: In recent years, the cloning and char-acterization of carotenogenic genes has provided new gene resources and molecular tools, which can be utilized to genetically alter carotenoid composition and enrich the carotenoid content in vivo by gene engineering technique for plants.Increasing evidences in the studies of biochem-istry of carotenogenesis and its regulation in vivo make the genetically manipulating carotenoid biosynthesis pathway to be possible in plants. In this review, the carotenoid biosynthesis pathways

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Carotenoid Biosynthesis in Plants and Application of Its Relative Genes in Gene Engineering

ZHU Chang-Fu 2, CHEN Xing 1, W ANG Ying-Dian 1*

(1College of Life Sciences, Beijing Normal University , Beijing 100875, China; 2College of Life Sciences, Northeast Normal University , Changchun 130024, China)

and the some genes involved in this pathway in plants are summarized, and some progresses in-cluding author’s work in the successful manipu-lation of carotenoid composition and content in plants using gene-transfer technology are also covered.

Key words: carotenoid; carotenogenic gene; gene engineering;gene-transfer technology

*Corresponding author (E-mail: ydwang@https://www.wendangku.net/doc/188427154.html,).