高效液相色谱(HPLC)

高效液相色谱（HPLC）操作规程

一操作

1.准备工作

⑴流动相的准备

应根据实验选择合适的流动相，所有流动相原则上应选择HPLC级别，水应选择超纯水，并应保持新鲜。

所有流动相在进行实验前应经过相应的脱气处理，脱气时间应根据流动相的量相应增加，但一般超声脱气不应少于20min。

在实验过程中应保证足够的流动相，流动相的量与流速、洗脱时间等有关，应根据具体情况进行准备。

⑵样品的准备

对于待测的样品，在进样之前应经过滤膜过滤，根据样品的不同选择不同种类、不同直径的滤膜。

2. 排气

打开purge阀，键入stop→prime，直到无气泡停止stop。

B泵同样操作。

关闭purge阀。

3. 开机

打开电脑主机和显示器，点击Galaxie，进入工作站。选择系统，点击Agilent HPLC.

点击overview，可观察仪器各部分状态。

打开泵及检测器的电源。

二 分析方法建立

1.进入工作站系统界面。

点击数据，文件→新建→方法，出现视窗，点击前进即可。

键入方法名和相应描述→点击ok后出现方法文档。

2.210的设定

点击控制→210图标→Elution。

选择流动相A和B的种类。

Compressibility、Pressure Constant以及Refill Time属于内置参数无需设定。

设置A、B流动相的比例，通过改变B的比例设定。

如需梯度洗脱，则根据方法对Equilibrium Time 和Hold Time进行设定。

点击Misscellaneous。

Start Mode选择Inject Trigger on Pump A。

End of Sequence 选择Leave Pump on。

210设定结束。

3.325的设定

点击325图标，选择Signal。

其中Detector Bunch Rate建议设置成2（10Hz），Noise Monitor Length建议设定成64，Response Time建议设定0.5。

根据方法设定相应波长。

其余三项包括Peak Sensor、Relay、Misscellaneous不需设定。

325设定结束。

此时方法已经建立，选择文件，保存方法即可。

三 样品分析

1.进样前准备

点击系统→Agilent HPLC，将仪器开启并连接。

点击Acquisition→Monitoring Baseline。选择分析方法。此时210和325就会按方法设定的参数达到初始值。

观察运行情况，当210压力不再变化，325设定值稳定，即可终止Monitoring Baseline。

2.进样

点击进样图标，选择相应分析方法。

用微量进样器吸取一定量的样品，样品的量原则上应至少为定量环的3倍体积，且应保证无气泡。

取下进样口的塞子，将手柄位置由Inject转到Load位置，进样，进样后将手柄位置转回Inject位置。

四 关机

1.冲洗色谱柱

首先确认分析过程已经结束

选择系统→overview，改变A、B流动相的比例，通过设定B而改A，流速根据冲洗要求设定。

2.关机

当冲洗色谱柱过程结束后，关闭325的电源。

退出色谱工作站，关闭电脑。

关闭检测器和泵的电源。

五 注意事项

1.整个运行过程中要确保无气体进入HPLC。

2.要确保足够的流动相，过滤头应置于液面以下。

3.进样前应确保purge阀关闭。