(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计：
1、NCBI上下载基因序列
2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）
3、从起始密码（ATG）下游25bp开始；
4、GC含量介于40%~60%
5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区
6、选择脱靶率低的
（二）、干扰载体构建
1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）
退火体系：
上游：5ul
下游：5ul
10X M buffer 5ul
H2O 35ul
水浴锅100℃2min，锅里隔夜
（三）、酶切plko.1载体
1、AgeI 酶切，反应体系：
plko.1载体4ug
AgeI 2ul
10X AgeI buffer 5ul
H2O 39ul
37℃水浴2~3h
2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱
3、EcoRI酶切，反应体系：
AgeI 酶切产物30ul
EcoRI 2ul
10X H buffer 5ul
H2O 13ul
37℃水浴2~3h
切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度
（四）、连接
连接体系：T4连接：
退火引物2ul 退火引物5ul
酶切载体1ul 酶切载体1ul
Solution I 5ul T4连接酶1ul
H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul
H2O 2ul
室温下连接4h。
（五）、转化
-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。
（六）、挑菌
用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。
（七）、提质粒
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
1、取5ml菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清
2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬
3、加入500 ul P2 ，温和翻转6~8 次，充分裂解（不超过5 min，一般3min）
4、加入700 ul P3 ，温和翻转6~8 次，出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min
5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，
1min ，弃废液
6、CP4柱中加入500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液
7、CP4柱中加入600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液
8、空离12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）
9、CP4柱置于1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置2 min ，12000rpm ，1 min。
（八）、测质粒浓度
打开软件，ddH2O 清洗仪器3~5次，点击black ，F1，结果不大于0.2
每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于500，OD值1.88~1.90
质粒置于-20 ℃，保存
（九）、细胞复苏
1、37℃预热PBS，取8ml PBS 于10 ml 离心管中
2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化
3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，
4、细胞重悬液加到含8ml 培养基的培养皿中，37℃，5% CO2 ,培养
（十）、细胞分盘
1、吸去培养液，加入PBS 清洗
2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min
3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，
室温，5 min
4、加入1ml培养液重悬，按1；3 分盘
（十一）、转染
1、PLP1 625 ng/孔
PLP2 625 ng/孔
2ml 离心管PLP/VSVG 625 ng/孔混匀
目的质粒625 ng/孔
Opti 培养基500ul/孔
2、脂质体6ul/孔
2ml 离心管请轻混匀，室温下孵育，5 min
Opti 培养基500ul/孔
将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min
3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入3 ml PBS 清洗，加1ml 胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750 rpm，室温，5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬
4、在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5% CO2 ,
培养，6~8h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天
（十二）、收病毒
培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养基，用0,45um 滤膜过滤到1.5ml 离心管，每管1 ml。最后向培养皿中再加3ml转染培养基，，继需培养，第二次收病毒。
（十三）、病毒转染细胞
1、取培养的目的细胞，吸去培养液，加入1ml 含4 ug/ml polybrene 的慢病毒培养基，再加入1 ml 病毒液，混匀，37℃，5% CO2，培养48h
2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，
3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞
4、收细胞
（十四）、收细胞（用于提蛋白，提RNA）
1、吸去培养液，加入PBS 清洗
2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min
3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，
4℃，5 min
4、弃上清，加1ml PBS，重悬，转移到1.5ml 离心管1000 rpm ，4℃，5 min
5、弃上清，立刻放入液氮中保存。
（十五）、冻存细胞
1、准备冻存液
2、吸去培养液，加入PBS 清洗
3、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min
4、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，
4℃，5 min
5、弃上清，加入1 ml 冻存液重悬，转移到冻存管。
（十六）、提蛋白
1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解30
min
2、13000 rpm ，4℃，10min ，弃沉淀
3、配制蛋白标准液，稀释至0.5 mg / ml ，配制BCA 试剂（A液：B液= 50:1）
4、标准液体积按0；1；2；4；8；12；16；20 加入96 孔板，补PBS 至20ul
5、96孔板加1 ul 蛋白样品，PBS 补足20 ul ，每个重复3次
6、每孔加入200ul BCA ，37℃，30 min
7、酶标仪560 nm 测吸光值
8、将蛋白样品稀释，加入loding buffer，4℃，瞬时离心，100℃煮10 min，13000 rpm，30 s
（十七）、WB
1. 清洗玻璃板
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。
（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。），倒入电泳buffer，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。点样，marker，10 ul （上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）
（5）将其放入电泳槽中。
3. 电泳
电泳时间一般100 V，90 min 。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4、转膜
1. 剪取一张5.5 X 8.5 的PVDF 膜。将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到去离子水中清洗。最后在
转膜buffer 中清洗。
2. 在加有转膜buffer的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。
3. 在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜buffer，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 将膜铺于滤纸上；
5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。
6. 将转膜槽放入转膜仪。25 V，30min。
5、封闭
1、转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2 h。
2、封闭后，1 x TBST 清洗3次，加入一抗，4℃，过夜；
3、回收一抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min；
4、加入二抗，室温1 h
5、弃二抗，1 x TBST 清洗3次，每次10 min。
6、显色曝光
将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光
（十八）、提RNA
1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入500 裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解
30 min
2、13000 rpm ，4℃，5 min ，弃沉淀
3、加入适量（350ul ~450ul）的RTL lysis Buffer 至离心管，重悬
4、加入等体积RNA Binding Buffer 至离心管，混匀
5、把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管，转移小于700ul 混合液，12000rpm，30s
6、弃滤液，继续转移
7、加500 ul Buffer RW1 ,12000rpm，30 s
8、弃滤液，加入650 ul Buffer RW2，12000rpm，30 s
9、弃滤液，空离
10、柱子转移至1.5ml 离心管，加入30~100 ul RNase Free Water 至膜中央，静止1 min，12000rpm，1 min
（十九）、PCR 合成cDNA
解链反应体系：
总RNA 1~2 ul
引物 1 ul
Oligo（dT） 1 ul
无RNA酶水补足8 ul
70 ℃水浴5 min；冰上5 min
逆转录体系：
5 X M-MLV buffer 5 ul
dNTP 2ul
RNase 抑制剂 1 ul
M-MLV 1 ul
无RNA酶水8 ul
总体积25 ul
42℃，90 min ；70℃，10 min PCR，-20 ℃保存
（二十）、RT-PCR
利用持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH 作为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法检查基因的表达水品。
1、根据基因和GAPDH 的基因序列设计引物，
2、反应体系：
Mix 10 ul
上游引物0.5 ul
下游引物0.5 ul
水7 ul
模板 2 ul
每个样品设计3个重复，反应条件：95℃变性；60℃退火，设置45个循环。Tm设为95℃
（二十一）、soft agar
底层胶制备：
1、2XDMEM 培养基预热；1.2% 的Agar 溶液预热；两者混合
2、加到6孔板中。每孔1ml ，2个重复，3个对照；加入时避免产生气泡，静置20 min，凝固
上层胶的制备
1、吸去培养液，加入PBS 清洗
2、吸去PBS ，加入1ml 胰酶，37℃培养箱消化1min
3、用巴氏吸管加入2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，
室温，5 min
4、加入1ml培养液重悬
5、细胞计数，并稀释至适当浓度
6、取1.5 ml 2 X DMEM 与1.5 ml 的0.6%Agar 溶液混合，再与合适量的的细胞悬液混合（每孔加入2000个细胞），每孔加入1.5 ml 底层胶。避免产生气泡，静置，凝固
7、置于37℃，5% CO2，培养15~20天。
（二十二）、BrdU
1、取对数生长期细胞，在24孔板上进行细胞爬片（每孔2万细胞），置于37℃，5% CO2培养过夜
2、每孔添加500ul BrdU 溶液（每毫升培养基10ulBrdu），37℃，5% CO2培养，30 min
3、弃培养液，加入200 ul/孔4% 多聚甲醛，室温，30 min
4、弃多聚甲醛，PBS 摇床清洗3次，每孔500 ul ，每次5min
5、加入500 ul 0.1% Triton-100 ，室温，10 min
6、PBS 摇床清洗3次，每孔500 ul ，每次5min
7、加入500 ul/ 孔盐酸溶液，37℃，10 min
8、PBS 摇床清洗3次，每孔500 ul ，每次5min
9、加入500 ul/孔10% 山羊血清，37 ℃，封闭30min
10、加入BrdU 一抗，500ul/孔，4℃，过夜
11、室温复温45 min
12、PBS 摇床清洗3次，每孔500 ul ，每次5min
13、加入荧光二抗，500ul/孔，室温，120 min
14、加入DAPI ，50 ul/孔，室温，避光，30 min
15、PBS 摇床清洗3次，每孔500 ul ，每次5min
16、取出玻片，滴加抗荧光淬灭剂，封片
（二十三）、MTT(一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成蓝色的formazan结晶，生成量仅与和细胞数目成正比，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，无法形成结晶，该结晶溶解于DMSO。490nm处测OD值
1、取对数期细胞，计数，稀释
2、取96孔板，每孔加30000个细胞，重复4个复孔，置于37℃，5% CO2培养
3、选择对应时间点的细胞，每孔加入20ul的MTT溶液，置于37℃，5% CO2培养4
4、取出细胞板，吸去液体，每孔加入200ulDMSO溶液，置于摇床上，10min
5、490nm测吸光值
（二十四）、GST pull-down（通过已经标记的GST标签蛋白，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，用以确定已知蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，GST 标签的A 蛋白（GST-A）与另一标签的B 蛋
白）
GST-A蛋白的beads制备
1.把GST-A（pGEX 载体）质粒转化到感受态细胞BL21（DE3）中。转化：冰上放置30 min，42℃热激45s，冰上放置2 min。
2.加入适量LB 无Kana 液体培养基摇菌1 h，37 ℃，220 rpm/min。
3.把菌液转移到摇菌管中，5 ml LB+Kana，37 ℃，220 rpm/min 小摇过夜。
4.把5 ml 小摇过夜的菌液转移到150 ml LB+Kana 培养基中，继续37 ℃，220 rpm/min 摇菌4～5 h。
5.加入IPTG 使其终浓度为0.5 mM，低温诱导4～5 h（一般设置为22 ℃）。
6. 5 000 rpm/min，离心10 min 收菌体沉淀-80 ℃保存。
7.用10 ml GST Extraction buffer 重悬菌体沉淀，涡旋震荡混匀（具体用多少重悬视菌体沉淀量而定）。
8.超声处理样品。（注意：一定要在冰上进行，此步非常重要。超声探头使用前请用酒精擦洗并用ddH2O 擦洗。探头放在液面中间，不碰壁，不触底。仪器设置为5 s 工作，15 s 休息，防止产热过量）。
9.15 000 rpm/min，4 ℃，离心30 min。
10.每个样品100ul Glutathione Sepharose（GST beads，用量自定），冰PBS 洗2 遍，GST Extraction buffer 洗一遍，每次500 g/min，离心5 min，4 ℃。
11.转移离心后的菌液上清到Glutathione Sepharose 中，4℃转动孵育1 h。
12.500 g/min，5 min，4 ℃，去上清。用GST WashⅠ洗3 遍（至少用5 倍beads 体积的溶液去洗。每次500 g/min，4 ℃离心5 min）。
13.用GST Extraction buffer 洗5 遍（至少用5 倍beads 体积的溶液去洗。每次500 g/min，4 ℃离心5 min）。
14.用GST Wash Ⅱ洗2 遍（至少用5 倍beads 体积的溶液去洗。每次500 g/min，4 ℃离心5 min）。
15.纯化好的带有GST-A蛋白的GST beads 保存在GST Wash Ⅱ中，4 ℃保存（这是由GST beads 特性决定的，请尽早使用）。
His-B 蛋白的纯化
16.菌体沉淀制备过程类似于GST-A，8 000 rpm/min，离心2 min 收沉淀。具体纯化过程因为篇幅所限就不在此讲述了。
17.当然，也可以用细胞裂解液来做pull-down，那么这就不能算是纯粹的体外验证蛋白与蛋白相互作用的实验了，再此不多做讲述。
GST pull-down
1. 纯化好的GAT-A beads 在使用前用冰PBS 洗3 遍，每遍500 g/min，4 ℃离心5 min。
2. 加入适量的His-B 纯化蛋白（作者君认为10ug 的量做pull-down 已经足够了），binding buffer 是PBS。
3. 4 ℃转动孵育1 h。
4. 洗去非特异性结合：作者君一般是用GST Wash Ⅱbuffer 洗5～10 遍，具体次数看两者的结合强弱，需要自己摸索。（当然有protocol 介绍是用PBS 去洗，每次离心之前在4 ℃转动孵育5～10 min，这样清洗效果相对较弱，具体怎么洗看自己喽）。
5. 清洗结束后就可以加loading 去煮蛋白跑WB 了。
不过如果你需要跑出来更漂亮的WB 条带，可以把pull-down 后的样品用GST 洗脱液（购自生工，觉得买一瓶后用一辈子也用不完）把蛋白洗脱下来：在pull-down 样品中加入100 ul GST 洗脱液（用量自定），4 ℃转动孵育30 min，500 g/min，4 ℃离心5 min，上清就是您想要的pull-down 样品。
（二十五）石蜡切片免疫组化实验
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。
实验方法原理根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
实验步骤
一、组织块包埋
1、固定: 10% 甲醛24h 4℃
2、PBS清洗10min/次6次或更多
3、自动脱水机脱水浸蜡
4、包埋（包埋机提前30min预开启）
5、修整、切片（4~7um）
6、贴片水温45℃~46℃
7、脱蜡：切片置于67℃烘箱中，烘片2小时。
8、洗片：①二甲苯8~10 min
②二甲苯8~10 min
③1/2二甲苯8~10 min
④无水乙醇5min
⑤无水乙醇5min
⑥95%乙醇5min
⑦93%乙醇5min
⑧85%乙醇5min
⑨75%乙醇5min
9、苏木素染色，自来水冲洗
10、1%HCl分化，自来水冲洗，氨水返蓝，1~2min
11、伊红染色
12、自来水冲洗
13、①75%乙醇2min 二甲苯8~10 min
②85%乙醇2min 二甲苯8~10 min
③95%乙醇2min 1/2二甲苯8~10 min
④95%乙醇2min 无水乙醇5min
⑤无水乙醇5min
14、二甲苯透明，2X5min
15、中性树胶封固，晾干后观察。
（二十六）染色质免疫沉淀技术（CHIP）
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA 序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
步骤：1）甲醛处理细胞
2）收集细胞，超声破碎
3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合
4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀
5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合
6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物
7）解交联，纯化富集的DNA-片断
8）PCR或基因芯片分析。
实验案例：证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合
实验对照：设定的对照有
1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）
2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）
3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）
EZ-ChIP?染色质免疫共沉淀实验流程（Upstste Catalog # 17-371)
1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体
2、试剂盒组分：
A. Provided Kit Components
Store at 4℃:
ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 ml
ChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 ml
Low Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml
High Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml
LiCl Immune Complex Wash Buffer 24 ml
TE Buffer 24 ml
0.5 M EDTA 250 ul
5 M NaCl 500 ul
SDS Lysis Buffer 10 ml
1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul
10X Glycine 11 ml
10X PBS 24 ml
Store at -20℃：
Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂）2×110 ul
RNase A 600 ug of RNase A in60 ul sterile water.
Proteinase K 600 ug of ProteinaseK in 60 ul
1M NaHCO3 600 ul
Anti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.
Normal rat IgG
Store at Room Temperature:
20% SDS 242 ul of 20% SDS.
Spin Filters One bag containing 22 Spin Filterswith Collection Tubes
Collection Tubes 22 Collection Tubes.
Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.
Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.
Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.
4、CHIP 操作流程
A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解
预先准备：
1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；
2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；
3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；
4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
正式步骤：
1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；
2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；
3) 尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；
4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿，去掉PBS，重复洗涤1次；
5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS，每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II；
6) 每培养皿加入2 ml PBS，刮取细胞至锥形管；
7) 4℃离心700rpm，时间5min以沉淀细胞，去掉上清；
8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer；
9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞；
10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。
B. 超声处理裂解DNA
1) 管子置于碎冰上，超声处理以打碎DNA，超声发热会部分降解染色质，注意在冰上操作，普通贴壁细胞约
1x 10-7个细胞/ml需要10次，每次4-5秒的超声处理；超声仪基本要求：50-100WW功率，1-2mm探头。
2) 4℃离心12000rpm，时间10min，移除沉淀，留下上清。
3) 上清转移至干净的微量离心管，每管约50-100ul；
C. 免疫共沉淀蛋白质/DNA
准备稀释液（Dilution Buffer,，含蛋白酶抑制剂）置于冰上备用，按照1块胶计算（9个样本）：900ul稀释液中加入4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II。
注：IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II)和阴性对照(Normal IgG)，阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致
D. 蛋白/DNA-复合物洗脱
预先准备：将1M的NaHCO3恢复至室温，使沉淀溶解。,
1) 准备Elution Buffer以备IP管和input对照管使用“见C（5）”，每管按照如下准备200ulelution buffer：10 ul 20% SDS，20ul 1 M NaHCO3和170 ul sterile, distilled water。
2) C（5）input对照管加入200 ul Elution Buffer放置于室温备用，步骤E备用；
3) C（10）完成后，每管（IP管）加入100ul Elution Buffer，混匀于室温孵育15min；
4) 3000rpm离心1min以沉淀Pellet agarose，收集上清至新离心管；
5) 重复4-5步骤，最终收集上清约200ul。
E. 逆转蛋白/DNA交联（留取目的DNA片段）
F. 目的DNA的纯化
取出Spin Filter-Collection Tube（自旋过滤器/收集管）和单独的收集管Collection Tube备用；
弃去Spin Filter，收集管Collection Tube里面的洗出液即为纯化的DNA，可以进行下一步实验操作或冻存于-20℃.
G. PCR of Controls
1、PCR（25μL体系）
Composition Volume（μL）
目的DNA 1.0
Primer sense（10μmol/L）0.5
Primer anti-sense（10μmol/L）0.5
PCR Master Mix（2x）12.5
PCR H2O10.5
Composition of PCR Master Mix(2x):
0.05units/ul Taq DNA Polymerase in reaction buffer,
4mM Mgcl2,0.4mM dNTP
2、PCR扩增程序：
Temperature Time
95℃5min
94℃30s 40Cycles
57℃30s 40Cycles
72℃30s 40Cycles
72℃5min
4℃∞
4、产物用琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,加样量为10μl（DNA样本8μl+上样缓冲液2μl）,电压120V ,电泳完毕后在溴化乙锭( EB)中染色约15分钟，清水漂洗后凝胶成像系统拍照。
5、凝胶图片与平均光密度值
阳性条带以Gel pro4.0 版凝胶光密度分析软件进行分析，测其IOD值。
(完整版)分子生物学实验技术考试题(卷)库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
细胞生物学实验
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
医学细胞生物学实验的目的和任务
第一章绪论 （一）名词解释 1.细胞学 2.细胞生物学 3.医学细胞生物学 （二）填空题 1.细胞生物学是从、和三个水平上研究细胞生命活动的科学。 2.细胞是生物体和的基本单位。 3.细胞生物学的发展可分、、和四个阶段。 4.1841 年Remak在观察鸡胚的血细胞时，发现了细胞的分裂；其后Flemming在动物细胞中、Strasburger在植物细胞中发现了分裂。1883 年Van Beneden、1886 年Strasburger分别在动、植物细胞中发现了分裂。 5.1944 年Avery等在微生物的实验中证明了是遗传物质。 6.1953 年和共同提出了DNA 分子的结构模型。 7.1958 年Meselson等利用放射性同位素与梯度离心法，分析了DNA 的复制过程，证明了DNA 的复制是。 8.R.Feulgen于1924年发明了染色法，用于检测细胞核内的。 （三）选择题 1.最早发现细胞并对其命名的学者是 A. R.Hook B. Leeuwenhook C. R.Brown D. W .Flemming E . C.Darvin 2.细胞学说的创始人是 A.Watson and Crick B.Schleiden and Schwann C. W.Flemming D. R.Brown E. R.Hook and Leeuwenhook 3.在1855 年提出“一切细胞只能来自原来的细胞”论点的学者是 A.Remark B.W.Flemming C. R.Virehow D.R.Brown E. Schleiden
4.最早发现细胞直接分裂（无丝分裂）的学者是 A.W.Flemming B.Remark C. R.Virehow D.R.Brown E.Schwann 5.最早在动物细胞中发现间接分裂（有丝分裂）的学者是 A. Strasburger B. W.Flemming C. Remark D. Boveri E. Feulgen 6.最早在动物细胞中发现减数分裂的学者是 A. Van Beneden B. Strasburger C. Flemming D. Remark E. Boveri 7.Van Beneden和Boveri在1883年发现的细胞器是 A.线粒体 B.中心体 C.高尔基体 D.细胞核 E.纺锤体 8.Banda在1897年发现的细胞器是 A.中心体 B.线粒体 C.细胞核 D.高尔基体 E.纺锤体 9.最早提出染色体遗传理论的学者是 A.Schleiden and Schwann B.Watson and Crick C.R.Hook and Leeuwenhook D.Boveri and Sutton E. Van Beneden and Boveri 10.细胞遗传学的创始人是 A.Mendel B.Morgan C. Flemming D. Remark E. Feulgen 11.在1943 年应用高速离心机从活细胞中将细胞核和各种细胞器分离出来, 并研究其生理活性的学者是 A. Feulgen B. Brachet C. Casperson D. Cloude E. Ruska 12.在1924 年首创核染色反应，测定了细胞核内DNA的学者是 A. Cloude B. Brachet C. Feulgen
细胞培养实验技术大全
细胞培养实验技术大全 第一章细胞培养的基本原理与技术 现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。 第一节体外培养的概念 一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。 组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。 细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。 器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 二、体内、外细胞的差异和分化 1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。 2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。 第二节细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试。 二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则
(完整版)细胞实验技术
（一）干扰引物（shRNA）设计： 1、NCBI上下载基因序列 2、在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游） 3、从起始密码（ATG）下游25bp开始； 4、GC含量介于40%~60% 5、干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区 6、选择脱靶率低的 （二）、干扰载体构建 1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离） 退火体系： 上游：5ul 下游：5ul 10X M buffer 5ul H2O 35ul 水浴锅100℃2min，锅里隔夜 （三）、酶切plko.1载体 1、AgeI 酶切，反应体系： plko.1载体4ug AgeI 2ul 10X AgeI buffer 5ul H2O 39ul 37℃水浴2~3h 2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱 3、EcoRI酶切，反应体系： AgeI 酶切产物30ul EcoRI 2ul 10X H buffer 5ul H2O 13ul 37℃水浴2~3h 切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度 （四）、连接 连接体系：T4连接： 退火引物2ul 退火引物5ul 酶切载体1ul 酶切载体1ul Solution I 5ul T4连接酶1ul H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul H2O 2ul 室温下连接4h。 （五）、转化 -80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。 （六）、挑菌 用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。 （七）、提质粒
细胞生物学实验
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
医学细胞生物学实验课教学大纲.
医学细胞生物学实验课教学大纲 (供临床医学专业七年制使用) 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年6月
前言 细胞生物学是生命科学中最重要的基础学科和前沿学科，细胞生物学课程是培养医学生基础理论知识、实践能力、创新能力的关键环节。优秀的细胞生物学课程高等医学院校课程体系建设的重要内容。结合汕头大学医学院人才培养目标，我们将锻造理论与实践、临床与基础重组渗透，能力培养贯穿始终的、特色鲜明的医学细胞生物学课程体系作为本课程建设的目标，力争通过本课程的学习使临床医学专业学生掌握细胞生物学的基本原理、研究方法，掌握相关疾病的分子机制，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践、科学研究奠定良好基础。 实验课教学是理论教学的重要补充，是人才培养的关键环节。在实验教学上我们以科研与教学相结合、科研应用于教学为指导思想，坚持实验内容的先进性和综合性，创造条件改善和提高学生的动手能力，为培养学生基本科研技能奠定基础。力争通过实验课学习使学生掌握医学细胞生物学的基本理论和实验技能，提高学生独立分析问题和解决问题的能力，培养学生学习的主动性，使其具备一定的科研思维和科研能力，提高科学素养，为其今后的终身学习、临床实践和科学研究奠定良好基础。 七年制细胞生物学实验课程包括基础性实验-综合设计性实验-科研活动三个层次的实验课课程体系。通过该课程体系对七年制学生实验能力进行全程培养。本教学大纲规定基础性实验和综合设计性性实验的内容。科研活动的内容和要求由学生和教师讨论后自行确定。 汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室 2007年5月
七年制医学细胞生物学实验课内容 实验项目名称学时层次教学手段 实验一数码互动系统使用及细胞 基本形态观察4 基础实验 数码互动系统讲授 示教讨论 实验二细胞生理活动观察 4 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验三细胞染色体标本制备 与观察4 基础实验 数码互动系统 讲授、示教讨论 实验四细胞的原代与传代培养 6 基础实验数码互动系统多媒体演示 讲授、示教讨论 实验五细胞组分的分离与鉴定>12 综合实验讨论多媒体 实验六细胞骨架对细胞、细胞器的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验七药物对细胞增殖与凋亡 的影响>12 综合实验 讨论 多媒体 实验八定位信号与蛋白亚细胞 定位>12 综合实验 讨论 多媒体 大学生科研活动项目科研活动综合应用多种教学手段
动物细胞培养技术实验教程内容
实验1 细胞培养概述 （一）细胞培养室的设置和无菌操作 【实验原理】 细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。 【实验目的】 ①了解培养室的设置和设备。 ②学习无菌概念和无菌操作要领。 【操作步骤】 1．实验室设置 （1）配液室 （2）准备室 （3）培养室 培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点： ①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。 ②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应， ③门一般用拉门，以防止空气流动。 ④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。 2．实验室常用设备 （1）准备室的设备 ①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。 ②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。 ③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。 ④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。不同物品其有效灭菌压力和时间不同。 ⑤储品柜1：放置未消毒物品。 ⑥储品柜2：放置已消毒物品。 准备室注意事项： ①预防蒸馏器被烤干。 ②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。 ④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。 （2）配液室的设备 ①天平（扭力天平和电子天平）：称量用 ②pH计。 ③磁力搅拌器。 （3）细胞培养室的设备 ①超净工作台： 超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。 根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。但两种净化台的气流方向不同。 使用超净工作台应注意的几点问题： A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。 B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。 C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。
分子克隆及细胞培养基本实验方法
分子克隆及细胞培养基本实验方法 1.载体构建实用操作技术 1.1菌种的保存—20%甘油菌 2体积菌液与1体积70%的甘油混合后，储存于-20℃或-70℃备用。（甘油菌中甘油的浓度为20-30%均可） 1.2甘油菌复苏、培养 方法一、挑取甘油菌一环，接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基上（活化菌种），37℃培养过夜（约16小时）；挑取一个菌落转接在含100ug/ml Amp 的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 方法二、直接吸取10~20ul甘油菌，接种在含100ug/ml Amp的LB液体培养基中，37℃振荡过夜（约12~16小时）。 1.3小规模制备质粒DNA（QIA miniprep kit ） 适于从1~5ml 菌液中制备20ug高拷贝质粒 ⑴收集菌液，离心1000rpm，１分，弃上清 ⑵以250ul P1重悬细菌（P1中已加RNase） ⑶加入250ul P2，颠倒4~6次轻混，约2~3分（轻混以免剪切基因组DNA，并免 长时间消化） ⑷加入350ul N3，迅速颠倒4~6次轻混；离心10分，13 000rpm ⑸上清入QIAprep柱，离心30~60秒，滤液弃之 ⑹加入0.5ml PB洗，离心30~60秒 ⑺加入0.75ml PE洗，离心30~60秒，弃滤液，再离心1分 ⑻换新管，加入50ul EB，静置1分（EB 37℃预热），离心1分。 1.4酶切反应 ⑴体系构成（反应体系尽可能小！） pGEM3ZF-huCTLA4-Ig（ul）pAdTrack-CMV（ul）
①dd.H2O 17 17 ②10×NEbuff 2 3 3 ③10×BSA 3 3 ④底物DNA 5 5 ⑤内切酶HindⅢ 1 1 XbaⅠ 1 1 Total : 30 ul 30ul ⑵37℃水浴1~2小时，必要时延长酶切时间至12小时 ⑶酶切2小时后，取5-10ul 电泳观察酶解是否完全 ⑷65℃灭活内切酶 ⑸-20℃保存备用 1.5回收目的片段（QIAquick Gel extraction Protocol） ⑴胶，尽可能去除多余的胶，称重； ⑵加入适量buff QG（300ul QG /100mg胶）；>2%的胶，应加大QG用量（600ul QG /100mg）； ⑶水浴50℃，10min，每2-3min混匀一次，使胶完全溶解！必要时延长水浴时间， 胶完全溶解后混合物颜色应为黄色，与buff QG 相似； ⑷当DNA片段在<500bp或>4kb时，应加入异戊醇100ul/100mg胶，以提高产物 量。此步不离心。DNA片段在500bp~4kb时，加入异戊醇并不能提高产量； ⑸结合：将混合物转入QIAquick柱，离心13000rpm，1min；（柱容量800ul/次）； ⑹洗：0.75ml buff PE，离心13000rpm，1min；（DNA用于盐敏感操作时，如平 端连接、直接测序，加入PE后静置2-5min）；弃离心液，再离心13000rpm， 1min，以去除剩余的乙醇； ⑺将QIAquick柱置于一清洁的1.5ml Ep管，加入30~50ul buff EB或H2O （滴 于QIAquick 膜上！），静置1min，离心15000rpm，1min； ⑻-20℃保存备用。 1.6连接反应
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
细胞培养实验技术手册
实验记录 24/2/2014 一、细胞培养 一、培养基的配制 a. RPMI 1640 1×（with L-glutamine）类培养基组分：RPMI ，10%FBS（胎牛血清），双抗生素（penicillin，盘尼西林（青霉素），streptomycin，链霉素）； 配制方法：500 ml RPMI(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 b. DMEM 1×类培养基组分：DEMI，10% FBS，双抗生素； 配制方法：500 ml DMEM(一瓶) + 50 ml FBS + 5 ml 双抗生素 二、培养细胞RNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液指最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 每孔中加1 ml Trizol ，吸出放-80℃冰箱冷冻。 三、培养细胞DNA的提取 1.从培养箱中拿出6孔板（每孔培养2 ml），吸出培养液； 2.PBS清洗；用大枪管吸取PBS加入每个培养孔中（枪头不要触碰培养板，防止交叉污染），用1 ml枪吹匀清洗（把培养板倾斜，吸溶液至最高处打出）。重复以上操作一次。 3. 向培养板中加酶消化（时间较长，放进培养箱，看到有白色悬浮后取出），取出加DMEM类培养基； 4. 吸出至1.5 ml 离心管，3600 rpm，4 min离心； 5. 吸出上清（不要触及沉淀），加PBS 1ml清洗，3600 rpm，4 min离心； 四、常用细胞系（人） 名称细胞类型来源核型培养液 A431 上皮型表皮细胞肿瘤非整倍体（76，XX）DMEM+10%FBS HeLa 上皮样宫颈癌非整倍体（81-83，XX）MEM+NEAA 10%FBS Hep G2 上皮样肝细胞癌非整倍体（55，XY）MEM+NEAA 10%FBS MEM：极限必需培养液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’s MEM改良培养液；RPMI：Roswell Park Memorial 研究所；BrdU：5-溴脱氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖转移酶 实验室除snu系列与国产7721用1640培养基，其它用DMEM培养基。 五、原代培养----肝细胞 1.切除乳鼠肝脏组织放进小烧杯中，用PBS或培养液漂洗2-3次，去除血污； 2.加少量培养液，用剪子把组织剪碎，1 平方mm左右，再用吸管吹打； 3.加含10%小牛血清的1640培养液，制成均匀的细胞悬液，移入培养瓶，将组织块放在培养瓶底部，采用薄层营养液培养法，盖上瓶盖。 4.换液，只将旧的培养液吸弃，换上新的培养基。 六、传代培养 1.显微镜观察是否需要传代 细胞生长良好：上清液清亮，无悬浮物，折光性好，均质而透明，胞膜完整，胞内颗粒少，无空泡和脂滴。细胞生长不良：悬浮物多，发差增大，胞膜不完整，胞质中颗粒多，出现空泡和脂滴。
细胞生物学实验
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
实验技术手册(细胞免疫方面)
单克隆抗体的制备 1975年，K?hler和Milstein创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体，单克隆抗体具有特异性高，灵敏度高，重复性好，可供应量大，检测时间短以及能够查出混合物中的少量成分等优点。 1试验材料 1.1试验动物和细胞 雌性6～8周龄BALB/c小鼠 SP2/0骨髓瘤细胞 1.2主要实验试剂 HRP标记羊抗小鼠IgG、福氏完全佐剂（FCA）、福氏不完全佐剂（FIA）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、降植烷、TMB底物、HAT(50×)、HT(50×)、三抗溶液（100×）小鼠单抗Ig类和亚类鉴定用ELISA试剂盒均为SIGMA公司； DMEM粉、特级胎牛血清（FBS）均为GIBCO公司； 牛血清白蛋白（BSA） 1.3主要实验仪器和耗材 CO2细胞培养箱（Thermo和上海新苗医疗器械制造有限公司WJ-160B-Ⅲ） 酶联检测仪（BIO-RAD Model 680） 血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司） pH计（Sartorius赛多利斯科学仪器） APL高压灭菌锅（CL-32L） 生物安全柜(ESCO北京五州东方科技发展有限公司) 三恒电泳仪（JY600C） 数显恒温磁力搅拌器（78HW-1，杭州仪表电机有限公司） 电子分析天平（Sartorius赛多利斯科学仪器） 分光光度计（WPA Biowav eⅡ+） 进口液氮罐（Thermo） Protein A柱 恒温水浴锅（HH-2金坛市科兴仪器厂） 微型台式真空泵（GL-80ZB型，海门市） 电热恒温培养箱（DHP-9032上海天恒医疗器械） 低速离心机 (L-550长沙湘仪离心机仪器有限公司) 高速冷冻离心机（SIGMA 2-16PK） 倒置显微镜（Nikon TS100） 超低温冰箱(Thermo) 96孔酶标板（） 96孔、24孔细胞培养板、T25培养瓶、35mm培养皿、60mm培养皿、100mm培养皿、冻存管0.22μm过滤器(PALL) 2主要试剂配制 2.1常规试剂配制 PBS（或PB）（0.02mol/L，pH7.4）： A液（0.2 mol/L Na2HPO4）：Na2HPO4·12H2O 71.64g,加蒸馏水至1000ml；
细胞生物学实验汇总
细胞生物学实验汇总
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实验一、二：细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察 【基本原理】 细胞膜表面的有分支状糖外被，细胞间的联系、细胞的生长和分化、免疫反应、肿瘤的发生等都和细胞表面的分支状糖分子有关。凝集素（lectin）是一类含糖并能与糖分子专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞表面间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换的结构。可选择性地让某些物质进出细胞，各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，以至于在高渗环境中，动物细胞会失水而收缩；在低渗环境中，动物细胞会吸水膨胀直至破裂。 本实验将红细胞分别放于各种等渗溶液中，由于红细胞膜对不同溶质的通透性不同，使得不同溶质透入细胞的速度相差很大，有些溶质甚至不能透入细胞。当溶质分子进入细胞后可引起渗透压升高，水分子随即进入细胞，使细胞膨胀，当膨胀到一定程度时，红细胞膜会发生破裂，血红素溢出，此时，原来不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为红细胞溶血。由于各种溶质进入细胞的速度不同，所以不同的溶质诱导红细胞溶血的时间不同，相反可通过测量溶血时间来估计细胞膜对各种物质通透性的大小。 【方法步骤】 1．制备土豆凝集素液和红细胞悬浮液，制备无血清的鸡红细胞悬液，使凝集素液和红细胞悬液混合，静置后，在光镜（低倍）下观察凝集素使红细胞凝集的现象。（以PBS 缓冲液加2％血细胞作对照实验）[土豆凝集素的制备：称取土豆去皮块茎2g , 加10 mL PBS 缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素） , 载玻片上滴一滴土豆凝集素,再滴一滴2％红细胞液,充分混匀静置20 min , 低倍显微镜下观察血球凝集现象。] 2．观察10%的鸡红细胞悬液，可见该悬液为一种不透明的红色液体 3．观察溶血现象取一支试管，再加入4ml 蒸馏水，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，混匀后注意观察溶液颜色的变化，可见溶液由不透明的红色变成透明的红色液体（可将试管贴靠在书上，隔着试管看书中的字，如发现溶血则文字可被看清）。 4．观察鸡红细胞对不同物质的通透性 （1）取一支试管，和0.17M 的Nacl 溶液4ml，加入0.4ml 鸡红细胞悬液，轻轻摇匀，用上述方法观察是否出现溶血现象，如出现溶血，记下发生溶血所需要的时间（从加入4ml 溶液算起） （2）按上述方法分别加入下列9种溶液是否导致红细胞溶血并记录实验结果。 ①0.17M 氯化铵②0.17M 硝酸钠③0.17M 硫酸钠④0.17M 醋酸胺 ⑤0.17M 草酸铵⑥0.17M 葡萄糖⑦0.17M 甘油⑧0.17M 乙醇 ⑨0.17M 丙酮 【实验结果】 1、土豆凝集素能使鸡红细胞凝集，PBS 对照液中红细胞分散均匀。对照组未凝血，实验组凝血。 2、氯化钠、硝酸钠、硫酸钠溶液不溶。醋酸铵>草酸铵>氯化铵>乙醇>甘油>丙酮>葡萄糖。膜通透性大小主要取决于分子大小和分子极性。小分子比大分子容易通过，非极性比极性易通过，带电荷离子高度不透。
细胞培养技术
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。