浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

摘要

动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。

关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略

目录

摘要 ................................................................................................................................................... I 1引言 .. (1)

2基础理论概述 (1)

2.1细胞培养的概念 (1)

2.2原代细胞培养的概念 (1)

2.3传代细胞培养 (2)

3影响细胞体外培养的因素 (2)

3.1细胞分离方法 (2)

3.1.1直接分离法 (3)

3.1.2酶消化法 (3)

3.2细胞培养温度 (3)

3.3细胞培养基的成分 (3)

3.3.1天然培养基 (3)

3.3.2合成培养基 (3)

3.4接种密度 (4)

3.5培养基的pH值 (4)

3.6细胞的冻存与复苏 (4)

3.6.1细胞冻存 (4)

3.6.2细胞复苏 (5)

4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5)

4.1无菌室的彻底消毒 (5)

4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6)

4.2.1清洗 (6)

4.2.2消毒灭菌 (6)

4.3培养试剂的分装与保存 (7)

4.4对操作者的要求 (7)

5结语 (8)

参考文献 (9)

致谢 (10)

浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

1引言

细胞体外培养技术由于具有简化细胞生长环境、明确生长条件、便于施加实验因素、容易获得活体直接观测实验结果，以及方便控制培养产物等优点，在医药领域已成为研究发病机理和筛选药物的重要手段，在分子生物学领域，利用细胞培养技术，结合细胞融合、细胞杂交以及转基因技术，进行基因重组、组织构建，成为分子遗传和组织工程研究者的重要研究工具，利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分。

近年来，分子生物学和分子遗传学获得巨大进展，培养细胞技术被广泛应用于该领域的研究，这些培养的细胞已成为基因工程、遗传工程、体细胞克隆、转基因动物、生物制药、干细胞、微生物学、细胞生物学、遗传学、病毒学、免疫学等学科研究的有力工具和重要途径。

2基础理论概述

2.1细胞培养的概念

细胞培养是指将细胞从机体中取出，人工模拟机体内生理条件，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等的研究工作，是维持细胞结构和功能的体外培养方法。2.2原代细胞培养的概念

原代培养是指取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养，这是细胞培养的最初和必经阶段。培养方法包括：单层细胞培养和悬浮培养。

(1)单层细胞培养：将取下的组织块无菌剪切后，用0.25%胰酶消化，使细胞分离，再用无菌Hanks液或0.85%NaCl溶液洗涤后，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮培养：悬浮培养的细胞多取材于血液或体腔液，一般采用离心法分

离细胞，低速500-1000r/min，离心5-10min即可。培养时，只要取适当浓度的细胞悬液接种于完全培养液中，细胞就能增殖。

2.3传代细胞培养

传代细胞培养是指细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中，即当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养。根据原代培养物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系或细胞株。这些细胞一般可顺利传40-50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系／株。一般细胞原代培养1-4周后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，影响细胞的生长繁殖。

在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。人传代次数与个体年龄成反比：人胚胎40-60代；幼年20-40代；成年10-30代；得了早老病的儿童2-10代。传代培养的方式主要有：贴壁型细胞传代和悬浮型细胞传代。

(1)贴壁型细胞传代：传代时需要用胰酶将细胞消化，使其从支持物上脱落，或用ＥＤＴＡ溶液与胰酶按体积比为1:1或1:2比例混合后联合使用。过滤除菌后小量分装，于-20℃保存。消化时吸去培养瓶内的培养液，加入适量的ＥＤＴＡ溶液与胰酶的混合液，以能覆盖细胞层为宜，将培养瓶平放，37℃作用3-5min，加入Hanks液，1000r/min离心5min即可除去消化液，洗1-2次后加入完全培养液，计数，置培养皿或培养瓶中培养。

(2)悬浮型细胞传代：传代时用吸管将细胞吹打均匀，特别是一些成团生长的细胞，应将细胞团块打散。根据细胞生长状况的不同，用吸管将细胞悬液吸去适当的量，然后再加入完全培养液至原体积

3影响细胞体外培养的因素

3.1细胞分离方法

细胞分离方法细胞培养之前，首先要进行组织块的分离，其主要方法包括：

直接分离法（包括机械法和EDTA螯合法）和酶消化法（包括胰蛋白酶消化和胶原酶消化）。

3.1.1直接分离法

该方法分离得到的细胞数量没有酶消化法得到的多，但可满足一般实验的要求，该方法的优点是操作流程简单，不需要复杂的仪器和昂贵的胶原酶。

3.1.2酶消化法

多用于新生动物组织或动物胚胎的肝细胞培养。胰蛋白酶消化法具有分离效果好、操作简单和价格便宜的特点，因为胰酶消化的条件很难掌握，所以未被广泛应用；胶原酶消化法具有分离效果好、细胞产量高（即时存活率高、对细胞损伤小）、维持细胞特异性功能的时间长等优点。

3.2细胞培养温度

不同种类的动物细胞对温度的要求并不一致，如人和哺乳动物的细胞培养温度为35-37℃，鸟类细胞培养温度为38.5℃，鼠类细胞为34℃。一般来说，细胞对低温的耐受力比高温强。因此，在细胞的培养过程中要及时地根据细胞的类型调整适宜的温度。在使用恒温培养箱时，箱内温度应维持在37℃、CO2体积分数为5%。

3.3细胞培养基的成分

培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基，按其来源分为天然培养基和合成培养基。

3.3.1天然培养基

最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。质量好的血清应该是无溶血、橘黄色清亮透明、无细菌、无支原体污染的黏稠状液体。血清的体积分数要控制在5%-20%，当超过30%时反而不利于细胞生长，过高或过低的血清体积分数都不利于细胞的生长和增殖。一般将血清保存于-20℃以下，时间不易过长。

3.3.2合成培养基

合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化

合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用细胞虽有生存但不能很好地生长增殖。迄今为止，人工合成的培养基已有多种，如RPMI-1640、Eagle’s MEM、DMEM等，其主要差别在于氨基酸、维生素、无机盐和能源物质的组成及含量不同。一般认为RPMI-1640营养全面，对各种组织生长都适用；Eagle’s MEM适合于细胞株的传代培养；DMEM有利于细胞的分裂增殖；Ham’s F12能促进细胞的分化。也有学者将不同培养基混合应用，从而得到较好的培养效果。培养液中的抗生素是青霉素和链霉素。此外，卡那霉素、新霉素、两性霉素、氯霉素等都可以防止细胞培养过程中细菌和真菌的感染。3.4接种密度

一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，细胞密度过大时，养分不足，使细胞迅速老化；而密度过小时，不利于细胞单层的形成。在传代培养中，细胞的密度取决于传代的时间。一般分瓶的稀释比例为1:3至1:6，依细胞种类而异。在细胞生长的外部条件完全相同的情况下，细胞分散比率不同会导致不同的增殖倍数，影响细胞产量，这对培养种细胞尤其重要。

3.5培养基的pH值

在培养动物细胞时，不同种动物或是同一种动物的不同部位对pH值的要求各不相同。一般认为，动物细胞培养基的pH值一般在7.2-7.4，呈弱碱性。培养过程中pH值低于6.8时对细胞生长会有抑制作用，细胞生长缓慢；而当pH高于7.6时则细胞不能生长，这可能是由于空气的接触而导致培养基中的营养成分被氧化所致。

3.6细胞的冻存与复苏

细胞冻存和复苏的基本原则是“慢冻快融”，实验证明这样可以最大限度地保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质都能提高细胞膜对水的通透性。缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

3.6.1细胞冻存

传代培养的细胞，如果暂时不用，可以冷冻保存。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，在需要的时候再复苏细胞后用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂至终体积分数5％。15％的甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。标准冷冻速度开始为-1℃／min或者-2℃／min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

3.6.2细胞复苏

复苏细胞的原则为快速解冻，从液氮中取出细胞冻存管之前应准备好38℃的温水，冻存管取出后用镊子夹住顶端迅速放入温水中，结束后还要在75％酒精中清洗几次，除去透明过程中染上的杂质。为缩短透明时间，可将标本放在烘干箱或灯光下加热，透明时间长短根据标本大小、多少和环境温度而定。冻存复苏后的状态主要与冻存保护剂的种类、浓度以及细胞复苏方法和复苏后培养液中小牛血清浓度等有关。二甲基亚砜（DMSO）是一种具有非常强的溶解能力和非凡渗透能力的化学物质，也是应用最广泛的体外培养细胞冻存保护剂，其常用体积分数为10％～20％，不同种属细胞的最适浓度也存在一定差别。

4细胞实验室无菌环境的防控策略

目前细胞培养过程中最主要的问题就是污染，污染可导致细胞死亡，从而造成人力、财力和时间的损失，有时还可能造成特殊材料的不可再用。因此，在做细胞实验时，一定要尽力避免污染的发生。

4.1无菌室的彻底消毒

无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。一般情况下，无菌室每周都要彻底清洁、消毒1次，用稀释的新洁尔全面彻底地擦洗无菌室的台面和地板，用屋顶装置的紫外灯照射整个细胞培养室30-60min，以对环境进行消毒。实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。在超净工作台区域应保持清洁及宽敞，必要物品，如试管架、吸管盒等可暂时放置，

其他实验用品用完即应移出，以利于气流的通畅。超净台的平均风速保持在03.2-0.48m/s为宜，过大、过小均不利于保持净化度。使用前最好开启超净台内紫外灯照射10-30min，然后让超净台预工作10-15min，以除去臭氧和使工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70％酒精将台面和台内四周擦拭干净，以保证超净台无菌。

4.2培养用品的清洗和消毒灭菌

细胞培养需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金属器皿、塑料、橡胶制品、布类、纸类等，从事细胞培养的工作人员必须要掌握这些物品的清洗和消毒灭菌的知识与方法。

4.2.1清洗

离体条件下，细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，达到不含任何残留物的要求。

(1)玻璃器皿的清洗：一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗４个步骤。

(2)橡胶制品清洗：新的橡胶制品洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15min，流水冲洗；0.5mol/L HCl煮沸15min，流水冲洗；自来水煮沸2次；蒸馏水煮沸20min；50℃烤干备用。

(3)塑料制品的清洗：塑料制品由于质软而易出现划痕，耐腐蚀能力强但不耐热。使用器皿后立即用清水清洗，浸于自来水过夜，然后用纱布（或棉签）和50℃清洗液刷洗，流水冲洗，晾干，浸于清洁液15min，流水冲洗（15-20遍），蒸馏水浸洗3次，双蒸水泡24h，晾干备用。

(4)包装：对细胞培养用品进行消毒前，要进行严密包装，以便于消毒和贮存。常用的包装材料有牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、较大培养皿等，近几年用铝箔包装非常方便、适用。培养皿、注射器、金属器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，较大的器皿可以进行局部包扎。

4.2.2消毒灭菌

微生物污染是造成细胞培养失败的主要原因，对于已经清洗的器皿要进行灭菌处理，常用的方法是高温湿热灭菌和高温干热消毒两种方法。

(1)高温湿热灭菌。此法是最常用的灭菌方法，对生物材料有良好的穿透力，

能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡。布类、物、玻璃器皿、金属器皿、胶和某些培养液都可以用这方法灭菌。不同压力蒸气的温度不同，不同消毒物品所需的有效消毒压力和时间不同。从压力蒸气消毒器中取出消毒好的物品（不包括液体），应立即放到60-70℃烤箱内烘干，再贮存备用，否则，潮湿的包装物品表面容易为微生物污染。

(2)高温干热灭菌。此法主要是将物品放入电热烤箱内加热到160℃以上，并保持90-120min，杀死细菌和芽孢，达到灭菌目的。主要用于灭菌玻璃器皿（如体积较大的烧杯、培养瓶）、金属器皿以及不能与蒸气接触的物品（如粉剂、油剂）。干热灭菌后要关掉开关并使物品逐渐冷却后再打开，切忌立即打开，以免温度骤变而使箱内的玻璃器皿破裂。电热箱内物品间要有空隙，物品不要靠近加热装置。

4.3培养试剂的分装与保存

培养液和胰酶的配制用水是三蒸水或符合培养细胞标准的水。试剂的除菌方法采用过滤除菌法，最好使用一次性的滤器和滤膜，如果是反复使用的滤器则应在过滤前先将滤器和滤膜高压灭菌，而后在无菌操作台内进行过滤分装，接收滤液的容器也需事先高压灭菌。配制好的培养液经测试确认没有污染方可用于培养细胞。配好的试剂于４℃保存。培养细胞所用的血清必须储存于-20-70℃，但不能超过１个月，解冻时在-20℃或-70-4℃冰箱溶解1天，至室温下全溶后再分装，在溶解过程中要规则摇晃均匀，使温度与成分均一，这样可以减少沉淀。最好不要直接在37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

4.4对操作者的要求

有很多污染的发生都与实验操作人员操作不当有关，细胞培养实验的操作应是严格的无菌操作。首先实验进行前，无菌操作台面、手术器械、废液缸及实验用品均应用紫外灯照射30-60min灭菌；以70％酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10min后，方可开始实验操作。

实验操作人员进培养间之前，须先洗手，在缓冲间换穿专用实验服和拖鞋，准备好与细胞培养操作实验有关的所有试剂和用品，严禁在实验进行时频繁出入培养间。在无菌操作台开始操作前须戴一次性乳胶手套，并用70％酒精擦拭、擦瓶口和烧灼瓶口。

在实验过程中，要求实验人员规范操作，严格遵守无菌工作流程。操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。操作时尽量不要谈话、咳嗽，以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。吸取培养液和细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。做完实验后应将实验产生的废物和废液及时移出培养间，并用消毒水浸泡的纱布擦拭台面，保证工作台清洁无菌。

5结语

动物细胞培养作为现代多个学科领域研究的重要技术，具有越来越占有重要的地位。目前，动物细胞培养已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得了很大的进展，但还存在一些亟待解决的问题。为了获得更多细胞、节省成本，合理控制细胞培养时的影响因素和做好细胞培养过程中污染的防控工作，是每个细胞培养研究者都要重视的工作。

参考文献

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[4]黄兰兰，石国庆，卢春霞．影响动物细胞体外培养因素[J]．黑龙江动物繁殖，2005，13(4)：16-17.

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[7]姜彬．细胞培养技术简介及避免污染的策略[J]．生物学通报，2008，43(3)：54-55.

致谢

通过这两个多月的忙碌和学习，本次毕业论文已经接近尾声，虽然花费了所有的业余时间，但作为一个大学生的毕业论文，由于经验的匮乏，难免有许多考虑不周的地方，在这里衷心感谢指导老师的督促指导，以及一起学习及努力的同学们的支持，让我按时完成了本次毕业设计。

在本次毕业论文中，我遇到了许多问题，在此我要感谢我的指导老师XXX 老师从论文的选题，定稿及中期修改，后期格式调整等各个环节中都一直给我悉心的帮助和耐心的指导。为了指导我们的毕业论文他放弃了自己的休息时间。他的敬业精神和无私奉献精神令人钦佩。同时感谢四年来所有的任课老师和所有的同学给自己的指导和帮助，同时感谢实习单位给我提供的宝贵的实习机会和在各个方面给与我帮助的伙伴们。在此再一次真诚的向帮助过我的老师和同学表示感谢!

补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响

见表1。 3　讨论 子宫肌瘤育龄期妇女患病率高达20%～25%。我科根据子宫肌瘤“肝郁”、“脾虚”、“血瘀”的病机特点,以疏肝健脾、益气养血、化瘀散结组方制成子胞康胶囊,分别于月经前和月经后服用,不仅能够显著缩小或消除子宫肌瘤瘤体,且能明显降低患者血清雌、孕激素水平[3]。子宫肌瘤的发生主要与长期、大量的雌、孕激素刺激有关[4],本文结果显示:雌激素能使大鼠子宫肌层增厚,肌纤维肥大,结构紊乱;而子胞康胶囊鼠子宫肌层细长,排列规则,肌层厚度亦显著低于模型组,表明其可拮抗雌激素的作用,使子宫肌层的改变全部或部分恢复正常。同时,子胞康胶囊还能明显降低大鼠血清E2、P浓度,以上结果提示,调节雌、孕激素水平为子胞康胶囊治疗子宫肌瘤的作用机理之一。另外,从组织学观察中可见,模型组部分大鼠子宫积水、淤血,子宫内膜及卵巢有较明显的化脓性感染,并有大小不一的脓肿形成。而子胞康胶囊大剂量组完全无此现象,小剂量组偶尔可见脓肿形成,提示子胞康胶囊可能同时具有抗炎、抗菌及改善微循环作用,具体情况有待我们进一步研究。 参考文献 1　香卫红.消瘤丸对雌性激素负荷大鼠子宫肌层影响的实验研究.中医杂志,1998;39(6)∶346 2　盛一方.40例子宫肌瘤外周血和卵巢血的五项激素变化.上海医科大学学报,1995;22(1)∶69～71 3　王永林,苏旭春.雌激素高峰期以中医药治疗子宫肌瘤40例临床观察.湖南中医药导报,2000;6(3)∶23～24 4　孙梅.子宫肌瘤的病因学研究进展.国外医学妇产科分册,1997;24 (3)∶160～163 补肾中药对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响Ξ 李冬华,朱飞鹏1 (首都医科大学中医药学院,北京　100013;1国家食品药品监督管理局药品审评中心,北京　100038) 摘　要　目的:观察补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞增殖和功能的影响。方法:体外培养成骨细胞,观察补肾中药含药血清对成骨细胞增殖率和AL P活性的影响。结果:补肾中药含药血清对成骨细胞增殖能力和AL P活性有增强作用。结论:补肾中药活性成分对体外培养成骨细胞的增殖和功能有促进作用。 关键词　成骨细胞;增殖和功能;补肾中药 由肾主骨理论指导下的补肾法在骨代谢疾病的治疗中占有重要地位。现代医学的发展使得我们得以从细胞、分子水平揭示肾在骨代谢中的重要地位。本文通过体外培养成骨细胞,观察补肾中药活性成分对成骨细胞增殖和功能的影响,为补肾中药治疗骨代谢疾病提供实验依据。 1　材料和方法 1.1　试验药物　补肾中药由菟丝子、何首乌等提取的活性部位组成,由复旦大学药学院提供。 1.2　试剂和仪器　M EM培养基干粉(美国GIBCO 公司产);新生小牛血清(NCS,美国GIBCO公司产);胶原酶Ⅱ(CollagenaseⅡ,Sigma公司产);胰蛋白酶(华美生物公司)。二氧化碳培养箱(德国产),倒置相差显微镜(日本Olympus公司产);光学显微镜(日本Nikon 公司产);酶标仪(美国Bio2Tek公司产)。 1.3　方法1.3.1　大鼠成骨细胞分离培养　出生24h内小鼠10只雌雄兼用,自来水冲洗后放入75%酒精内5min,无菌剪开头部皮肤,手术刀切下颅盖骨,清除骨表面的结缔组织,PBS反复冲洗至骨组织发白,用剪刀将骨组织剪碎至1mm×1mm大小的骨片,0.25%胰蛋白酶5ml 37℃预消化20min,弃消化液,0.1%Ⅱ型胶原酶5ml 37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm×10min,弃上清,加入适量培养液;将骨片再次用0.1%Ⅱ型胶原酶5ml37℃消化60min,移取消化液,离心1000rpm ×10min,弃上清,加入培养液适量;混匀二次消化的细胞,接种于25cm2培养瓶(3×105/瓶),在5%CO2、95%空气、37℃条件下培养24h后换液一次,以后每3天换液一次,细胞汇合后,0.25%胰蛋白酶消化,3×105/瓶分瓶接种于25cm2培养瓶(第一代细胞),继续培养,汇合后用于测定成骨细胞的增殖及功能等。 1.3.2　补肾中药含药血清制备　3月龄雄性SD大鼠30只分为3组:中药组、空白组和CMC对照组。中药 23中药药理与临床2005;21(2)Ξ北京市优秀人才培养专项经费资助

细胞培养的方法与步骤

细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。

浅析细胞体外培养的影响因素及防控策略

摘要 动物细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术。近年来，动物细胞培养技术已从单纯的实验操作扩展到生命科学、生物医药学等多个学科的研究和生产领域，成为广泛采用的技术手段，许多生物技术科学研究都离不开细胞培养。本文从细胞培养的基本操作方法入手，介绍了动物细胞体外培养的主要影响因素，以及对细胞实验室无菌环境的防控策略。 关键词：细胞体外培养；影响因素；无菌环境；防控策略

目录 摘要 ................................................................................................................................................... I 1引言 .. (1) 2基础理论概述 (1) 2.1细胞培养的概念 (1) 2.2原代细胞培养的概念 (1) 2.3传代细胞培养 (2) 3影响细胞体外培养的因素 (2) 3.1细胞分离方法 (2) 3.1.1直接分离法 (3) 3.1.2酶消化法 (3) 3.2细胞培养温度 (3) 3.3细胞培养基的成分 (3) 3.3.1天然培养基 (3) 3.3.2合成培养基 (3) 3.4接种密度 (4) 3.5培养基的pH值 (4) 3.6细胞的冻存与复苏 (4) 3.6.1细胞冻存 (4) 3.6.2细胞复苏 (5) 4细胞实验室无菌环境的防控策略 (5) 4.1无菌室的彻底消毒 (5) 4.2培养用品的清洗和消毒灭菌 (6) 4.2.1清洗 (6) 4.2.2消毒灭菌 (6) 4.3培养试剂的分装与保存 (7) 4.4对操作者的要求 (7) 5结语 (8) 参考文献 (9) 致谢 (10)

细胞培养基本方法.docx

1?操作台基本要求: S ii. ??*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋￡丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-??' 上豹品矿播班苗 2?随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。 3.细胞污染： (1)细菌污染 A S 佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ??tfΛ?t i li??- 1EfeS??T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ??S?????^ffi?1但是?

(2)酵母污染 阴站.M栢差圉煙昱示J?壁增齐的23」迄無蛍醉母污果?陌集的H*??ffl胞呈髓兀电貶也??!???生屮转Ke e JH* I (3)霉困污染 初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。 (4)病毒污染 一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。 (5)支原体污染 唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显 影 4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出 5 ?适合贴壁的细胞和悬浮的细胞

6.基础培无血清培养基 7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱 （pH747?7） Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长 8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳 昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C） 9.动物细胞形态划分： 成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态： I型有长突触 U型没有轴突 10.细胞增长模式

成骨细胞培养

成骨诱导液： 地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C， OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphate PG(磷酸甘油)和Vc配好放四度， Vc尽量分装保存，减少与空气接触， 三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配 成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。 成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过 程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。 成骨细胞鉴定：

活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。核固红复染细胞核，自然干燥后中性树胶封固。 阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位。 ? 茜素红染液 操作 1. 成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用 1×PBS冲洗 1-2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。 2.吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1 mL茜素红染液染3-5 min。 3.吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2-3次。 4. 将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

细胞培养方法

细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。

体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术 ●体外细胞培养条件和基本技术 ●体外细胞培养 ●体外培养物的生长生物学 ●细胞系和细胞株 ●培养物的冷冻与复苏 ●培养物的污染、检测和排除 ●一、体外细胞培养条件和基本技术 体外细胞培养的优缺点 优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。 体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。 一、体外细胞培养条件 （一）、体外培养实验室 1. 准备室 2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。 3. 缓冲室 4. 其他实验室 （二）、体外培养的设备和器具 设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值 3. 倒置显微镜 4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器， 超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置 8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平 培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器， 针头式加压塑料小滤器 2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿 （4）多孔培养板（5）离心管 3. 移液器 4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网 （三）培养用液 ?水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS) 水：离子交换水，蒸馏水 平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖 常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks ?培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液 2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等

皮肤细胞培养影响因素的探究

皮肤细胞培养影响因素的探究 陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀 （1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062； 2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；） 指导老师：吴民耀副教授 【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。 【关键词】：大鲵干细胞培养 1.皮肤类干细胞的来源 目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。 Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。 2.皮肤类干细胞的生物学特性 目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。 表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其

浅谈体外培养成骨细胞

浅谈体外培养成骨细胞 张杰 （陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000） 【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。 【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素； 成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。 1 成骨细胞的来源 国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。近年来对脐血干细胞的研究越来越多。并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。此外Wan等渴。报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。 2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液

细胞培养中常见的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下: 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。 6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所

细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法

细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法 细胞培养中常见的污染情况总结如下: 常见的污染如下： 1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。 仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！ 可在培养液中加相应的抗生素处理 2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差， 用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。 预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作 3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。 用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用的抗生素的话, 建议用8ug/ml的浓度。 4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。 5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

细胞培养常见问题的原因及对策

细胞培养常见问题的原因及对策细胞培养中的注意事项 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 %或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。 9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？ 一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。 10 悬浮性细胞应如何继代处理？ 一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。

动物细胞培养常用方法

一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度

细胞培养复习题(含答案)

1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型 ⑴按生长方式分为二型： 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。） ⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞 2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程 ⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段： ①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。 ②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。 ③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。 以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。 ⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度限制 3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.

胚胎干细胞体外培养

胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs