凝胶色谱法

凝胶色谱法

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凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。

凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

凝胶色谱法-分类

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定

高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶渗透色谱技术原理

凝胶色谱法-分子筛效益

一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同

的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗

粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在

凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过

程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分

子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后

流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔

的凝胶就是分子筛。

各种分子筛的孔隙大小分布有一

定范围，有最大极限和最小极限。

分子直径比凝胶最大孔隙直径大

的，就会全部被排阻在凝胶颗粒

之外，这种情况叫全排阻。两种

全排阻的分子即使大小不同，也

不能有分离效果。直径比凝胶最

小孔直径小的分子能进入凝胶的

全部孔隙。如果两种分子都能全

部进入凝胶孔隙，即使它们的大

小有差别，也不会有好的分离效

果。因此，一定的分子筛有它一

定的使用范围。

在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，

完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应

的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变

凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，

在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而

分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小

的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分

子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种

网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过

凝胶床时，按照分子量大小排队，凝胶表现分子筛效应。

凝胶色谱法-凝胶种类及性质

（一）聚丙烯酰胺凝胶

为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎

或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种

型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝

胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由日本tosoh

的TSKGEL的pw系列，适合蛋白和多糖的纯化。即丙

烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺，在催化剂过硫

酸铵作用下聚合形成凝胶。

聚丙烯酰胺（PAM，polyacrylamide）

聚丙烯酰胺简称PAM，分子量100～500万。聚丙烯

酰胺主要有两种商品形式，一种是粉末状的，另一种

是胶体，还有聚丙烯酰胺乳液 (上海合成树脂研究所

研制) 。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯

酰胺当浓度超过10％以后．就会形成凝胶状结构。

提高温度可以稍微促进溶解，但温度不得超过50℃，

以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过120 ℃时分解。中性，无毒。用作增稠剂、

絮凝剂、减阻剂，具有凝胶、沉降、补强等作用。贮存于阴凉、通风、干燥的库房内，防潮、

避光、防热。存放时间不宜过长。

（二）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）

⑴ Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表

示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，

同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，

G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

⑵ Sephadex LH-20，是Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离

不溶于水的物质。

（三）琼脂糖凝胶

琼脂糖 Agarose ，缩写为 AG ，是琼脂中不带电荷的中性组成成份，也译为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由β-D-吡喃半乳糖 (1-4) 连接3,6-脱水α-L-吡喃半乳糖基单位构成。 把琼脂糖，即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂，溶于热水，冷却制成的凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用sephadex 不能分级分离的大分子的凝胶过滤，若使用5％以下浓度的凝胶，也能够分级分离细胞

颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点，有时用它代替琼脂、以作为免疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物。

琼脂糖凝胶商品名很多，常见的有，Sepharose （瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A （美国，Bio-Rad ）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用

（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。 （四）聚苯乙烯凝胶

商品为Styrogel ，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。

凝胶色谱法-填料合成技术

凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面：填料的微球化、窄粒度分布多孔硅微球的合成成功、小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微球表面化学改性的发展。近年来在这方面有较多的新产品，中国也有许多单位在研制和生产。高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面。

高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外，对粒度分布也要求相当窄。用一般的制备方法往往得到粒度较宽的产品，需要进一步过筛。当填料的粒度在30微米以下时，这种过筛非常困难，已经成为填料制备上一个较大的技术难关。Kirkland ，最近利用了尿素和甲醛在酸性介质中形成大小均匀的液体高聚物，加入某种硅溶胶时，硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚。最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到

由微粒硅珠堆积而成的多孔填料。这种堆积硅珠是球形的，粒度分布很窄，填料的孔径决定于原始硅溶胶的规格，用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料。柴志宽等则利用一种硅胶制成粒度分布窄的填料后，再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填料。从这些方法制得的微球填料，粒度分布可以达到相当窄，所以可以不经筛选直接使用。

随着进样技术和色谱柱接头设计的改进，现在已经可以得到柱效每米在八万到十万的凝胶色谱填料。Wheals 用四种GPC 用的微球硅胶装填色谱柱，都能达到每米八万到十万块塔板数的高效。他用这种色谱柱有效地进行了案件侦查中所要求的分析问题。

四种多孔硅胶的理论塔板数

凝胶色谱法-实验技术

（一）层析柱

层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5：1─10：1，

凝胶色谱图

凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20：1─100：1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。 （二）凝胶的选择

根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G ─200吸水后形成的凝胶体积约40ml 。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的Sephadex G-200效果好，脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。 （三）凝胶的制备

商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完

成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 （四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，

如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml ），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶

床的20-30％。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。 （五）防止微生物的污染

交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有： ⑴ 叠氨钠

在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶于水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 ⑵ 可乐酮

在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。 ⑶ 乙基汞代巯基水杨酸钠

在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。 ⑷ 苯基汞代盐

在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、

硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

凝胶色谱法-高效凝胶色谱

在整个液体色谱领域里，高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常迅速的。这是由于色谱理论、填料制备技术和仪器合理设计三方面联合发展的必然结果。凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说，又是一次意义较大的进展，因为凝胶色谱虽然具有许多优点，但是它一直被认为是一种分离效率比较低、色谱柱的峰容量小和速度慢的技术。在广泛的非高分子化合物领域中没有得到应有的使用。

在经典的凝胶色谱中，填料的粒度一般用37-75 μ。色谱柱长12尺以上，柱径7.8毫米，流速通常用1毫升/分。在这些条件下，一次实验时间往往需要三小时。加快流速会降低分离效率，因为凝胶色谱是一个由扩散控制的分离过程，高分子在溶液中扩散较

慢，这就必然使流速受到一定限制。凝胶色谱峰容量较小的原因是和体积排除的分离机理有

关。这些缺陷的克服都有待于填料柱效的大幅度提高。高效凝胶色谱填料的合成成功以及高

效装柱技术的发展，实现了柱效的提高，从而实现了实验时间缩短，峰宽变窄和峰容量增加。

现在粒度为10 μ的填料可以使分子量分布测定时间从三小时缩短到十几分钟，这个时间甚

至比高分子在溶剂中溶解所需的时间还短。在工业上已有人用凝胶色谱图来作为订购验收指

定分子量分布的高聚物产品。由于不需要费太多时间来做条件试验，凝胶色谱在一般化合物

领域里应用时的方便程度已可以和其他类型高效液体色谱相竞争。

凝胶色谱法-研究动向

最近凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的，其中仪器、填料、联用技术、色谱理论等方面

的进展是和整个液体色谱的进展

意义较大，值得注意。

通过与其他仪器联用，解决凝胶

色谱法测定高聚物分子量分布从

相对法向绝对法过渡。测定高聚

物分子量分布是凝胶色谱最重要

的应用。试样先根据分子体积(即

分子量)分离后再检测各组分的

分子量及含量。在凝胶色谱中试

样的分离是在色谱柱中进行的，

被分离后的组分在流出柱子时就

同时连续地用浓度检测器和分子

量检测器分别检侧各组分的浓度

和分子量，把两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱曲线。

过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器，因而利用一组不同分子量的标样来标定

色谱柱，然后从分子量淋出休积的标定曲线来作数据换算。这种用相对方法来检测分子量虽

然暂时解决了问题，但是随之而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。实验

数据的可靠性在很大程度上决定于标定曲线、标样分子量数值以及数据处理方法的可靠性。

其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正，不但实验方法比较烦琐，而且

数据处理也比较复杂，需要用电子计算机来计算。所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较

满意的计算方法，但这总不是一个根本解决的方法。只有真正找到绝对分子量检测器，问题

才算较好解决。原有的许多分子量测定方法，由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成功

地在凝胶色谱上应用。

最近Ouano 用激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的结果。实验数据不需要标定曲线，也不必进行峰加宽改正。

由于激光的准直性较好，强度较大，可以允许在较小的角度下测量较稀溶液的散射光强，由此可以直接计算出重均分子量的近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零作双外推。实验上，凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后，还可与计算机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后，

所需要的数据可全部立即取得。GPC-LALLS 似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商品化，预计不久将会有更多的研究工作，来说明已经在何种程度上解决了凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。

凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节，继续在寻找更理想的检测器。目前最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检测器。

最近Hoffmann 和Urban 用自动浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定效果，特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布，效果比较显著。Jorgenson 等用光散射法侧定淋出溶质的沉淀，也证明是一个较灵敏的方法。Francois 等用密度计来检侧浓度，提供了另一条通用性检测器的途径。其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联

用。随着应用的扩大，凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的支化度。

凝胶色谱法-相关词条

分子排阻色谱法，凝胶过滤色谱，凝胶渗透色谱，分子筛效应，塔板数，塔板理论，层析柱，琼脂，电泳，填料，联用技术，色谱理论，生物化学，示差折光检测器，紫外检测器。

凝胶色谱法-参考文献

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色谱分析法基本原理

色谱分析法基本原理 色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子 交换色谱与排阻色谱等方法。 吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。 分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。 离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而 使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。 排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小 的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。 色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。 分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸 色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处的各种检测器检测。柱色谱还可分部收集流出液后用适宜方法测定。柱色谱法 所用色谱管为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤 维塞住，管内装有吸附剂。色谱柱的大小，吸附剂的品种和用量，以及洗脱时的流速，均按各单体中的规定。吸附剂的颗粒应尽可能保持大小均匀，以保证良好的分离效果，除另有规定外通常多采用直径为0.07-0.15mm的颗粒。吸附剂的活性或吸附力对分离效果有影响，应予注意。 吸附剂的填装干法：将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用的流动相，或将色谱管下端出口加活塞，

凝胶色谱法

凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高 分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分 子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级 分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生 物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学 以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学 实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶 性的大分子，如多糖类化合物。 凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱 溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶 剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、 聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯 酸甲酯等) 相对分子质量分布分 析及分离，常用的凝胶为交联聚 苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋 喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。 凝胶色谱系统 凝胶色谱仪

凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这 种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 凝胶色谱法原理 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小

色谱法的分类及其原理

色谱法的分类及其原理 （一）按两相状态 气相色谱法:1、气固色谱法 2、气液色谱法 液相色谱法:1、液固色谱法 2、液液色谱法 （二）按固定相的几何形式 1、柱色谱法(column chromatography) ：柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法 2、纸色谱法（paper chromatography）：纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及大小进行定性和定量分析。 3、薄层色谱法(thin-layer chromatography, TLC) ：薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的方法操作以达到分离目的。 （三）按分离原理 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不同，又可将其分为：

1、吸附色谱法：利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。 2、分配色谱法：利用固定液对不同组分分配性能的差别而使之分离的色谱法称为分配色谱法。 3、离子交换色谱法：利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法，利用被分离组分与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。 4、尺寸排阻色谱法：是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法，体积大的分子不能渗透到凝胶孔穴中去而被排阻，较早的淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本按其分子大小先后排阻，从柱中流出。被广泛应用于大分子分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。 5、亲和色谱法：相互间具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性，使成分与杂质分离的色谱法。例如利用酶与基质（或抑制剂）、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质之一方与不溶性担体形成共价结合化合物，

凝胶色谱法

凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。 凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 凝胶色谱法-分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定 高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。 近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶渗透色谱技术原理 凝胶色谱法-分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同 的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗 粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在 凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过 程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分 子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后 流出，分子最小的最后流出，这Array种现象叫分子筛效应。具有多孔 的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一 定范围，有最大极限和最小极限。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大 的，就会全部被排阻在凝胶颗粒 之外，这种情况叫全排阻。两种 全排阻的分子即使大小不同，也 不能有分离效果。直径比凝胶最 小孔直径小的分子能进入凝胶的 全部孔隙。如果两种分子都能全 部进入凝胶孔隙，即使它们的大 小有差别，也不会有好的分离效 果。因此，一定的分子筛有它一 定的使用范围。 在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大， 完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应 的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变 凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子， 在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而 分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小

液相色谱仪结构及原理

液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液—固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：

影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法

影响凝胶色谱的分离的因素及其改进方法 吴承志张宁封树林孙振鹏 （西南大学药学院，重庆，400716） 摘要：凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。 关键词：凝胶色谱；影响因素；填料；改进方法 Influence factors of the separation gel chromatography and improving methods Wu chengzhi Zhang ning Fengshuling Sun zhenpeng （College of Pharmaceutical Sciences, Southwest University, Chongqing 400716） Abstract:Gel chromatography was developed in the early sixties a quick and simple separation techniques, because the equipment is simple, easy to operate, does not require organic solvents, the polymer material has a high separation efficiency. Also known as gel permeation chromatography molecular exclusion chromatography. GPC is mainly used for classification of polymer molecular weight and molecular weight distribution of the test. Has now been biochemistry, molecular biology, biological engineering, medicine, molecular immunology and related fields widely used, not only used in scientific experimental research, and has a large scale for industrial production. Keywords: gel chromatography; Influencing factors; Packing; Improvement methods 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。用于

凝胶色谱法要点

简介 凝胶色谱技术是上世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域被广泛采用，工业生产上也有非常广泛的应用。 一、分离原理　 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量

色谱分析基本原理..

一、色谱分析法基本原理 色谱法，又称层析法。根据其分离原理，有吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等方法。吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换势不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。色谱法的分离方法，有柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。色谱所用溶剂应与试样不起化学反应，并应用纯度较高的溶剂。色谱时的温度，除气相色谱法或另有规定外，系指在室温下操作。分离后各成分的检出，应采用各单体中规定的方法。通常用柱色谱、纸色谱或薄层色谱分离有色物质时，可根据其色带进行区分，对有些无色物质，可在245-365nm的紫外灯下检视。纸色谱或薄层色谱也可喷显色剂使之显色。薄层色谱还可用加有荧光物质的薄层硅胶，采用荧光熄灭法检视。用纸色谱进行定量测定时，可将色谱斑点部分剪下或挖取，用溶剂溶出该成分，再用分光光度法或比色法测定，也可用色谱扫描仪直接在纸或薄层板上测出，也可用色谱扫描仪直接以纸或薄层板上测出。柱色谱、气相色谱和高效液相色谱可用接于色谱柱出口处

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.

凝胶层析综述

凝胶层析技术的研究及应用 本文综述了凝胶层析的原理及其相关的参数和类型，以及在实际操作过程中的注意事项。并讲述了凝胶层析的一般应用。 凝胶层析 ( gel chromatography ) 又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤的等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。 1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物—交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964 年，Moore 制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂) 。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 1 、凝胶层析原理、 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。 比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，经历的流程短，流动速度快，先流出；而较小的分子可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，最后流出；分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶

层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 2、凝胶层析相关系数、 2.1外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。 而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。 2.2分配系数分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。 2.3排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。 2.4分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75 对球形蛋白的分级分离范围为3,000 －70,000 ，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75 得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。 2.5吸水率和床体积吸水率是指1g 干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g 干的凝胶吸水后的最终体积。

凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱法（GPC） 一、凝胶渗透色谱 凝胶渗透色谱Gel Permeation Chromatography（GPC)，一种新型的液体色谱，原理是利用高分子溶液通过一个装填凝胶的柱子，在柱子中按分子大小进行分离。 柱子为玻璃柱或金属柱，内填装有交联度很高的球形凝胶。其中的凝胶类型有很多，都是根据具体的要求而确定（常用的有聚苯乙烯凝胶）。然而，无论哪一种填料，他们都有一个共同点，就是球形凝胶本身都有很多按一定分布的大小不同的孔洞（见图1）。 图1 GPC分离原理 不仅可用于小分子物质的分离与鉴定，而且可作为用来分析化学性质相同但分子体积不同的高分子同系物。可以快速、自动测定高聚物的平均分子量及分子量分布。现阶段，已经成为最为重要的测定聚合物的分子量与分子量分布的方法。 二、测定原理 凝胶色谱法的固定相采用凝胶状多孔性填充剂，是根据样品中各

种分子流体力学提及的不同进行分离的。比凝胶孔径大的分子完全不能进入孔内，随流动相沿凝胶颗粒间流出柱外，而娇小的分子则可或多或少地进入孔内。因此大分子流程短，保留值小；小分子流程长，保留值大，所以凝胶色谱是按分子流体力学体积的大小，从大到小顺序进行分离的。（见图2） 图2 GPC淋出曲线 溶质分子的体积越小，其淋出体积越大，这种解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶质在流动相和固定相中的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸决定，分离完全是由于体积排除效应所致。 凝胶色谱的特点是样品的保留体积不会超出色谱柱中溶剂的总量，因为保留值的范围是可以推测的，这样可以每隔一定时间连续进样而不会造成谱峰的重叠，提高了仪器的使用率。 三、分子量校正曲线（LogM-V曲线） 凝胶色谱图计算样品的分子量分布的关键是把凝胶色谱曲线中的淋洗体积V转化成分子量M，这种分子量的对数

凝胶层析实验步骤及细节

温州大学第四届生物学科实验技能大赛 血清凝胶层析 实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告 实验时间： 5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。 实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具 实验后：清理实验器具 凝胶层析的实验步骤

实验试剂和用品 1. 试剂 Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水 2. 主要实验用具 铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒 凝胶层析定义 凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 实验原理 不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝胶柱的制备 在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。

色谱法分离原理教案

第十四章色谱法分离原理 一．教学内容 1.色谱分离的基本原理和基本概念 2.色谱分离的理论基础 3.色谱定性和定量分析的方法 二．重点与难点 1.塔板理论，包括流出曲线方程、理论塔板数(n)及有效理论塔板数 (n e f f)和塔板高度(H)及有效塔板高度(H e f f)的计算 2.速率理论方程 3.分离度和基本分离方程 三．教学要求 1.熟练掌握色谱分离方法的原理 2.掌握色谱流出曲线（色谱峰）所代表的各种技术参数的准确含义 3.能够利用塔板理论和速率理论方程判断影响色谱分离各种实验因素 4.学会各种定性和定量的分析方法 四．学时安排4学时 第一节概述 色谱法早在1903年由俄国植物学家茨维特分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有

碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义.但仍被人们沿用至今。 在色谱法中，将填入玻璃管或不锈钢管内静止不动的一相（固体或液体）称为固定相；自上而下运动的一相（一般是气体或液体）称为流动相；装有固定相的管子（玻璃管或不锈钢管）称为色谱柱。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。 从不同角度，可将色谱法分类如下： 1.按两相状态分类 气体为流动相的色谱称为气相色谱（G C） 根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的 一薄层有机化合物液体），又可分为气固色谱（G S C）和气液色谱（GL C）。液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（L SC）和液液色谱（L LC）。超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色谱（SF C）。随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱（CB PC）. 2.按分离机理分类 利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。 利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。 利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。

凝胶渗透色谱分析的工作原理

SEC/GPC 凝胶渗透色谱分析的工作原理 PS-OBG 用作尺寸排除色谱（size exclusion chromatography ，又称凝胶渗透，gel permeation chromatography ）测量大分子分子量时的标准样品。 首先介绍尺寸排除色谱（SEC/GPC ）的工作原理： 如图三所示，红色和紫色两种颗粒代表不同尺寸的两种高分子，蓝色月牙形颗粒代表色谱柱内的填料。通常色谱柱填料是经过设计的具有不同孔径的高分子凝胶珠。当红色和紫色的高分子进入色谱柱以后，以一定速度流动的流动相在不停地冲洗色谱柱的同时，带动高分子颗粒在色谱柱内的移动。当高分子与凝胶珠填料接触时，尺寸大的高分子不能进入凝胶珠填料的孔，如图三中红色的大分子。所以红色的大分子在流动相的冲洗下先流出色谱柱。而紫色的尺寸较小的高分子可以进入凝胶填料珠的小孔，好像暂时被填料保留住了一样，最后由于流动相不停的冲洗，紫色高分子也会流出色谱柱，但是流出的时间较红色分子长了很多。图三右下方给出红色高分子和紫色高分子的凝胶色谱图，横坐标为保留时间，可以看出红色高分子的保留时间明显小于紫色高分子，这说明红色高分子分子量较大，比紫色高分子先流出色谱柱。 色谱柱的工作原理告诉我们，尺寸排除色谱可以将尺寸不同的高分子按照保留时间分开。保留时间越小的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越短的高分子）的分子量越大，相反，保留时间越大的高分子（也就是流经色谱柱需要时间越长的高分子）的分子量越小。

懂得了这个原理，我们就可以用SEC/GPC来测分子量了！ 但是，如何根据保留时间来确定高分子的分子量呢？也就是说，怎么将不同的保留时间与分子量一一对应起来呢？这时我们需要制定一条标准工作曲线。标准工作曲线的目的是建立保留时间和分子量的关系，当我们用SEC/GPC测定了一个未知的高分子，得到这个高分子的流出时间（保留时间），有了工作曲线，我们就可以很快知道这个未知高分子的分子量。 标准工作曲线的制定 标准工作曲线由一系列分布很窄，分子量已知的高分子标样做出，同时标样的结构和分子链的构象要与未知高分子尽可能的接近。 1．首先选用与被测样品类型相似的单分散性(d≤1.1)标样。先用其他方法精确测定其绝对分子量（百特纯使用激光光散射的方法测得PS-OBG的绝对分子量）。 2．然后将PS-OBG标样进行SEC/GPC分析，得到每个窄分布标样的峰位淋洗体积(V e),也就是每个标样在色谱柱内的保留时间 流速。 3．以V e为X轴，logM为Y轴作图，这样就可以得到校正曲线。 式中,A,B为常数，A表示排斥极限, B表示渗透极限4．将待测高分子进行SEC/GPC分析，得到待测高分子的峰位淋洗体积V’。 在标准曲线上将V’推回Y轴得到logM’，此M’即为待测高分子的分子量。 百特纯大分子（武汉）科技有限公司是由供职于加拿大联邦政府农业部国家实验室科学家及其他投资人共同创办。目前主要从事碳水化合物大分子领域新品研发及应用。百特纯的目标是向高等研究单位、院校提供高质量、高纯度、高均一性（极窄分子量分布），特定结构的医药及功能性碳水化合物大分子标准品及凝胶色谱标样,燕麦葡聚糖标样,1%精制燕麦OBG水溶液。

高效凝胶色谱法测定头孢呋辛酯及制剂中高分子杂质的含量

高效凝胶色谱法测定头孢呋辛酯及制剂中高分子杂质的含量 侯玉荣1，2，袁耀佐2*，张玫2，钱文2，杭太俊1* （1．中国药科大学，南京210008；2．江苏省食品药品检验所，南京210008） 摘要目的：采用聚苯乙烯高效凝胶色谱法检查头孢呋辛酯中的高分子杂质。方法：色谱柱为MKF－GPC－100聚苯乙烯凝胶色谱柱（7.8mm?100mm，8μm），流动相为水－甲醇（10?90），流速为0.5mL·min－1，检测波长为278nm；通过HPLC－ESI－MS2法鉴定高分子杂质峰，并对其结构进行推定。结果：头孢呋辛酯在0.5 1500μg·mL－1的浓度范围内，面积与浓度呈良好的线性关系（r=1.000）；最小检出浓度为0.2μg·mL－1；高分子杂质与头孢呋辛酯峰能有效分离，并先于主峰流出，方法专属性良好；高分子杂质在溶液中不稳定，样品需要临用现配。结论：建立的方法快速准确，适用于酯溶性头孢呋辛酯及其制剂中高分子杂质的测定。 关键词：高效凝胶色谱；聚苯乙烯凝胶；头孢呋辛酯；高分子杂质；β－内酰胺类抗生素；过敏原 中图分类号：R917文献标识码：A文章编号：0254－1793（2012）02－0267－06 Determination of high molecular mass impurities in cefuroxime axetil and it's preparation by polystyrene－based gel filtration chromatography HOU Yu－rong1，2，YUAN Yao－zuo2*，ZHANG Mei2，QIAN Wen2，HANG Tai－jun1* （1.China Pharmaceutical University，Nanjing210008，China；2.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing210008，China） Abstract Objective：To determinate the high molecular mass impurities in cefuroxime axetil by polystyrene－based gel filtration chromatography．Method：A MKF－GPC－100（7.8mm?100mm，8μm）column was adopt with the mobile phase consisting of water－methanol（10?90），at a flow rate of0.5mL·min－1，and the detection wavelength was at278nm，to identify the impurities by HPLC－ESI－MS2．Result：The calibration curves for cefu-roxime axetil in the range of0.5－1500μg·mL－1was linear（r=1.000），the detection limit was0.2μg·mL－1；the peaks before cefuroxime axetil in the chromatogram were high molecular mass impurities，the resolution between cefuroxime axetil and high molecular mass impurities was good．The high molecular mass impurities is instable in so-lution，and the test solution should be prepared immediately before use．Conclusion：The established method is fast for analysis and good for precision，it's suitable for determinate the high molecular mass impurities in liposoluble drug cefuroxime axetil and it's preparation． Key words：HPSEC；polystyrene gel；cefuroxime axetil；high molecular mass impurities；beta－lactam antibiotics；al-lergen β－内酰胺类抗生素常见的不良反应是速发型过敏反应，多年来的研究已证明引发过敏反应的过敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子杂质［1，2］。药品中的高分子杂质是对其中相对分子质量大于药物本身的杂质总称，其来源通常被分为2类，即外源性杂质（来源于发酵工艺的蛋白、多肽、多糖等结合物）和内源性杂质（抗生素药物自身的聚合产物，可以在生产、储存过程中形成，也可以在使用时产生）。随着现代生产工艺不断的改进和提高，外源性杂质日趋减少，而对内源性杂质的控制是当前抗生素高分子杂质控制的重点［3，4］。统计数据证明药品中高分子杂质的含量直接影响过敏反应发生率［5］，因此国内外对β－内酰胺类抗生素的高分子杂质的控制非常重视。 美国药典（USP）23版曾对头孢他啶中的高分子杂质进行控制，由于β－内酰胺类抗生素的高分 *通讯作者袁耀佐Tel：（025）86631609；E－mail：yuanyaozuo@yahoo．com．cn 杭太俊Tel：（025）83271090；E－mail：tj_hang@yahoo．com．cn