DNA定点突变实验具体步骤及详细说明

DNA定点突变实验具体步骤及详细说明

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。

一、引物设计

每条引物都要携带有所需的突变位点，引物一般长25~45 bp，设计的突变位点需位于引物中部。

二、反应

1. 使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。

2. 反应体系：

（1）10x pyrobest Buffer：5 ul

（2）dNTP Mixture(10 mM) ：1 ul

（3）模板DNA(5~50 ng) ：1ul

（4）primer 1 (125 ng) ：1 ul

（5）primer 2 (125 ng) ：1 ul

（6）pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5 U/ul)：0.25 ul

（7）加无菌蒸馏水至50ul.

三、产物沉淀纯化

1. 加1/10 体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上（或-20℃冰箱）5min，离心弃上清。

2. 70~75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中（此步可省略，直接用DpnI 酶切）。

四、DpnI酶切

1. 酶切体系

（1）Buffer ：2 ul

（2）BSA（100x）：0.2 ul

（3）DNA ：x ul

（4）DpnI：0.5 ul

（5）加无菌去离子水至20 ul。

2. 30℃酶切1~4 h。

3. 65℃水浴15min 终止反应。

五、转化

将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株，利用抗生素筛选突变子。

六、测序验证

注意事项

1. 引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

2. Quick change试剂盒分为几种不同的类型，QuikChange?、Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒、QuikChange?、XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒（>8kb）从原理上是一样的，只是PCR的酶和BUFFER不一样，后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了，没什么特别的东西。

3. DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

4. 实验板长出来的菌有两种可能，一种是质粒DPNI没处理干净长出来的（模板），一种是PCR产物转化出来的（突变体），不过这两种菌长得一模一样，即使提出质粒来也是一样（酶切和PCR都无法区分），除了测序，是分不出来的。

5. 做PCR时也最好做一个负对照（不加引物），实验管由于PCR时有引物，所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PCR产物，而对照管由于PCR时没放引物，所以在DPNI处理前里面只有模板。如果两者都拿去DNPI处理，就能够证明模板已经被去除干净。若实验顺利的话应该是：正对照长菌负对照不长菌。如果出现正负对照都长菌，那么就是DpnI没处理好，如果正负对照都不长菌，那么有两种可能，一种是PCR阴性，也就是说PCR出问题了，另外一个可能就是转化出问题了。要搞清楚是哪个问题，跑胶说明不了问题，那

就做个转化的对照，拿试剂盒的对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

经验

一、经验分享

1. 实验的目的应该比较明确吧：就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：

第一：我们吊出来的基因有点突变，相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来，并装进了自己的载体，却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配，然后暴昏。

大家实验室里面还是用Taq酶为主吧，Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧，Taq酶的优点和缺点都很明显：优点就是扩增效能强，缺点就是保真性差，其错配机率是比较高的，相关数字忘了，大家可以去网上查那个数字，不过感觉如果是2000bp的基因，如果扩四五十个循环的话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。

第二：要研究基因的功能，在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列，或者改造成不同的亚型，总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要，相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。

对于第一种情况：我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要，大可不必管它，比如说是三联密码子的最后一位，碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变，那么一般情况下也可以不去理它。另外，在NCBI上人类的基因的版本一直在变化，也就是说同一个基因有不同的版本，或者称不同的亚型，其碱基序列有些许的差异，只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱，那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了，不过最好换个保真性好一点的酶如PFU，或者PCR循环数低一点，不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。

对于第二种情况：这种情况下一般也就只能做定点突变了。

接下来开始聊一聊定点突变的原理吧，那个Stratagene试剂盒！上面有一个说明书，说得好像很正规，不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话，看都不看，我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

2. 大家马上就会想到几个问题了：

第一：引物怎么设计呢？

第二：模板怎么去掉呢？

第三：怎么拿到质粒呢？

对于第一个问题：怎么设计引物？

我只能讲一些原则，并举一些例子。

引物设计的原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：

不过这种突变引物要加上一个原则：

一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12base pair。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个base pair，并且合成多一条反向互补的引物。

这么说大家可能不是很清楚，那我就举个例子吧：

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGA GGAATTCCAG 960

现有序列TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGA GGAATTCCAG 924

*********************************************** ************

|------>deletion

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAG TGTAGGAGAT 1020

现有序列AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAG TGTAGGAGAT 984

************************************************************

（上面为目的序列，下面为现有序列：我们发现有一个A碱基的缺失，其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配）

我们以它为中心设计引物：两边各至少12个碱基，左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低，故拉长引物使GC%含量不至过低，也使引物退火温度升高。

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG

并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG

其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也是两边都有大于12个碱基，同时符合引物设计的原则就行了。

引物合成公司有很多家，大家可以去寻找，不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别，不过价钱一般都是一块多一个碱基，合成时间约为一周。

这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了，得到的PCR产物是一条链完整，另一链有缺刻的PCR产物

对于第二个问题：

怎么去掉模板呢？再简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不会那么凑巧吧，哈哈。

关于第三个问题：

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，呵呵，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序（这个就不用我多说了吧），验证突变结果，一般都没问题的啦，我做了几十个突变了，到目前为止还没有做不出来的，呵呵，不要砸我啊。

下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情：

1、根据现有基因设计引物；

2、合成引物并准备好模板；

3、PCR，

4、DpnI处理酶切产物；

5、转化酶切产物；

6、筛选阳性克隆；

7、送测序并测全长。

基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

重结晶和过滤实验

重结晶和过滤实验 一、实验目的 １、学习重结晶法提纯固态有机化合物的原理和方法； ２、掌握抽滤和热过滤操作的方法。 二、基本原理 固体有机物在溶剂中的溶解度一般是随温度的升高而增大。若把固体溶解在热的溶剂中达到饱和,冷却时由于溶解度降低,溶液变成过饱和而析出结晶.利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从饱和溶液中析出，而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤除去），从而达到提纯目的。 重结晶的一般过程:使待重结晶物质在较高的温度(接近溶剂沸点）下溶于合适的溶剂里；趁热过滤以除去不溶物质和有色杂质（可加活性炭煮沸脱色)；将滤液冷却，使晶体从过饱和溶液里析出，而可溶性杂质仍留在溶液里,然后进行减压过滤，把晶体从母液中分离出来;洗涤晶体以除去附着的母液；干燥结晶. 三、实验装置 热过滤装置减压过滤装置干燥装置 回流装置 四、实验仪器、器材及药品 １、仪器、器材: 250ml三角烧瓶球形冷凝管保温漏斗短颈玻璃漏斗 200mｌ烧杯表面皿玻璃棒布氏漏斗 吸滤瓶酒精灯电热套乳胶管 滤纸剪刀台秤药勺 2、药品: 乙酰苯胺水活性炭 五、实验步骤 称取 3。0ｇ粗乙酰苯胺加到２50ｍL三角烧瓶中,加入100mＬ水,安装回流冷凝管，加热至沸,保持沸腾2—3min,取下稍冷,加入０．2g活性炭，再加热５-１０ｍｉn，用热漏斗趁热过滤,

滤液用干净的200mＬ烧杯接收，静止自然冷却,乙酰苯胺充分结晶后进行冷的减压过滤(抽滤），压实滤饼。彻底抽干水分,干燥,称重。 六、注意事项 1．可在补加2０％的水时，一同加入活性炭。 2。热过滤时保温漏斗中的水一定要尽可能热,动作要快。 3。减压过滤滤纸事先要润湿，铺好滤纸后不能减压太大。在倒入滤液之前滤纸要紧贴漏斗底部,防止滤纸被压穿. ４。如果滤液已经冷却到室温，长时间静止仍然没有结晶出现,可以用玻璃棒搅拌之。 七、思考题 1。重结晶包括哪几个步骤？每一步的目的是什么? 答:（１）溶剂的选择 目的：以保证在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小。 (２）样品的溶解 目的:将粗产物用所选溶剂加热溶解制成饱和或近饱和溶液。【为了避免趁热过滤的困难,一般可比需要量多加1５～20%的溶剂】 (3）活性炭脱色 目的：活性炭脱色,趁热过滤除去不溶性杂质及活性炭。【活性炭的用量应视有色杂质的多少而定，一般为干燥粗品的１～5%】 （4)滤液的冷却 目的：冷却过滤液使结晶慢慢析出，而杂质留在母液中.【将热滤液静置使其慢慢冷却至析出晶体，然后可再用冷水冷至室温，这样所得的晶体纯度高。】 （5）抽滤晶体 目的：使晶体与母液分离,过滤时尽量抽干。 （6）洗涤晶体 目的:以除去晶体表面的母液。【母液中含有可溶性杂质】 (7）晶体的干燥 目的：以除去晶体表面的溶剂。【晶体干燥时,可根据晶体的性质选择合适的方法进行干燥。】 (8）熔点的测定 目的：确定重结晶所得产品是否合乎要求.若不合格，应进行第二次重结晶。 2。怎样选择重结晶的溶剂？ 答：(１)需查阅文献、化学手册;（2)需要采用实验的方法。 若杂质溶解度很大，可以留在溶液中，若杂质溶解度很小,可以留在残渣中。要求被提纯的物质在选择的溶剂中的溶解度随温度变化大,溶剂沸点不宜太高或太低，如果没有适合的单一溶剂时，可以选用混合溶剂。混合溶剂一般由两种能以任何比例互溶的溶剂组成，其中一种易溶解被提纯物质，另一种则难溶解。 3。重结晶的溶剂应符合什么条件? 答:在重结晶时选择合适的溶剂是非常重要的。否则,达不到纯化的目的,作为适宜的溶剂,要符合以下条件: (1）与被提纯的有机化合物不起化学反应; (2）在高温时被提纯的物质在溶剂中的溶解度较大,而在低温时则很小;

(3)理解基因突变的检测方法

第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：

第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素

定点突变技术——从单点突变到多点突变

定点突变技术——从单点突变到多点突变 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是我们在实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于我们了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因，相信大家也非常熟悉：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。 对于单点突变，Stratagene公司的QuikChange Site-directed Mutagenesis kit是不错的选择，通过巧妙设计，将质粒定点突变技术变得简单有效。准备突变的质粒必须是从常规E.coli 中经纯化试剂盒(Miniprep)或者氯化铯纯化抽提的质粒。设计一对包含突变位点的引物（正、反向），和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。另外由于Pfu聚合酶是公认的最好的高保真聚合酶之一，堪称高保真聚合酶的“黄金标准”，是Stratagene的看家之宝，能够有效避免延伸过程中不需要的错配。试剂盒采用的是低次数的循环延伸而非PCR，有助于减少无意错配。只需要一次酶切和转化，实验可以在一天完成。这个试剂盒适用于质粒大小不超过 8Kb的质粒。后来推出的QuikChange XL site-directed mutagenesis kit则是针对大于8Kb的质

粗盐提纯实验操作步骤

粗盐提纯实验操作步骤文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]

实验：除去硫酸铜粉末中的沙子 一、实验目的 1.掌握、过滤、蒸发等实验的操作技能． 2.理解过滤法分离混合物的化学原理． 3.体会过滤的原理在生活生产等社会实际中的应用． 二、实验仪器和药品 药品：CuSO 4，蒸馏水 器材：托盘天平(含砝码)，量筒，烧杯，玻璃棒，药匙，漏斗，滤纸，铁架台（带铁圈），蒸发皿，酒精灯，坩埚钳，胶头滴管，若干一样的小纸片，滤纸 三、实验原理 四、粗盐中含有泥沙等不溶性杂质，以及可溶性杂质如：CuSO4等．不溶性杂质可以用溶解、过滤的方法除去，然后蒸发水分得到较纯净的精盐． 五、实验操作步骤 1.溶解 2.用托盘天平称取2克CuSO 4 混合物（精确到0.1克）．用量筒量取5毫升水倒入烧杯里．用药匙取一匙粗盐加入水中，观察发生的现象．用玻璃棒搅拌，并观察发生的现象（玻璃棒的搅拌对粗盐的溶解起什么作用）．接着再加入粗盐，边加边用玻璃棒搅拌，一直加到粗盐不再溶解时为止．观察溶液是否浑浊． 3.2.过滤 4.按照化学实验基本操作所述方法进行过滤．仔细观察滤纸上的剩余物及滤液的颜色．滤液仍浑浊时，应该再过滤一次．如果经两次过滤滤液仍浑浊，则应检查实验装置并分析原因，例如，滤纸破损，过滤时漏斗里的液面高于滤纸边缘，仪器不干净等．找出原因后，要重新操作．

注意：一贴二低三靠 ①“一贴”是指滤纸折叠角度要与漏斗内壁口径吻合，使湿润的滤纸紧贴漏斗内壁而无气泡，因为如果有气泡会影响过滤速度． ②“二低”是指滤纸的边缘要稍低于漏斗的边缘，二是在整个过滤过程中还要始终注意到滤液的液面要低于滤纸的边缘。这样可以防止杂质未经过滤而直接流到烧杯中，这样未经过滤的液体与滤液混在一起，而使滤液浑浊，没有达到过滤的目的。 ③“三靠”一是指待过滤的液体倒入漏斗中时，盛有待过滤液体的烧杯的烧杯嘴要靠在倾斜的玻璃棒上（玻璃棒引流），防止液体飞溅和带过滤液体冲破滤纸；二是指玻璃棒下端要轻靠在三层滤纸处以防碰破滤纸（三层滤纸一边比一层滤纸那边厚，三层滤纸那边不易被弄破）；三是指漏斗的颈部要紧靠接收滤液的接受器的内壁，以防液体溅出。 3.蒸发 把得到的澄清滤液倒入蒸发皿．把蒸发皿放在铁架台的铁圈上，用酒精灯加热（图16）．同时用玻璃棒不断搅拌滤液．等到蒸发皿中出现较多量固体时，停止加热．利用蒸发皿的余热使滤液蒸干．

定点诱变技术解析

第三章DNA突变技术

?基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。 ?根据其特点可将基因突变技术分两大类： 1.位点特异性突变定点突变 2.随机突变表型筛选

?随机突变 易错PCR法(Error-prone PCR) ?降低一种dNTP的量（降至5％-10％）?加入dITP来代替被减少的dNTP ?缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ DNA Shuffling ?外显子、单基因和基因家族的重组装?随机引物延伸法 ?交错延伸法 ?定点突变 点突变——碱基删除、增补和替换

易错PCR(epPCR)

How DNA shuffling is done in the tube ?Random fragmentation of a pool of related genes; ?Self-priming polymerase reaction and template switching (causing crossovers); ? PCR amplification with primers of reassembled products How DNA shuffling works

Similar mutants generated by error-prone PCR, random and site-directed mutagenesis . ... .. ... ..Single gene shuffling library of point mutants Family gene shuffling library of chimeras Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences 一、单基因和基因家族的重组装

基因突变发现及其机理研究与应用

附件 中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A 基因突变发现及其机理研究与应用 一、项目基本情况 提名单位：昆明医科大学第一附属医院 主要完成人：曾云，张登峰，杨金荣，于明，邹阳，向国强，王燕梅 完成单位：昆明医科大学第一附属医院、中国科学院昆明动物 研究所、昆明医科大学 项目所属学科：医疗卫生 任务来源：国家自然科学基金委员会、云南省科技厅 学科分类名称：血液病学代码:320.2430. 所属国民经济行业：卫生和社会工作 计划名称和编号： 1.国家自然科学基金地区项目《血液肿瘤患者IDH1基因的突变及其致病机理研究》（81060046） 2.云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项项目《DNMT3A在IDH1致急性髓系白血病基因组高甲基化中的作用》（2014FB027） 项目研究起止时间：2011年至 2017年 成果最早应用时间：2013年 推广应用单位：全国省内外十三所医疗单位 二、项目简介

血液肿瘤在病因学、病理学以及临床表现上都存在差异，是一大类异质性疾病，这为患者临床确诊和对症治疗带来许多难题。血液肿瘤的发病机制是复杂的，其中遗传因素对血液肿瘤的发病起着重要的作用。该项目在国家自然科学基金等项目，共35万元科研经费支持下，通过在中国西南群体中完成“中国人群血液肿瘤患者IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变发现及其机理研究与应用”的系列工作，发现IDH1、IDH2、DNMT3A基因突变主要发生在急性髓系白血病(AML)患者，尤其是复发难治AML患者，其他恶性血液病中罕见突变；在机理研究中发现IDH1参与的传统通路HIF-1α信号和细胞内ROS可能没有参与IDH1 突变致血液肿瘤的过程，而DNMT3A可能参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。同时，该项目研究中取得了国际领先的“四个科学发现”，为这一类血液肿瘤患者的治疗提供新思路。该研究在国际上率先发现如下： 1.IDH1 p.I99M 与 IDH2 p.R140Q 突变同时出现在1例骨髓增生异常综合征(MDS) 转化而来的AML患者中，且该患者预后极差。 2.国际首次在NK/T淋巴瘤（鼻型）和外周T细胞淋巴瘤（非特异型）患者中检测到IDH1基因突变p.R132G、p.R132H，两例患者预后极差，提示IDH1的基因突变可能参与了部分非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人的发病，可能是其预后不良的一个指标。该研究发现为这类患者的治疗提供了新思路和方向。 3.在复发难治的Ph+的B-ALL患者中可检测到DNMT3A基因突变，且该患者预后极差。为这类患者的治疗提供了新思路，为可能的药物开发提供了新的靶点。 4.DNMT3A参与介导IDH1/2突变所致的基因组高甲基化。该研究将两种重要的血液肿瘤致病基因在功能上进行了关联，为下一步开

基因突变的教案Word版

课题《基因突变》

《基因突变和基因重组》 第一课时的教案 一、教学目标 知识方面 1.举例说明基因突变的特征和原因（B：理解） 2.说出基因突变的意义（A：了解） 能力方面 1．通过观察正常红细胞与镰刀型红细胞的结构特点，训练学生的观察和比较能力。通过发挥媒体的直观功效，培养学生的观察、探究能力。 2．通过利用学生生活经验的创设，结合新知识培养学生的类比迁移能力。 3．通过对镰刀型细胞贫血症病因的讨论分析，使学生通过“材料—比较—归纳”的方式来获得基因突变的概念并培养学生的合作交流能力。 情感态度与价值观方面 1．通过引导学生对镰刀型细胞贫血症病因的分析，让学生体验基因突变概念的形成过程。2．通过对基因突变原因及特点的逻辑论证过程，不但可以使学生懂得生物界丰富多彩的本质，还可以对学生进行辩证唯物主义的思想教育。 3．通过基因突变与生活的联系，使学生能形成关爱生命，热爱生命的态度。 二、教学重难点分析 1、教学重点： （1）基因突变的概念及特点 （2）基因突变的原因 2、教学难点 基因突变的概念和意义 三、教学设计思路 1.理论依据 （1）奥苏伯尔关于概念形成的学习理论 生物概念是人们对生物及生理现象本质特征的认识。正确的生物概念,既是生物学知识的组成部分,又为获得更系统的生物学知识奠定基础。奥苏伯尔认为学生获得概念主要有两条途径:概念形成和概念同化。概念形成:由学生从大量的同类事物或现象的不同例证中独立发现共同的本质特征,用归纳的方式抽取出一类事物的共同属性，从而获得某些概念。是获得概念的初级形式。概念同化:学生利用认知结构中原有的有关概念学习新概念的方式,是获得概念的主要形式。 生物学概念是生物学科思维的基本单位，是组成生物学学科知识的基本单位，概念教学是中学生物教学的主要内容。《基因突变和基因重组》这节课中的基因突变和基因重组就是遗传学中的两个重要概念，概念的形成是从感性认识上升到理性知识，将外部言语转化成内部言语的思维过程，所以在教学过程中要给学生提供丰富的感性材料，以进行观察、比较以及联系实际唤起学生原有的知识经验和生活体验学习，为进一步对原型的抽象和概括提供条件。由于学生头脑中没有用以同化基因突变这个新概念的相关知识，所以本节课关于基因突变的概念教学采用以概念形成方式进行教学。 （2）建构主义学习理论

过滤实验教案

安国市小营中学导学案 九年级学科化学设计人使用人使用日期 过滤浑浊天然水 实验目标： 1．了解过滤是使不溶性固体和液体分离的一种常用方法,了解过滤的适用范围和主要操作。 2.学习过滤操作步骤,分析过滤操作过程中应注意的问题,培养学生动手实验的能力。 重点：用过滤分离混合物的一般原理。 难点：过滤分离的操作方法及步骤。 实验过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤是最常用的混合物分离的方法。 讲授新课: 一、过滤 1.定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2.原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上， 从而使固体和液体分离。 3.实验仪器:铁架台(带铁圈),烧杯,漏斗,玻璃棒. 演示实验:浑浊天然水的过滤.

4.实验装置图： 5.注意事项: 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁; 二低：滤纸低于漏斗边缘(0.5cm)滤液低于滤纸边缘; 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁;玻璃棒靠在三层滤纸处; 烧杯紧靠在玻棒上倾倒液体. 讨论: 滤液浑浊的原因?

安国市小营中学学案 达标测评 1.过滤操作的要点：“一贴”“二低”；“三靠；； 2.活学活用：如图所示。 （1）该图进行的是操作。 （2）在此操作中玻璃棒的作用是, 滤纸的边缘要液面（填“高于”或“低于”），这主要是因为。 （3）该操作用于净水，可除水中杂质，如需要进一步使水净化，则可继续进行(填“吸附”或“蒸馏”)。 （4）操作过程中，他发现过滤速度太慢，产生的原因可能是 （5）过滤后，滤液仍然浑浊，其原因有哪些？ （6）改进后过滤，得到了澄清透明的水，他兴奋地宣布：我终于制得了纯水！对此，你有无不同看法？，理由是。若要制取纯水，还需采用的净化方法是3.某化学科技小组在实验室中对一烧杯浑浊的河水进行了简单净化。请完成操作中的有关问题： （1）先向烧杯中加入适量明矾粉末，这是利用明矾溶于水后生成的胶状物对杂质的________，使杂质________来达到净水的目的。 （2）再进行过滤液体： ①过滤操作所必需的仪器：________。 A.烧杯 B.酒精灯 C.铁架台（带铁圈） D.试管 E.玻璃棒 F.漏斗 G.托盘天平 H.蒸发皿 ②玻璃棒的作用是________________________________，玻璃棒下端接触的部分是________层滤纸处。 ③若滤液仍然浑浊，你认为其原因可能是_____________ _____________。 （3）再用活性炭除去水中的异味，这是利用了活性炭的________作用。 （4）最后进行蒸馏： ①蒸馏时加入沸石的目的是________________________；加热烧瓶，注意不要使液体沸腾得太剧烈，以防________________________________________。 ②所得蒸馏水是_____（填“硬水”或“软水”），检验的简单方法是_________

四、基因突变的作用机理

基因突变的作用机理 基因突变是由于DNA 分子中核苷酸序列的改变，随之基因作用改变，最后导致个体表型的改变。引起基因突变的理化因素很多，但每种诱变因素的诱变机理各有其特异性。 （一）紫外线诱变机理 紫外线的波长范围是136?390nm ,其中对诱变有效的范围是200? 300nm ，而260nm 效果最好，它能使原子中的内层电子提高能量，而成为活化分子，由于紫外线带有大约3?5ER 的能量（能量很少，穿透力弱不足以引起物质的电离，属非电离射线），它足以引起一个分子中某些化学键发生断裂、交联而产生化学变化，其主要效应是形成胸腺嘧啶二聚体。 DNA 中嘧啶对紫外线诱变的敏感性要比嘌呤大10 倍左右，常见T—T 二聚体以共价键在相邻的二个碱基间联结而成的嘧啶二聚体，是发生在DNA 的同一条链上的两个相邻的胸腺嘧啶残基间形成TT 聚体，也可形成TC 或CC 二聚体。大剂量的紫外线照射，能引起DNA 双螺旋的局部变性，可使两条互补链上的两个嘧啶残基互相靠近而形成二聚体，从而引起交联。当DNA 复制时，两链间的交联会阻碍双链的分开与复制，同一条链上相邻胸腺嘧啶之间二聚体的形成，则会阻碍碱基的正常配对，这样，不是导致复制的突然停止，就是导致在新形成的链上诱发一个改变了基因序列。 （二）X 射线的诱变机理 人体接受的辐射中，X 射线能将原子中的电子激发而形成正离子，它属于电离辐射，经X 射线处理后的DNA 分子，发现有核酸碱基的化学变化，氢键的断裂，单链或双链的断裂，双链之间的交联，不同DNA 分子之间的交联，以及DNA 和蛋白质之间的交联而诱发突变，同时电离辐射的能量被水分子所吸收，水分子失去电子变成正离子，电子若被另一个水分子捕获，这个水分子就变成水的负分子： NO+e f H2O 刚形成而不稳定的离子立刻分解，形成H。和OH。自由基，当这些自由基和细胞中溶解的氧发生反应后，生成过氧基HO° 2 ，这种氧化物质转移到核苷酸双链中去，能引起DNA 分子结构形式的改变，形成碱基类似物，导致碱基置换发生突变。 一般来说，辐射所含的能量愈大，可使原子轨道上的电子变化以及分子共振态的改变也愈强，因而诱变的效率更高。除X射线外，丫射线也是能量极高的辐射，能使轨道上的电子完全离开原子，而造成电离。 三）热的作用机理

基因突变与疾病

第九章基因突变与疾病 基因（gene)是DNA分子上一段具有遗传功能的核苷酸序列，是细胞内遗传物质的主要结构和功能单位。基因具有如下特征：①基因能自我复制。一个基因随DNA的复制而成为两个相同的基因。②基因决定性状。DNA上某一结构基因经转录和翻译，决定某种酶和蛋白质的合成，从而表现出某一性状。③基因能发生突变。在生物进化过程中，由于多种因素的影响，基因可发生突变，基因突变是生物进化、分化的分子基础，也是某些疾病的基础，是生物界普遍存在的现象。 第一节基因突变的概念和原因 基因突变(gene mutation)是指DNA分子上核苷酸序列或数目发生改变。由一个或一对碱基发生改变引起核苷酸序列改变所致的突变，称为点突变（point mutation)；把核苷酸数目改变的基因突变称为缺失性或插入性突变(deletional and insertionar mutation)。基因突变后在原有位置上出现的新基因，称为突变基因（mutant gene)。基因突变后变为和原来基因不同的等位基因，从而导致了基因结构和功能的改变，且能自我复制，代代相传。 基因突变可以发生在生殖细胞，也可发生在体细胞。发生在生殖细胞的基因突变可通过受精卵将突变的遗传信息传给下一代，并在子代所有细胞中都存在这种改变。由于子代生殖细胞的遗传性状也发生了相应的改变，故可代代相传。发生于有性生殖生物体细胞的基因突变不会传递给子代，但可传给由突变细胞分裂所形成的各代子细胞群，在局部形成突变细胞群体。通常认为肿瘤就是体细胞突变的结果。 基因突变的原因很多，目前认为与下列因素有关：

一、自发性损伤 大量的突变属于自发突变，可能与DNA复制过程中碱基配对出现误差有关。通常DNA复制时碱基配对总有一定的误配率，但一般均可通过DNA损伤的修复酶快速修正。如果少数误配碱基未被纠正或诸多修复酶某一种发生偏差，则碱基误配率就会增高，导致DNA分子的自发性损伤。 二、诱变剂的作用 诱变剂(mutagen）是外源诱发突变的因素，它们的种类繁多，主要有： （一）物理因素 如紫外线、电离辐射等。大剂量紫外线照射可引起DNA主链上相邻的两个嘧啶碱以共价键相结合。生成嘧啶二聚体，相邻两个T、相邻两个C或C与T 之间均可形成二聚体，但最容易形成的二聚体是胸苷酸二聚体（thyminedimerTT )。由于紫外线对体细胞DNA的损伤，从而可以诱发许多皮肤细胞突变导致皮肤癌。电离辐射对DNA的损伤有直接效应和间接效应。前者系电离辐射穿透生物组织时，其辐射能量向组织传递，引起细胞内大分子物质吸收能量而激发电离，导致DNA理化性质的改变或损伤；后者系电离辐射通过扩散的离子及自由基使能量被生物分子所吸收导致DNA损伤。生物组织中的水 经辐射电离后可产生大量稳定的、高活性的自由基及H 2O 2 等。这些自由基与活 性氧与生物大分子作用不但可引起DNA损伤，而且也能引起脂质和生物膜的损伤及蛋白质和酶结构与功能的异常。电离辐射使DNA损伤的作用机制主要表现在三个方面：①碱基破坏脱落与脱氧戊糖分解。②DNA链断裂。③DNA交联或DNA-蛋白质交联。 （二）化学因素 如某些化工原料和产品、工业排放物、汽车尾气、农药、食品防腐剂和添加剂等均具有致突变作用。目前已检出的致突变化合物已达6万余种。现择下列常见化学诱变剂说明对DNA损伤的机制。

基因突变的检测方法(完整资料).doc

此文档下载后即可编辑 基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且 由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化 程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据 检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象， 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp 的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过

化学实验基本操作之一 过滤

教学设计方案1 教学重点：用过滤和结晶分离混合物的一般原理。 教学难点：利用结晶方法，分离几种可溶固体物质的混合物的原理。 教学过程： 引言：在生产生活中，人们所接触到的物质很多都是混合物，为了适应各种不同的需要，常常要把混合物里的几种物质分开，得到较纯净的物质，这叫做混合物的分离，过滤和结晶是最常用的混合物分离的方法。 （板书）第四节过滤和结晶 一、过滤 1．定义：过滤是把溶于液体的固态物质跟液体分离的一种方法。 2．原理：过滤时，液体穿过滤纸上的小孔，而固态物质留在滤纸上，从而使固体和液体分离。 3．操作方法： 例如：粗盐提纯（请学生设计实验步骤）展示粗盐，让学生看到粗盐上的沙子等不溶性固体物质，以利于学生思考。 （演示实验）粗盐提纯 归纳出： （1）步骤： ①在烧杯中溶解粗盐 ②过滤 （2）注意事项： 一贴：滤纸紧贴漏斗内壁 二低：滤纸低于漏斗边缘0.5cm 滤液低于滤纸边缘 三靠：漏斗下端紧靠烧杯内壁 玻璃棒靠在三层滤纸处

烧杯靠在玻棒上倾倒液体 （3）玻璃棒的作用 溶解——加速溶解 过滤——引流 让学生总结过滤作为分离物质的一种方法的适用范围。 过滤是用于分离不容性固体和可溶性固体的一种方法。 设问过渡：如果要分离硝酸钾和氯化钠固体能用过滤的方法吗？如果不能，想一想能用什么方法来分离它们？ 二结晶 1.定义：溶质以一定几何形状的晶体从溶液中析出的过程叫做结晶。 2.原理：几种可溶性固态物质的混合物，根据它们在同一种溶剂里的溶解度不同，用结晶的方法加以分离。 （讲述）常用的结晶方法主要有两种，对于溶解度受温度影响不大的固态溶质，一般用蒸发溶剂的方法得到晶体；对于溶解度受温度影响较大的固态溶质，一般可以用冷却的热饱和溶液的方法，使溶质结晶析出。 例如：硝酸钾中混有少量氯化钠，应怎样分离？ （演示实验）在烧杯中加入10g和NaCl混合物，注入15mL水，加热使混合物完全溶解，然后冷却，观察的析出，再进行过渡，晶体留在滤纸上，NaCl溶解在滤液中。 （讲述）我们已经知道，的溶解度受温度变化的影响较大（80℃时，的溶解度是169g，20℃时为31.6 g），因此较高温度下的饱和溶液降温时，部分从溶液里结晶析出。而NaCl的溶解度受温度变化的影响较小（80℃时，NaCl的溶解度是38.4g，20℃时为36g），降温时大部分NaCl仍溶解在溶液里。过滤时，晶体留在滤纸上，大部分NaCl仍留在滤液里（这种滤液叫做母液）。 小结： 作业：课本142页习题1、2、3 教学设计方案2 [教学方法] 实验讨论法。 [教学用具] 仪器：烧杯、漏斗、玻璃棒、试管、试管夹、铁架台、铁环、滤纸、酒精灯、药匙。

基因突变的诱发原理

第六节基因突变的诱发 内容： 一、物理因素诱变 二、化学因素诱变 一、物理因素诱变 只限于各种电离辐射和非电离辐射 1.电离辐射诱变 ●包括α射线、β射线和中子等粒子辐射，还包括r射线和χ射线等电磁波辐射。中子的诱变效果最好。根据辐射（照射）的方法，可分为“内”和“外”照射。 ○外照射 即辐射源与接受照射的物体之间要保持一定的距离，让射线从物体之外透入物体之内，在体内诱发基因突变。χ射线、r射线和中子都适用于“外照射”。 ○内照射 即用浸泡或注射的方法，使其渗入生物体内，在体内放出β射线进行诱变。 α和β射线的穿透力很弱，故只能用“内照射”。实际应用时，一般不用α射线，只用β射线。β射线常用辐射源是P32和S35，尤以P32使用较多。 ●电离辐射致变的机理 这主要是因为它们能使构成基因的化学物质直接发生电离作用。这些物质的分子都是由原子构成的，原子又由数量相等的质子和电子构成。当电离辐射的射线碰控制基因任何分子时，照射的能量使原子外围的电子脱离轨道，原子从中性变为带正电荷的离子，产生“D的发电离”。射线进一步照射，在形成大量离子对的过程中所产生的电子，多数尚有较大的能量，能引起第二次电离，即“次维电离”，“次级电离”轻则造成基因分子结构改组，产生新基因，重则使染色体结构变异（断裂等）。辐射剂量越大，原发电离数就越多，→次级电离就越重→基因突变率就越高。 ●辐射剂量及表示方法 ○定义：单位质量被照射的物质所吸收的能量数值，称为辐射剂量。 ○χ射线和r射线：用“伦琴”（r）表示，即在1克空气中吸收83尔格（erg）辐射的能量。 ○中子：单位是“积分流量”。即每平方厘米的截面上通过的中子数（n/cm2）。 ○β射线：用“微居里”表示。具体是每克物质吸收多少“微居里”（μcu）的放射性同位素。 微居里是放射强度单位，表示每秒钟有3-7×104个原子核发生蜕度。

基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也 可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点 突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重 点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸 序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关 系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋 白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基 酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原 来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领 域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作用元件，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以 及药物研发、基因治疗等等方面。 通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就 行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的 碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可 能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC 含量应大于40%）。 （3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。 （4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。

实验三 ：过滤综合实验

实验三 过滤综合实验 —— 恒压（板框）过滤实验 本实验设备由过滤板、过滤框、旋涡泵等组成，是一种小型的工业用板框过滤机。本套装置可进行设计型、研究型、综合型实验。由于设备接近工业生产状况，通过实验可培养学生的工程观念、实验研究能力、设计能力以及解决生产实际问题的能力。 一、实验任务 根据教学大纲要求和各实验小组的准备情况，从下列实验任务中选择其中1-2项实验。 1.测定恒压过滤参数K 和过滤介质参数qe 、θe ； 2．改变压力，测定滤饼压缩性指数S 和滤饼物料特性常数k ； 3.研究不同过滤压力对过滤机生产能力的影响； 4．研究在相同压力下，不同滤浆浓度对过滤机生产能力的影响。 二、实验基本原理 滤饼过滤是液体通过滤渣层（过滤介质与滤饼）的流动。无论是生产工艺还是工艺设计，过滤速率的计算都要有“过滤常数”作依据。由于滤渣厚度随着时间而增加，所以，恒压过滤速度随着时间而降低。不同物料形成的悬浮液，其过滤常数差别很大，即使是同一种物料，由于浓度不同，滤浆温度不同，其过滤常数也不尽相同，故要有可靠的实验数据作参考。 根据恒压过滤方程: ()()e e K q q θθ+=+2 (1) 式中: q ─ 单位过滤面积获得的滤液体积 [ m 3/m 2 ] e q ─ 单位过滤面积的虚拟滤液体积 [ m 3 /m 2 ] θ ─ 实际过滤时间 [ s ] e θ ─ 虚拟过滤时间 [ s ] K ─ 过滤常数 [ m 2 /s ] 将(1)式微分可得: e q K q K dq d 2 2+=θ （2） 当各数据点的时间间隔不大时， dq d θ 可以用增量之比 q ??θ 来代替，即： e q K q K q 22+=??θ （3） 上式为一直线方程。试验时，在恒压下过滤要测定的悬浮液，测出过滤时间θ及滤液累计量q 的数据，在直角坐标纸上标绘 q ??θ 对 q 的关系，所得直线斜率为 K 2，截距为 e q K 2 ，从而求出 K 和 e q 。

高中生物基因突变知识点总结

高中生物基因突变知识点总结 下面由为大家提供关于高中生物基因突变知识点总结，希望对大家有帮助!高中生物基因突变第一节一、生物变异的类型1、不可遗传的变异(仅由环境变化引起)2、可遗传的变异(由遗传物质的变化引起)，包括：基因突变;基因重组;染色体变异二、可遗传的变异(一)基因突变1、概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构的改变，叫做基因突变。 2、原因：物理因素：X射线、紫外线、r射线等;化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等;生物因素：病毒、细菌等。 3、特点：(1)普遍性(2)随机性(基因突变可以发生在生物个体发育的任何时期;基因突变可以发生在细胞内的不同的DNA分子上或同一DNA分子的不同部位上)(3)低频性(4)多数有害性(5)不定向性【注】体细胞的突变不能直接传给后代，生殖细胞的则可能 4、意义：它是新基因产生的途径;是生物变异的根本来源;是生物进化的原始材料。 (二)基因重组1、概念：是指在生物体进行有性生殖的过程中，控制不同性状的基因的重新组合。 2、类型：(1)非同源染色体上的非等位基因自由组合(2)四分体时期非姐妹染色单体的交叉互换高中生物基因突变第二节一、染色体结构变异：实例：猫叫综合征(5号染色体部分缺失)类型：缺失、重复、倒位、易位(看书并理解)二、染色体数目的变异 (3)染色体组数的判断：① 染色体组数= 细胞中形态相同的染色

体有几条，则含几个染色体组例：以下各图中，各有几个染色体组?② 染色体组数= 基因型中控制同一性状的基因个数例：以下基因型，所代表的生物染色体组数分别是多少?(1)Aa ______(2)AaBb _______(3)AAa _______(4)AaaBbb _______(5)AAAaBBbb _______(6)ABCD ______答案：2 2 3 3 4 13、单倍体、二倍体和多倍体单倍体：由配子发育成的个体。 几倍体：由受精卵发育成的个体，体细胞中含几个染色体组就叫几倍体，如含两个染色体组就叫二倍体，含三个染色体组就叫三倍体，以此类推。 体细胞中含三个或三个以上染色体组的个体叫多倍体。 三、染色体变异在育种上的应用1、多倍体育种：方法：用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗。 (能够抑制纺锤体的形成,导致染色体不分离,从而引起细胞内染色体数目加倍)原理：染色体变异实例：三倍体无子西瓜的培育优缺点：培育出的植物器官大，产量高，营养丰富，但结实率低，成熟迟。 现有纯合矮杆不抗病水稻ddrr和纯合高杆抗病水稻DDRR两个品种,要想得到能够稳定遗传的矮杆抗病水稻ddRR ，应该怎么做?优缺点：后代都是纯合子，明显缩短育种年限，但技术较复杂。 【附】育种方法小结诱变育种杂交育种多倍体育种单倍体育种方法用射线、激光、化学药品等处理生物杂交用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗花药(粉)离体培养原理基因突变基因重组染色体变异染色体