人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备及定量检测试剂盒的研制_彭林峰

收稿日期：2013-07-05；修回日期：2013-08-19

作者简介：彭林峰（1975－），男，医学生物学工程师，主要从事诊断试剂生产和研发。

通信作者：席仲兴，E-mail：xiyue8342181@sina．com。·论著·

人心肌型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备

及定量检测试剂盒的研制

彭林峰，袁皓加，席仲兴，张正雷，罗广，潘宪云，路东，金红燕，陈国怀

（兰州生物制品研究所有限责任公司，甘肃省疫苗工程技术研究中心，兰州730046）

摘要：目的利用抗心肌型脂肪酸结合蛋白单抗，研制定量检测心肌型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的ELISA试剂盒。方法使用基因重组H-FABP免疫小鼠，以杂交瘤技术制备特异性抗H-FABP单抗，用这些单抗研制定量检测H-FABP的ELISA试剂盒。结果筛选获得2株稳定分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株，研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒，灵敏度达到0．2ng/mL，线性范围0．4 25ng/mL，r2=0．9967，回收率在97．2% 104．5%，精密度的变异系数（CV）≤6．72%；应用此试剂盒检测健康人血浆H-FABP，含量为1．87 8．50ng/mL。结论所研制的ELISA试剂盒有较好的灵敏度及特异性，可用于人血浆中H-FABP含量的检测。

关键词：心肌型脂肪酸结合蛋白；单克隆抗体（单抗）；酶联免疫分析

中图分类号：Q81文献标志码：A文章编号：1005-5673（2013）05-0023-04

Preparation of monoclonal antibody against H-FABP and development of a quantitative ELISA kit in detection of H-FABP PENG Lin-feng，YUAN Hao-jia，XI Zhong-xing，ZHANG Zheng-lei，LUO Guang，PAN Xian-yun，LU Dong，

JIN Hong-yan，CHEN Guo-huai

（Lanzhou Institute of Biological Products Co．，Ltd．，Center for Gansu Provincial Vaccine

EngineeringＲesearch，Lanzhou730046，China）

Abstract：Objective To prepare monoclonal antibody against human heart-type fatty acid binding protein（H-FABP）and to establish a quantitative ELISA Kit in detection of H-FABP．Methods It was by immunization of mice with recombinant H-FABP，and cell fusion was processed to establish hybridoma cell lines，the specific monoclonal antibodies against H-FABP were prepared．Ｒesults The quantitative ELISA in detection of H-FABP was developed by using these mono-clonal antibodies．The sensitivity of this assay reaches to0．2ng/mL，and the linear range is in0．5－32ng/mL with r2val-ue of0．9967and recovery rates are in97．2%－104．5%，the CV of precision is less than6．72%．It can measure H-FABP level in healthy human plasma in concentration1．87－8．50ng/mL．Conclusion The developed ELISA kit has better sensitivity and specificity，which could be used in detection of H-FABP in healthy human plasma．

Key words：Human heart-type fatty acid binding protein（H-FABP）；Monoclonal antibody（McAb）；ELISA

脂肪酸结合蛋白是一种相对分子质量为15000的小分子蛋白质，存在于机体多种组织细胞的胞浆中，主要担负着结合脂肪酸并调节其细胞内代谢的功能，按照组织特异性不同可分为心肌型（H-FABP）、小肠型（I-FABP）、肝脏型（L-FABP）、脂肪细胞型（A-FABP）、脑细胞型（B-FABP）、肾脏型（K-FABP）、骨骼肌型（S-FABP）、牛皮癣相关型（PA-FABP）及表皮型（E-FABP）9种亚型。H-FABP较特异的存在于心肌细胞的胞质中，目前的研究发现其能够在心肌损伤的早期释放入血液，可作为心肌损伤的一种新的标志物用于急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）的早期诊断［1］。近年来研究发现，H-FABP在AMI发生1．5h后就可出现在血浆中，6h达到高峰，随后逐渐下降，到24h后恢复到正常水平［2］。而且，H-FABP对早期AMI的诊断敏感性显著高于cTnI（肌钙蛋白I）和CK-MB （肌酸激酶同工酶），其诊断发病3h内的AMI亦明显优于cTnI、CK-MB和MYO（肌红蛋白），表明H-FABP可作为早期急性心肌梗死的检测指标［3－5］。因此，定量检测血液中H-FABP的含量对AMI的诊

·

32

·

微生物学免疫学进展2013年10月第41卷第5期Prog in Microbiol Immunol，Oct2013，Vol．41No．5 DOI:10.13309/https://www.wendangku.net/doc/179992885.html,ki.pmi.2013.05.011

断和治疗有重要意义。研究应用单克隆抗体技术，研制了定量检测H-FABP的ELISA试剂盒。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1实验动物BALB/c小鼠，8 12周龄，雌性，清洁级；F1代小鼠，10 12周龄，雌性，清洁级；均由兰州生物制品研究所有限责任公司（简称兰州公司）实验动物室提供。

1．1．2细胞小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0细胞由兰州公司诊断用品室保存。

1．1．3主要试剂和材料次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷、氨基蝶呤、聚乙二醇、二甲基亚砜、兔抗鼠IgG酶标记物、兔抗鼠IgG亚类检测试剂、辣根过氧化物酶、福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂和ＲPMI1640均购自Sigma公司；酶标板购自Nunc公司；小牛血清购自兰州民海生物制品公司；H-FABP参比品、洗液、显色液和终止液均由兰州公司诊断用品室提供；基质稀释液为含50mg/mL人血白蛋白的PBS缓冲液，由兰州公司诊断用品室提供。

1．2方法

1．2．1杂交瘤细胞株的建立参照文献［6］方法。用纯化的基因重组H-FABP抗原免疫BALB/c 小鼠，经4次免疫后，取小鼠脾细胞与SP2/O细胞融合，克隆化3次后得到6株分泌抗H-FABP单抗的杂交瘤细胞株。将上述细胞株扩大培养，冻存并制备腹水。

1．2．2单抗特性鉴定①单抗的腹水效价测定：采用间接ELISA方法；②单抗Ig类及亚类检测：用鼠单抗分型试剂盒鉴定6株单抗的Ig类与亚类，采用间接ELISA方法；③单抗亲和力检测：采用硫氰酸钾洗脱法［7］；④单抗识别抗原表位的检测：采用间接ELISA测相加指数，分析抗原识别位点，根据公式AI=［2A1+2/（A1+A2）－1］?100%判定结果，AI值大于50%时，表示两种单抗所识别的抗原位点不同；AI值在10% 50%之间时，表示两株抗体识别的抗原表位有差异；AI值小于10%时，表示两种单抗识别的抗原表位相同或相近。

1．2．3双抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

①包被抗体浓度与酶标记抗体最佳浓度的选择：选择效价高、亲和力强、识别不同抗原表位的两株单抗分别作为包被抗体和HＲP标记的信号抗体。采用方阵滴定法确定最佳抗体包被浓度与酶标记抗体浓度；②线性范围分析：配制H-FABP的梯度稀释液（0 50ng/mL），用试剂盒检测，以H-FABP浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制散点图，并进行线性分析，确定线性范围；③准确性分析：用基质稀释液将H-FABP参比品稀释成0．5ng/mL、2ng/mL、8 ng/mL、14ng/mL、20ng/mL的样品，通过测定回收率，分析检测方法的准确性；④灵敏度分析：配制质量浓度分别为0ng/mL、0．05ng/mL、0．1ng/mL、0．2ng/mL、0．3ng/mL、0．4ng/mL、0．5ng/mL的H-FABP溶液，每个浓度检测5次，计算0ng/mL的均值及标准差（SD），吸光度＞均值+3SD为阳性；⑤特异性分析：分别检测0．1mg/mL胆红素、20mg/mL 胆固醇、500mg/mL血红蛋白、0．5ng/mL肌钙蛋白，其浓度为人血清正常值的5倍，重复3次，计算阴性对照均值及标准差，吸光度＞均值+3SD为阳性；⑥检测方法的稳定性分析：将制备的试剂于36 38?放置6d后，对定量曲线中的部分测定点进行检测，分析灵敏度、线性范围、变异系数等，与2 8?保存的试剂进行对照；⑦精密度分析：用基质稀释液配制25ng/mL、15ng/mL、5ng/mL3个质量浓度的H-FABP溶液，每个浓度重复检测10次，计算批内精密度，使用不同批次制备的试剂，分别进行5次独立实验，计算批间精密度。

1．2．4临床样本检测应用H-FABP定量检测试剂盒对357份健康人血浆中H-FABP含量进行测定，样本入选标准为：血脂、血压、血糖、肝肾功能以及心电图均正常，排除外伤、肌肉病变、心血管疾病、糖尿病和其他内分泌疾病，测定结果通过矩形正态检验，其95%正常参考值上限按X?2SD计算，计算正常参考值。检测解放军总医院和解放军第305医院住院及门诊就诊的AMI患者血清60份，入选标准为所有患者均经临床表现、心电图动态演变和心肌生化标志物检查确诊。

2结果

2．1杂交瘤细胞株的建立

用纯化的的H-FABP抗原免疫BALB/c小鼠，血清效价达到1?10000时进行融合，融合率在95%以上。用间接ELISA法筛选出18个阳性克隆，阳性率为5%，对其进行3次克隆化培养后，获得6株可分泌高效价单抗的杂交瘤细胞株，经液氮冻存、复苏及3个月连续传代培养后，仍然可稳定分泌单抗。

2．2单抗特性鉴定

2．2．1单抗的腹水效价采用间接ELISA检测

纯化后腹水抗体效价，各株单抗腹水效价均在1?105 1?106之间。2．2．2

单抗Ig 类及亚类

4B12、2G4、1A6分泌的单抗为IgG2a ，

7C8、8D11分泌的单抗为IgG2b ，5E10分泌的单抗为IgG3；轻链均为κ链。2．2．3

单抗的亲和力采用硫氰酸钾洗脱法，

4B12、2G4、1A6、7C8、8D11、5E10等6种单抗的亲和力指数分别为2．2mol /L 、3．0mol /L 、3．2mol /L 、2．8mol /L 、2．6mol /L 、2．0mol /L ，抗体相对亲和力大小排列为1A6＞2G4＞7C8＞8D11＞4B12＞5E10。2．2．4单抗识别的表位以位点加成试验（间接ELISA ）测定各株单抗A 值，计算A I 值。单抗2G4与7C8A I 值为67．8%，识别不同抗原表位。2．3双抗体夹心ELISA 检测试剂盒的研制2．3．1包被抗体浓度与酶标记抗体最佳浓度的选

择

选择7C8、

2G4经凝胶过滤（S-300）纯化后，分别作为包被抗体和HＲP 标记抗体，方阵滴定法确

定7C8最佳包被浓度为4000倍稀释，

HＲP 标记2G4工作浓度为5000倍稀释。

2．3．2线性范围分析具有良好线性关系的检测区间为0．4 25ng /mL ，

H-FABP 的浓度曲线方程为y =0．0898x +0．1338，

r 2

=0．9967。见图1

。图1

H-FABP 的ELISA 系统的线性范围分析

Fig．1

Thelinear range of ELISA system in detection of H-FABP

2．3．3

准确性分析检测5份已知H-FABP 质量浓度的样品，其回收率在97．2% 104．5%之间，表明该试剂盒有较高的准确性。见表1。

表1准确性分析结果

Tab．1Ｒesults for accuracy analysis

已知浓度（ng /mL ）测定浓度（ng /mL ）准确度（%）0．50．4797．202．02．03101．508．08．14101．7514．013．7298．0020．0

20．90

104．50

2．3．4

灵敏度分析在系列稀释的参比品梯度

中，

0ng /mL 的参比品均值+3SD 为0．117，0．05ng /mL 、0．1ng /mL 、0．2ng /mL 参比品吸光值分别为0．091、0．102、0．158，0．2ng /mL 参比品已成阳性反应，故该试剂盒的检测灵敏度为0．2ng /mL 。2．3．5特异性分析阴性对照A 均值为0．095，SD 为0．012，0．1mg /mL 胆红素、20mg /mL 胆固醇、500mg /mL 血红蛋白、0．5ng /mL 肌钙蛋白的检测A

均值分别为0．098、0．092、0．102、0．097，均＜X +3SD ，说明该试剂盒的特异性良好。2．3．6

稳定性分析配制好的试剂于36 38?

放置6d 后，与2 8?保存的试剂进行对照，检测灵敏度均为0．2ng /mL 、线性范围为0．4 25ng /mL ，相关系数分别为0．996、0．994，部分测定点数值最大变异系数（CV %）≤5．03%，说明该试剂盒稳定性良好。见表2。2．3．7

精密度分析统计学处理结果显示，批内

CV ≤4．85%，批间CV ≤6．72%。见表3。2．4临床样本检测

对357份健康人血浆中H-FABP 含量的检测结果做统计分析，95%正常参考值按X ?2SD 计算，健

康人血浆中H-FABP 质量浓度正常参考值为1．87 8．50ng /mL 。男女各组测定值差异无统计学意义（P ＞0．05），男女各组测定结果合并，均呈正态

分布或近似正态分布。检测AMI 患者血清60份，H-FABP 质量浓度为（25．8?6．7）ng /mL 。

表2稳定性分析结果

Tab．2

Ｒesults of stability analysis 已知浓度（ng /mL ）

2 8?

36 38?

2019．523．27%19．415．03%1010．374．15%10．254．26%5

4．90

4．73%

5．04

3．85%

表3精密度分析结果Tab．3Ｒesults of precision analysis

已知浓度（ng/mL）X?SD、CV

H-FABP浓度（ng/mL）

5ng/mL

X?SD CV%

15ng/mL

X?SD CV%

15ng/mL

X?SD CV%

批内4．87?0．174．2315．08?0．234．7225．24?0．584．85批间4．92?0．236．1614．81?0．335．9425．12?0．676．72

3讨论

在早期急性心肌梗死的诊断中血清生化标志物检测有重要价值，目前临床常用的有MYO、CK-MB、cTnI、H-FABP等，早期AMI患者经常表现出非典型的症状，也不出现有诊断意义的心电图表现，胸痛发作6h内血清酶学常在正常范围。H-FABP在AMI 发作后3h内浓度上升，因此，H-FABP较cTnI、CK-MB、MB对早期AMI具有更好的诊断价值［8］。研究发现检测血浆H-FABP浓度水平变化，可监测进行性心肌梗死、心脏手术后心肌梗死，评估心肌梗死面积大小［9-10］。

实验应用杂交瘤技术成功制备2种识别不同抗原位点的抗H-FABP特异单抗，以其中一种单抗（7C8）作为包被抗体，另一单抗（2G4）标记HＲP作为信号抗体，制备了检测H-FABP双抗体夹心ELISA试剂盒。为提高检测方法的灵敏度、特异性、稳定性和准确性，在包被及检测抗体的浓度选择等方面进行了大量的试验。为降低非特异性反应的干扰，对封闭液的组成、标记抗体、底物的使用浓度等进行实验分析，从而获得最优实验条件，在保证检测灵敏度的基础上，将非特异性反应降到最低。对试剂盒的的性能进行评估，结果表明，该试剂盒具有较高的灵敏度、特异性、准确性及良好的稳定性。通过对357份健康人血浆中H-FABP含量的检测，健康人血浆中H-FABP的质量浓度正常参考值为1．87 8．50ng/mL，与文献报道的正常参考值略有差别，这可能与参比品定值、试剂盒及人种的差异有关。检测AMI患者血清60份，H-FABP的质量浓度为（25．8?6．7）ng/mL，明显高于健康人血浆中H-FABP含量。

实验是定量检测血中H-FABP浓度，此法具有较高的灵敏度、特异性及准确性，可为临床提供有价值的实验室参数。但是，要应用于临床AMI的诊断，还需扩大检测样本量，确定准确的诊断临界值。参考文献

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（本文编辑：王棣）

心脏型脂肪酸结合蛋白FABP地的综述

心脏型脂肪酸结合蛋白 一，FABP的生物学特性 脂肪酸结合蛋白( FABP) 是一组多源性的小分子细胞内蛋白质，分子量 14 ～ 15 kDa，。目前已发现的FABP有9种类型，其中心脏型FABP (H —FABP)较特异地存在于心肌组织中，红骨骼肌、主动脉壁的平滑肌细胞、内皮细胞、胃腺体的壁细胞和睾丸间质细胞中亦有，少量存在于肾脏、白骨骼肌、肾上腺、脑，但肝脏、脂肪组织内无H—FABP分布【1】。FABP 在骨骼肌中的含量是其在心肌中含量的1 /10。心脏中的FABP 称心型脂肪酸结合蛋白。H-FABP 具有稳定的细胞内半衰期，约2 ～ 3天。人心脏每克湿重中含0. 5 mg FABP，占胞质蛋白的15%。 生理情况下，血浆或细胞间液不存在H-FABP，细胞质的浓度比血中浓度高2 × 105 倍。健康人群的血浆含有少量H-FABP，是由骨髂肌损伤连续释放引起，年龄、性别、昼夜节律可显著影响H-FABP浓度。因为男性肌肉较多，所以男性浓度高于女性，H-FABP 大部分经肾清除，故随着年龄的增长，肾功能下降，血H-FABP 浓度逐渐升高，此外，和肌红蛋白一样，年老、锻炼会增加H-FABP 浓度。 二，临床应用 1.诊断急性冠脉综合征 H-FABP 血浆释放特点与肌红蛋白( myoglobin，Mb) 相同，但HFABP在心肌细胞内的含量高于Mb，而在血浆内的含量远低于Mb。因此，当心肌损伤后，血浆H-FABP迅速升高超正常上限，比Mb 和肌钙蛋白来得快，因而更有诊断价值。近年来众多研究表明血清H-FABP 能识别超急期急性心肌梗死，特别是胸痛发病6 h 内的患者，对决定是否住院、冠状动脉造影、介入治疗有很大帮助。陶日新等【2】就研究了cTnI和h-FABP诊断心梗的比较，结果证实：对于胸痛发作6h内的AMI患者，H—FABP的诊断敏感性最高，达到78．26％。而在胸痛发作超过6h的AMI患者中，cTnI检测的诊断敏感性有显著的上升，均达到了93．33％，所以可以对AMI进行确诊。 Orak 等【3】入选83 例可疑ACS 胸痛患者( 65 例最终确诊为ACS) ，于发病6 小时内测定H-FABP、cTnI、肌酸激酶同工酶(CK-MB)。H-FABP、CK-MB、cTnI 的灵敏度分别为98%、86% 和77%，特异性分别为71%、52% 和20%。提示H-FABP 在发病6 h 内具有较高的灵敏度和特异性，可用于早期诊断ACS。

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)ELISA试剂盒说明书

人心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 厦门慧嘉生物科技有限公司 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）水平。用纯化的人心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP），再与HRP标记的H-FABP抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）浓度。 试剂盒组成： 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程

中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为900ng/L，600ng/L ，300ng/L，150ng/L，75ng/L）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

单克隆抗体制备的基本原理

单克隆抗体制备的基本原理 一、单克隆抗体的概念 抗体（antibody）是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤 细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针

对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次**，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。 德国科学家柯勒（Georges Ko1er）和英国科学家米尔斯坦（Cesar Milstein）两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面 发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein 在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of

中链脂肪酸1

科研设计书 名称：探讨含中链脂肪酸的低乳糖奶粉对婴儿肝炎综合症患儿的辅助治疗 一．立项依据 婴儿肝炎综合症是指1岁以内婴儿（包括新生儿）由不同病因引起，主要以黄疸、肝功能损害、肝或脾大的一组症状。其一般治疗包括补充VitA、D、E、K，某些遗传性代谢缺陷病如半乳糖血症应停用一切奶类和奶类制品，改用豆浆及蔗糖喂养；酪氨酸血症给予低苯丙氨酸、低酪氨酸饮食。重要的是要护肝利胆，有报道使用熊去氧胆酸(商品名优思弗UDCA)治疗，安全性好，对婴儿肝炎综合症尤其是肝内胆汁淤积时具有良好的临床应用价值[1]；另有报道使用“退黄汤”（成分：茵陈10g，田基黄8g，金钱草6g，灯草3g，黄柏6g，通草4g，生麦芽8g，茯苓10g）治疗，疗效较满意[2]；中西医结合以茵陈蒿汤加味加氨苄青霉素治疗，避免了因长期使用激素治疗而致常见并发症的危险[3]。此处探讨含中链脂肪酸（MCFAs）的低乳糖奶粉对婴儿肝炎综合症的辅助治疗。 19世纪50年代MCFAs的酯类中链甘油三酸酯（MCTs）被引进作为广泛的临床应用，包括胰腺机能不全、脂肪吸收不良、损伤的淋巴乳糜微粒输送、严重的高乳糜微粒血症以及完全胃肠外营养。也被用于早产儿的营养配方，因此1994年，美国食品与药物管理局公认了食品中MCTs的安全性[4]。 中链脂肪酸（MCFAs）是从椰子油水解所获得的含C6～ C12的饱

和脂肪酸混合物。主要成分为己酸（C6：0），辛烷酸(C8∶0) , 葵烷酸(C10∶0)[5]。目前MCFAs主要的成分是15%椰子油，7.9%棕榈仁油，黄油6.8%，牛奶6.9%，酸乳酪6.6%，乳酪7.3%[6]。临床使用的MCT 乳剂主要有二种制剂。一种以物理混合形式的脂肪乳剂, 所含MCT 和LCT浓度比例可以为50∶50, 60∶40 和75∶25。另一种为化学合成形式的脂肪乳剂(结构脂或化学限定脂肪乳剂)。结构脂是将甘油三酯(TG) 水解后, 再将长链脂肪酸(LCFA ) 和MCFA 随机混合后再酯化而成。再酯化前改变MCFA 和LCFA 浓度, 可制得不同的结构甘油三酯[5]。 中链脂肪酸的代谢特点[5]： （1）MCFA 有很大的水溶性, 在单位时间内有更多供酶作用的接触界面。在胃和结肠中也可部分水解。故其消化时对胆盐和胰酶的依赖性小, 比LCT 吸收快而充分。 （2）MCFA 分子小及较低pk 值, 与再酯化酶和激活酶亲和性小, 极少再酯化, 并不参与组成乳糜微粒, 经门静脉直接转运到肝脏。（3）MCFA 不依赖肉毒碱直接进入线粒体内进行B2氧化。有报道发现在其氧化前有一个增加两个碳原子的特殊过程，若此过程缺陷，则影响中链脂肪酸治疗方案的成功[7]。 （4）MCFA 氧化迅速完全, 不易在脂肪组织和肝组织中蓄积。 1.MCT对碳水化合物代谢的影响 MCT对碳水化合物代谢的影响，与MCT的浓度和脂肪酸链长度有关。给予高浓度MCT时，血糖下降8%不等，可能是葡萄糖异生减少或摄取增

GY001人血白蛋白生产工艺规程

目录 一、人血白蛋白产品概述…………………………………………………………………2页 二、人血白蛋白分离分装工艺流程图及环境区域划分…………………………………5页 三、人血白蛋白生产操作过程及工艺条件………………………………………………7页 四、主要设备一览表及设备生产能力……………………………………………………29页 五、原辅料、包装材料、中间品、原液、半成品、成品质量标准和技术参数……………………30页 六、包装要求、标签、说明书的使用与贮存方法………………………………………47页 七、工艺卫生……………………………………………………………………………48页 八、安全和劳动保护………………………………………………………………………52页 九、劳动组织与岗位定员…………………………………………………………………54页 十、三废处理………………………………………………………………………………56页十一、附录(常用生物制品术语和名词解释) …………………………………………57页十二、附录(常用理化常数、换算表)……………………………………………………59页十三、附页(供修改时登记批准日期、文号和内容用)…………………………………60页

一、产品概述 本品系由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆经低温乙醇蛋白分离法提取的组分V，经纯化、脱醇、60℃10小时加温灭活病毒后，除菌分装而成的液体制剂。白蛋白含量97%以上，用适量辛酸钠作稳定剂，不含防腐剂和抗生素，专供静脉输注。主要用于治疗创伤性、出血性休克、严重烧伤以及低蛋白血症等。 1 药品名称 通用名：人血白蛋白 英文名：Human Albumin 汉语拼音： Renxue Baidanbai 主要组成成份：人血白蛋白 2 性状 本品为略黏稠，黄色或绿色至棕色澄明液体。不应出现混浊。 3 药理作用 3.1 .增加血容量和维持血浆胶体渗透压：白蛋白占血浆胶体渗透压的80%，主要调节组织与血管之间水分的动态平衡。由于白蛋白分子量较高，与盐类及水分相比，透过膜内速度较慢，使白蛋白的胶体渗透压与毛细管的静力压抗衡，以此维持正常与恒定的血容量；同时在血循环中，1g白蛋白可保留18ml水，每5g白蛋白保留循环内水分的能力约相当于100ml血浆或200ml全血的功能，从而起到增加循环血容量和维持血浆胶体渗透压的作用。 3.2 运输及解毒：白蛋白能结合阴离子也能结合阳离子，可以输送不同的物质，也可以将有毒物质输送到解毒器官。 3.3 营养供给：组织蛋白和血浆蛋白可互相转化，在氮代谢障碍时，白蛋白可作为氮源为组织提供营养。 4 适应症 4.1 失血创伤、烧伤引起的休克。 4.2 脑水肿及损伤引起的颅压升高。 4.3 肝硬化及肾病引起的水肿或腹水。

心型脂肪酸结合蛋白资料

心型脂肪酸结合蛋白

心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性(也就是主要在心脏组织中表达)。心肌缺血性损伤出现后，h-FABP可以早在胸痛发作后1至3小时在血液中被发现，6至8小时达到峰值而且血浆水平在24至30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个氨基酸组成，分子量为15 kDa。h-FABP基因位于染色体I上。它是心脏最丰富的蛋白质之一。h-FABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。 h-FABP在生物学方面的几个特点，表明其是心肌损伤早期诊断有价值标志物：1.在心肌中高浓度；2.在细胞质中限制；3.低分子量和面积小；4.相对组织特异性；5.与心脏以外组织中CK-MB的分布相似；6.在心肌损伤后早释进入血浆和尿液。 心型脂肪酸结合蛋白检测在心血管疾病的诊断应用主要表现在三个方面： 一是h-FABP与急性心肌梗死。由于h-FABP可以早在胸痛发作后1至3小时在血液中被发现，故h-FABP能够提供最强的诊断能力，尤其是在急性缺血事件的前6小时内，有助于快速危险分层和更早预测患者预后。另外，h-FABP的早期使用可以克服急性胸痛早期心肌肌钙蛋白检测的陷阱。心肌肌钙蛋白在循环中越持久，可能越有助于急性心肌损伤的后期诊断。 二是h-FABP和手术后急性心肌损伤。h-FABP用于早期检测心肌损伤还被延伸到心脏手术。在心脏手术中松开主动脉钳夹后h-FABP血清浓度比CK-MB和TnT更早达到最高水平。普遍认为h-FABP释放量反映心肌损伤的程度。 三是h-FABP与急性冠脉综合征(ACS)。h-FABP在ACS发病早期可迅速释放到血液中，对于ACS的诊断具有时间优势，同时对心肌损伤具备高特异性、高灵敏度、高符合率的特点；h-FABP浓度在ACS长期预后中，可有效鉴别出AMI、心衰及不稳定心绞痛等不良事件的高危患者；h-FABP与肌钙蛋白联合检测可提高诊断敏感性，对ACS更具诊断价值。 随着h-FABP高特异性单克隆抗体的应用，h-FABP在ACS早期诊断及预后评估中的应用被广泛认可，而其与肌钙蛋白的联合检测则是未来临床对心血管疾病诊断应用的重点。 -通讯员陆卫良

单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用 单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇。单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)：一种免疫学技术，将产生抗体的单个B淋巴细胞同骨髓肿瘤细胞杂交，获得既能产生抗体，又能无限增殖的杂种细胞，并以此生产抗体。是仅由一种类型的细胞制造出来的抗体，对应于多克隆抗体、多株抗体——由多种类型的细胞制造出来的一种抗体。 1 单克隆抗体的优点与局限性： 单克隆抗体的优点：(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。 总体来说，即：高特异性、高纯度、重复性好、敏感性强、成本低和可大量生产等。 单克隆抗体的局限性：(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。 (2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。 2 单克隆抗体的制备： 单克隆抗体的制备原理：应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。 单克隆抗体的制备过程：抗原准备、动物的选择与免疫、细胞融合、选择杂交瘤细胞及抗体检测、杂交瘤的克隆化、杂交瘤细胞的冻存与复苏、单克隆抗体的纯化等步骤。 抗原准备 抗原，是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。很多物质都可以成为抗原，抗原的具体分类可以参见抗原，在进行单克隆抗体制备过程中，很多物质都可以成为抗原，在常规的科研实验中，科研者经常选用每只小鼠/大鼠每次注射10~50ug 重组蛋白、偶联多肽、偶联小分子等作为抗原产生特异性的单克隆抗体。 动物的选择与免疫

单克隆抗体的制备流程

单克隆抗体的制备流程 （一）动物的选择与免疫 1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。 2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb 至关重要。一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 （1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐 剂。常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。 初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点） ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml） ↓3周后 第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价） ↓2～3周 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射） ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：① 将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗 原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞 因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增强免疫细胞对抗原的反应性。 （2）颗粒抗原免疫性强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1～2×107个细胞。 初次免疫1×107/0.5ml ip ↓2～3周后 第二次免疫1×107/0.5ml ip ↓3周后 加强免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv ↓ 取脾融合 （二）细胞融合

心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)胶体金快速检测试剂盒

心脏型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)胶体金快速检测试剂盒 使用说明书 (仅供专业人员体外诊断使用) 用途 心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）检测试剂盒是应用免疫胶体金层析技术建立的快速、特异、操作简便的一步法定性检测方法，用于定性检测人血清或血浆中的心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）。可用于急性心肌梗塞（AMI）的辅助诊断。 简介 用于早期诊断急性心肌梗塞（AMI, Acute Myocardial infarction）的指标主要有肌酸激酶异构酶(CK-MB)、肌钙蛋白I（Troponin I）、肌钙蛋白T（Troponin T）和肌红蛋白（Myoglobin）等，但它们对于早期诊断AMI却很不理想，主要原因是：CK-MB、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T缺乏敏感性，它们在胸痛后6-8小时才浓度上升；而肌红蛋白则缺乏特异性，它虽然在胸痛后2-3小时浓度上升，但不能区分骨骼肌和心肌损伤。 而心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）则克服了以上两缺点，对于早期诊断AMI具有特异性和敏感性，它是15KD的小分子，动力学特征类似于肌红蛋白，即在胸痛后2-3小时后浓度开始上升，在12-24小时内恢复到正常水平，在4-8小时内达到最高值；而且h-FABP的免疫性不同于其它类型的FABP（如小肠型FABP 和肝脏型FABP），具有特异性，不会发生交叉反应。基于h-FABP以上特点使得其成为理想的AMI早期诊断生化指标。

检测原理 心脏型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）检测试剂盒是采用固相免疫胶体金层析技术，利用双抗体夹心法定性检测人血清或血浆中的h-FABP。 人血清或血浆扩散通过附着红色颗粒包被的抗体的滤膜，与滤膜中的包被抗体结合，在检测线（T）区域内，h-FABP－抗体复合物开始与包被在检测线区内的抗体接触，如果血清h-FABP浓度大于10ng/ml，在检测线区h-FABP－抗体复合物被抗-h-FABP的抗体捕获，并出现一条可见的红色条带。h-FABP浓度越高，检测线区出现色带的速度越快，色带越深。彩色颗粒包被的抗体扩散到质控线（C）区域被第二抗体捕获形成质控区红色带。 保存条件和有效期 铝箔袋包装, 4－25℃储存，切勿冷冻, 有效期1年。 试剂盒组成 每盒包装中含：单人份检测卡25包，使用说明书1份。 注意事项

人血白蛋白工艺规程(试行)

目的：规范人血白蛋白的生产和质量管理。 适用范围：适用于生产技术部、质量保证部及各相关部门。 责任人：生产操作人员、质监员、低温车间主任、分包装车间主任、生产技术部长、质量保证部长。 正文： 一、产品概述 1、产品名称人血白蛋白 2、剂型、规格 2.1 剂型：注射剂 2.2 规格 2.2.1 每瓶含蛋白质10g，蛋白质浓度为20%。 2.2.2 每瓶含蛋白质5g，蛋白质浓度为20%。 2.2.3 每瓶含蛋白质2g，蛋白质浓度为20%。 3、处方或工艺配方 3.1 人血白蛋白10g 辛酸钠0.266g 加注射用水至50ml 3.2 人血白蛋白5g 辛酸钠0.133g 加注射用水至25ml 3.3 人血白蛋白2g 辛酸钠0.053g 加注射用水至10ml 处方依据：《中国药典》2005年版三部 4、产品的性状、功能与主治 4.1 性状 本品为略黏稠、黄色或绿色至棕色澄明液体，不应出现浑浊。 4.2 功能与主治 （1）失血创伤、烧伤引起的休克；（2）脑水肿及损伤引起的颅压升高；

（3）肝硬化及肾病引起的水肿或腹水；（4）低蛋白血症的防治； （5）新生儿高胆红素血症；（6）用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征。 5、批准文号及标准演变情况 5.1 批准文号 10g：国药准字S1******* 5g：国药准字S1******* 2g：国药准字S1******* 5.2 标准演变情况 执行标准由《中国生物制品规程》2000年版《中国药典》2005年版三部 6、保存、运输及有效期 室温（不超过30℃），避光保存和运输。自分装之日起有效期为3年。 二、基本要求 1、厂房设施及生产环境符合《药品生产质量管理规范》（98版）的要求，并取得《GMP 认证证书》。生产用设施及设备应专用，不得与其他制品混用。 2、关键性设备应经验证合格才能投入使用，已投入使用的设备要定期进行再验证或回顾性验证。 3、生产车间的人流、物流分开。人流、物流各行其道，洁净区与非洁净区用明显的色标加以区别。 4、血浆分离用操作间工作（环境）温度控制在0～10℃，防止分离过程中制品温度升高。 5、生产用的水源应符合国家饮用水标准，纯化水、注射用水应符合《中国药典》（2005年版二部）的标准。生产用水的制备、贮存、分配和使用均应符合《药品生产质量管理规范》（98版）的要求。80℃以上保温，65℃以上保温循环或4℃以下保温循环，制备后6小时内使用，制备后4小时内灭菌72小时内使用。注射用水管道、储水罐及盛放制品的反应容器材质应为316L型不锈钢，使用前经钝化处理。注射用水系统及制水工艺需定期进行再验证。 6、直接用于生产的金属器具或玻璃器具等生产用具必须严格清洗和灭菌处理，处理工艺定期进行再验证；生产过程中使用的过滤介质应为无石棉的介质。 7、原料血浆的采集和质量应符合《中国药典》2005年版三部“血液制品原料血浆规程”

心型脂肪酸结合蛋白

心型脂肪酸结合蛋白(h-FABP)是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性(也就是主要在心脏组织中表达)。心肌缺血性损伤出现后，h-FABP可以早在胸痛发作后1至3小时在血液中被发现，6至8小时达到峰值而且血浆水平在24至30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个氨基酸组成，分子量为15 kDa。h-FABP基因位于染色体I上。它是心脏最丰富的蛋白质之一。h-FABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A 的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。 h-FABP在生物学方面的几个特点，表明其是心肌损伤早期诊断有价值标志物：1.在心肌中高浓度；2.在细胞质中限制；3.低分子量和面积小；4.相对组织特异性；5.与心脏以外组织中CK-MB的分布相似；6.在心肌损伤后早释进入血浆和尿液。 心型脂肪酸结合蛋白检测在心血管疾病的诊断应用主要表现在三个方面： 一是h-FABP与急性心肌梗死。由于h-FABP可以早在胸痛发作后1至3小时在血液中被发现，故h-FABP能够提供最强的诊断能力，尤其是在急性缺血事件的前6小时内，有助于快速危险分层和更早预测患者预后。另外，h-FABP的早期使用可以克服急性胸痛早期心肌肌钙蛋白检测的陷阱。心肌肌钙蛋白在循环中越持久，可能越有助于急性心肌损伤的后期诊断。 二是h-FABP和手术后急性心肌损伤。h-FABP用于早期检测心肌损伤还被延伸到心脏手术。在心脏手术中松开主动脉钳夹后h-FABP血清浓度比CK-MB和TnT更早达到最高水平。普遍认为h-FABP释放量反映心肌损伤的程度。 三是h-FABP与急性冠脉综合征(ACS)。h-FABP在ACS发病早期可迅速释放到血液中，对于ACS的诊断具有时间优势，同时对心肌损伤具备高特异性、高灵敏度、高符合率的特点；h-FABP浓度在ACS长期预后中，可有效鉴别出AMI、心衰及不稳定心绞痛等不良事件的高危患者；h-FABP与肌钙蛋白联合检测可提高诊断敏感性，对ACS更具诊断价值。 随着h-FABP高特异性单克隆抗体的应用，h-FABP在ACS早期诊断及预后评估中的应用被广泛认可，而其与肌钙蛋白的联合检测则是未来临床对心血管疾病诊断应用的重点。-通讯员陆卫良

单克隆抗体制备流程

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。 一、细胞融合前准备 (一) 免疫方案 选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 初次免疫1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) ↓2～3周后 第二次免疫1×10７／0.5ml ip ↓3周后 加强免疫(融合前三天) 1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) ↓ 取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。 初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点) ↓3周后 第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip │(ip剂量不宜超过0.5ml) ↓3周后 第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip │ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) ↓2～3周后 加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。 (二) 饲养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄 ↓ 拉颈处死浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 ↓

生化名词解释

1.清道夫受体:主要存在于巨噬细胞表面,介导修饰LDL(包括氧化LDL和BVLDL)从血液循环中清除。其表达不受细胞内胆固醇浓度的调节。 2.残粒受体:能识别ApoE,是清除血液循环中CM残粒和β-VLDL残粒的主要受体,它也能结合含ApoE的HDL，又称为ApoE受体。 3.血浆脂蛋白:由于甘油三酯和胆固醇难溶于水,不能直接溶解在血液里被装运，在血浆中它们是与特殊的载体蛋白和极性类脂(PL)结合成微溶于水的一类球形大分子复合物微粒而被运输，这种复合物称为血浆脂蛋白。 4.高脂蛋白血症是指血浆中CM,VLDL,LDL,HDL等脂蛋白出现一种或几种浓度过高的现象。 5.水肿:当机体摄入水过多或排出减少,使体液中水增多时,称为水肿或水中毒。 6.P50:是指使Hb氧饱和度达50%时的PO2 7.酸碱平衡:机体会通过各种调节机制，排出体内多余的酸性和碱性物质，调节体液酸碱物质含量及其比例，维持体液PH在正常范围内，这个过程称为酸碱平衡。 8.内生肌酐清除率:肾在单位时间内，把若干毫升血浆中的内生肌酐全部清除出去的能力，称为内生肌酐清除率。 9.心肌损伤:伴有心肌细胞变性坏死的疾病，主要包括AMI、不稳定型心绞痛和心肌炎以及心肌病、心力衰竭等疾病。 10.心肌损伤标志物:心肌损伤标志物是指当心肌细胞损伤时，可大量释放至循环血液中，其血液浓度变化可反映心肌损伤及其程度的特异物质，其正确的检测可以为急性心肌梗死及其他伴有心肌损伤疾病的早期诊断，病情诊断，疗效观察提供具有价值的信息。 1.血脂：是血浆中脂质(类)的总称，包括甘油三酯（TG）、磷脂（PL）、游离胆固醇（FC）及胆固醇酯（CE）、游离脂肪酸（FFA）等 2.氧解离曲线：以血氧饱和度为纵坐标、PO2为横坐标作图,所得的曲线称为氧和血红蛋白解离曲线，简称氧解离曲线。 3.生物转化:机体对非营养物质进行代谢转变，使其极性增加,水溶性增强,易于排出的过程称为生物转化作用 4.高脂血症是指血浆中的TC和(或)TG水平升高。 1.简述血脂的超速离心法和电泳法的分类。 用超速离心法可将血浆脂蛋白分为:乳糜微粒（CM）、极低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。 利用琼脂糖电泳法,血浆脂蛋白可分为乳糜微粒、前-β、β和α四条脂蛋白区带。 4.简述血清甘油三酯的磷酸甘油氧化酶法测定原理。 用脂蛋白酯酶(LPL)使血清中TG水解成甘油与脂肪酸,甘油激酶(GK)及腺苷三磷酸(ATP)将甘油磷酸化，以磷酸甘油氧化酶（GPO）氧化3-磷酸甘油(G-3-P）产生H2O2,最后以Trinder反应显色,A500nm的值与TG浓度成正比。 5.什么叫做脱水,根据失水和失钠的比例,脱水可分为哪几种情况? 脱水就是人体体液丢失造成细胞外液的减少。根据失水与失钠的比例不同,可分为: 高渗性脱水:失水高于失钠; 等渗性失水:失水等于失钠; 低渗性失水:失钠高于失水。 6.重氮盐改良JG法测定血清胆红素的原理。

心型脂肪酸结合蛋白

心型脂肪酸结合蛋白（h-FABP）是心脏中富含的一种新型小胞质蛋白，它具有高度心脏特异性（也就是主要在心脏组织中表达）。心肌缺血性损伤出现后，h-FABP可以早在胸痛发作后1 至3小时在血液中被发现，6至8小时达到峰值而且血浆水平在24至30小时内恢复正常。心脏脂肪酸结合胞质蛋白由132个氨基酸组成，分子量为15 kDa。h-FABP基因位于染色体 I上。它是心脏最丰富的蛋白质之一。h-FABP结合两个脂肪酸分子并参与脂肪酰基辅酶A 的运输，活跃于氧化过程，从而在线粒体中产生能量。 h-FABP在生物学方面的几个特点，表明其是心肌损伤早期诊断有价值标志物：1?在心肌中高浓度；2?在细胞质中限制；3?低分子量和面积小；4?相对组织特异性；5?与心脏以外组织中CK-MB的分布相似；6?在心肌损伤后早释进入血浆和尿液。 心型脂肪酸结合蛋白检测在心血管疾病的诊断应用主要表现在三个方面： 一是h-FABP与急性心肌梗死。由于h-FABP可以早在胸痛发作后1至3小时在血液中被发现，故h-FABP能够提供最强的诊断能力，尤其是在急性缺血事件的前6小时内，有助于快速危险分层和更早预测患者预后。另外，h-FABP的早期使用可以克服急性胸痛早期心 肌肌钙蛋白检测的陷阱。心肌肌钙蛋白在循环中越持久，可能越有助于急性心肌损伤的后期 诊断。 二是h-FABP和手术后急性心肌损伤。h-FABP用于早期检测心肌损伤还被延伸到心脏 手术。在心脏手术中松开主动脉钳夹后h-FABP血清浓度比CK-MB和TnT更早达到最高水 平。普遍认为h-FABP释放量反映心肌损伤的程度。 三是h-FABP与急性冠脉综合征（ACS）。h-FABP在ACS发病早期可迅速释放到血液中，对于ACS的诊断具有时间优势，同时对心肌损伤具备高特异性、高灵敏度、高符合率的特点；h-FABP 浓度在ACS长期预后中，可有效鉴别出AMI、心衰及不稳定心绞痛等不良事 件的高危患者；h-FABP与肌钙蛋白联合检测可提高诊断敏感性，对ACS更具诊断价值。 随着h-FABP高特异性单克隆抗体的应用，h-FABP在ACS早期诊断及预后评估中的应 用被广泛认可，而其与肌钙蛋白的联合检测则是未来临床对心血管疾病诊断应用的重点。 通讯员陆卫良 心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP ）是近几年国内外研究较多的一种新型的心脏生化标志物。其主要存在于心肌细胞中，参与心肌细胞内脂肪酸的吸收、代谢和运输。正常人外周血中H-FABP 的含量极少，当心肌细胞缺血、坏死时，H-FABP 可早期、快速、大量的释放入血液中，导致血液中的含量快速上升。H-FABP 在急性冠脉综合征中的临床应用包括以下几个方面。 1 心肌损伤的早期诊断 在急性心肌梗死发生的早期，有些患者的临床症状并不典型，心电图也没有特异性的改变，传统

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选

单克隆抗体制备过程中经过两次筛选 单克隆抗体制备过程中，总共有两次筛选，第一次筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，两次筛选的原理和方法是不相同的。 第一次筛选的原理与方法：细胞融合后，杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一条途径是应急途径或补救途径（“S途径”），它是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HA T培养液中也不能增殖而很快死亡。惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HA T培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 第二次筛选的原理和方法：在实际免疫过程中，由于采用连续注射抗原的方法，且一种抗原决定簇刺激机体形成相对应的一种效应B淋巴细胞，因此，从小鼠脾脏中取出的效应B淋巴细胞的特异性是不同的，经HA T培养液筛选的杂交瘤细胞特异性也存在差异，所以必须从杂交瘤细胞群中筛选出能产生针对某一预定抗原快定簇的特异性杂交瘤细胞。通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞（理论上30%的孔中细胞数为0时，才能保证有些孔中是单个细胞），再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩大培养。因此，单克隆抗体制备过程中，两次筛选的原理和方法是不相同的。 单克隆抗体制备的基本原理与过程 原理： B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 过程： 1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c小鼠。免疫的方法取决于所用抗原的性质。免疫方法同一般血清的制备，也可采用脾内直接免疫法。 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前，骨髓瘤细胞应经过含8-AG的培养基筛选，防止细胞发生突变恢复HGPRT 的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）。骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养，融合前24h换液一次，使骨髓瘤细胞处于对数生长期。 3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。例如，供者淋巴细胞没有查到免疫应答。这必然要失败的。 2融合试验最大的失败原因是污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。 4）阳性克隆的筛选应尽早进行。通常在融合后10天作第一次检测，过早容易出现假阳性。检测方法应灵敏、准确、而且简便快速。具体应用的方法应根据抗原的性质，以及所需单克隆抗体的功能进行选择。常用的方法有RIA法、ELISA法和免疫荧光法等。其中ELISA法最简便，RIA法最准确。阳性克隆的筛选应进行多次，均阳性时才确定为阳性克隆进行扩增。 5）克隆化克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体。克隆化应尽早进行并反复筛选。这是因为初期的杂交瘤细胞是不稳定的，有丢失染色体的倾向。反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。克隆化的方法很多，而最常用的是有限稀释法。 （1）显微操作法：在显微镜下取单细胞，然后进行单细胞培养。这种方法操作复杂，效率低，故不常用。 （2）有限稀释法：将对数生长期的杂交瘤细胞用培养液作一定的稀释后，按每孔1个细胞接种在培养皿中，细胞增值后成为单克隆细胞系。第一次克隆化时加一定量的饲养细胞。由于第一次克隆化生长的细胞不能保证单克隆化，所以为获得稳定的单克隆细胞株需经2～3次的再克隆才成。应该注意的是，每次克隆化过程中所有有意义的细胞都