浅谈PCR技术的发展
浅谈PCR技术的发展与创新历程
姓名：娄旭学号：201218010015088单位：植物逆境生物学研究中心
PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction )，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR的问世，引起了一场分子生物学的革命，它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程，有力地推动了现代生物学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展，在分子生物学史上具有跨时代的意义。
首先，我们来了解一下PCR技术的基本原理。PCR技术是一种选择性体外扩增DNA 片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA 片段两翼互补的寡核苷酸。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。在合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。一个变性，退火，延伸的过程就是一个循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复，每一循环所得到的产物又可作为下一循环的模板，以此类推，以后每一循环模板均比前一循环增加一倍，理论上讲，PCR扩增DNA产物是呈指数上升的。简单来说，PCR就是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
接下来，我们来了解一下PCR技术产生的背景。20世纪70年代，“遗传工程”、“重组DNA”和“克隆”等科学技术进步产物的兴起，使生物技术产业炙手可热，它以效率和创造性为标志，为科学和商业提供了声望和商机，在科学进展与新产品开发和卫生保健行业发展直接挂钩的投资氛围下，分子生物学在美国蓬勃发展起来，也产生了孕育PCR技术的大环境：（1）“重组工程”和其他分子技术的重大突破；（2）具备了鼓励科研成果快速向应用问题转化的法规环境；（3）政府资助的研究与寻求投资的风险资本密切结合，为分子生物学的研究和开发奠定了雄厚的基础。由此，在对核酸研究了将近100年后，人们开始致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。1985年美国PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应：在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，并推出了第一台热循环PCR仪。Mullis也由此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
从最初技术设想的提出到目前各种PCR方法的应用，PCR技术在分子生物学中已经有了四十多年的历史，短短四十年中，PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。接下来，本人就PCR技术
的发展历程和技术创新做简要的介绍。根据各阶段PCR技术的方法和手段，可以将其发展历程分为以下四个阶段。
（一）初创期
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：（1）引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。（2）Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。
此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow 酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。
技术创新过程：1988年Saiki 等从美国黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：（1）在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。（2）耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。（3）大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0 Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)，此酶的发现使PCR得到更为广泛的应用。
（二）奠基期
此阶段的PCR技术由于没有可以自动升降温的仪器装置而采用手动或机械操作，三个恒温水浴箱，分别恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃），低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环：94℃ 30S，58℃ 45S，72℃ 60S，进行40次循环。
这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是：设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR 反应条件，事实表明实验效果还是不错的，但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中，因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰，影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶（某些PCR反应需要多于三个温阶）、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。
创新过程：为改进提高本方法的自动化水平，有人设计了机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献。
（三）发展期
此阶段的PCR技术是发展过程中的经典时期，是目前应用最为广泛最为普遍的PCR技术，之后发展起来的新技术都是在此基础上进行的扩展。在此阶段，具有代表性的就是自动化控制型定性基因的扩增仪即PCR仪的应用。
PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪。它的要求是要使体积不大的PCR反应液在尽可能短的时间内迅速实现变温，既要保证反应液达到要求的温度，又要使它迅速转换到下一温度，转换时间越短则扩增的特异性越高。目前国内外使用做多的PCR仪的主要变温方式有变温铝块和变温气流式。
创新过程：随着PCR技术的发展，PCR仪也在不断改进：用加热盖取代油封的加热块型仪器，可防止在管盖上的冷凝作用，并能显著降低微量管中样品内的温度梯度；反应加热块的构造和外形也在不断改进，加热盖在许多仪器上已经标准化，用于冷却的帕尔帖元件也更可靠；多种形式的载样系统不断出现，如微量管、微量滴定板、毛细管甚至载玻片都已用于PCR反应。
与第二阶段的水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，是后续各种扩增仪发展的基础。
（四）成熟期
PCR技术经历了各种创新与改进后在最近十来年成为一种成熟的分子生物学手段。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个Kb的基因到目前已能扩增长达几十个Kb的DNA片段，PCR技术已越来越被人们所掌握。到目前为止，PCR技术已有十几种之多，下面主要就免疫PCR、反向PCR、原位PCR和实时定量PCR来介绍PCR技术在这一阶段的发展及应用。
（1）免疫PCR
免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。免疫PCR结合了免疫反应和PCR的特点，集PCR的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性于一体。与常规PCR 和普通ELAS相比，免疫PCR优势明显，其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检测出浓度低至2ng/L的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。
免疫PCR技术是常规PCR技术在医学免疫学领域的主要扩展，它常被用于激素和细胞因子的检测、生化酶类的检测、治病微生物的检测、寄生虫感染的检测机其他毒素或蛋白的检测，因其检测效率高，在医学科研工作者中备受青睐。
（2）反向PCR
反向PCR又称为染色体缓移，可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶的作用下自然形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是
相互反向的，经PCR扩增，得到已知序列上下游的旁侧DNA片段。反向PCR技术在检测病毒、转座子等在基因组中的整合位点，建立基因组步移文库及研究基因的上游调控元件等方面优势明显。现已制备了酵母人工染色体（Y AC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。
与常规PCR相比，反向PCR优势突出，但它需要从许多酶中选择一种合适的限制性内切酶进行酶切，另外，由于大多数真核基因组含有大量中度和高度重复序列，从而导致反向PCR得到的探针与多个基因序列杂交，影响扩增效果。
（3）原位PCR与原位反转录PCR
原位PCR技术是将PCR高效扩增与原位杂交的细胞定位相结合，在组织细胞水平原位检测单拷贝的特定DNA或RNA序列。原位发转录PCR是指先将细胞核组织进行处理以获得湿度的细胞通透性，再通过逆转录使mRNA转录成cDNA，然后把载玻片放入热循环机，对靶DNA等细胞内靶目标在原位进行PCR扩增，最后通过检测标记产物的方法检测扩增产物。
原位PCR技术是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。它既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。原位反转录PCR常被用于扩增和检测标本中罕见的mRNA，如定量细胞表达特殊mRNA的丰度。检测扩增产物的细胞起源及检测细胞群中基因表达的趋势等。
（4）实时定量PCR
实时PCR又称荧光定量PCR或TaqMan PCR，是美国PE公司（Perkin Elmer）于1995年研制出的一种新的核酸定量技术。该技术在常规PCR基础上运用荧光能量传递（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术，加入荧光标记探针，巧妙地把核算扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起，借助于荧光信号来检测PCR产物。一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线。
在real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′ 核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。②此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致实时定量PCR 方法在研究工作中的运用。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在实时荧光定量PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR
产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在实时荧光定量PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct）。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR的优势：设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
实时荧光定量PCR要用定量PCR仪，目前常见的仪器有PE公司的PE系列，罗氏公司的Lightcycle系列，Robbett公司的RG系列。而根据荧光化学原理不同可分为DNA结合染色、TaqMan技术、Amplisensor、分子灯塔、复合探针法、杂交探针、自身谇灭技术等。目前，荧光定量PCR已被应用与病原体测定、免疫分析、肿瘤基因测定、基因表达、突变和多态性研究。
除以上所介绍的四种新型PCR技术外，多重PCR，兼并引物PCR和重组PCR等其他的PCR技术均在各自的领域发挥着重要的作用，
小结
从Mullis 发明PCR 技术我们可以看到：开发创造性思维的求异性关键在于一个“思”字。分子生物学处于生命科学中的前沿学科地位，这就决定了每个分子生物学工作者面对的是一条前人所没有走过的路，肩负着在荆棘丛生的知识荒野上开辟新路的重任。现有的书本和理论尽管一般说来是正确的，但毕竟只是对现阶段研究成果的总结，并非毫无纰漏可言，百分之百地绝对正确。迷信书本理论，有可能成为开发创造性思维的障碍。我们应该保持思维的开放性，既不受各种思维框框，如传统、权威、书本等束缚，又要善于吸收新的信息，容忍不同的见解，使自己的思维处于活跃、灵敏、兼容并蓄和实事求是的状态。
而纵观PCR技术发展的这四十多年，每一次的飞跃都不开技术的创新和改革。Taq酶的发现从本质上突破了PCR技术发展的瓶颈，自动式PCR仪的出现更使PCR作为一种简便灵活易操作的技术而广为流行，而实时荧光定量PCR的应用更是使PCR技术完成了从定性到定量的飞跃，这一切都不是偶然的，都是在众多科研工作者的努力和创新下完成的。同时，PCR作为一项“革命性的技术”，不仅推动了遗传与分子生物学的发展，而且，在其它领域科学家的努力下，其不断与该领域的核心技术相结合，极大地推动了此领域的发展。总之，
随着科学技术的不断进步，生物技术的日新月异，PCR技术必将得到新的发展，以之为基础的新技术将不断出现，必将有力的促进科学技术的进步。
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PCR技术的研究与现状分析课程论文
PCR技术的研究与现状分析 摘要：PCR技术是一种体外酶促合成、扩增特定DNA片段的方法。因其高强的特异性和灵敏度以及检测速度快、准确性好等优点，该技术已经广泛地应用于水产、微生物检测、临床微生物、基因表达、肿瘤免疫、微小残留病变的检测，DNA拷贝数的测量、基因组变异和多态性等许多方面。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。 关键词：PCR技术；分类；研究现状；应用； Research and Application Status of PCR Technology Class 1 Bio-engineering 10 Student: Lao Yangyan Student ID: 1031250019 Tutor: Wei Dongmei Abstract: PCR is an in vitro enzymatic synthesis，amplification of specific DNA fragment. Because of its high-strength specificity and sensitivity，detection speed and good accuracy，it has been widely applied in many fields such as the aquatic，microbial detection，clinical microbiology，gene expression，tumor immunology，detect ion of minimal residual lesion，measurement of DNA copy number，genome mutation，polymorphism and so on. This article summarize 4 kinds of PCR technology，with its application status is analysed. Keywords: PCR technology；Category；Progress research；Application 引言 聚合酶链反应( PCR) 技术问世20多年以来, 已经在生物学研究领域内得到了巨大的发展并不断的完善, 不仅广泛应用在基础研究领域, 在疾病诊断等方面也有了越来越广泛深入的研究和应用。1985年，美国Karray等学者首创了PCR 技术，并且由美国Cetus 公司开发研制[1]。随着科学技术的发展和突破，PCR 技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物检测、兽医学、水产养殖等方面。由于该技术具有较强的灵敏度、准确度和特异性，又能快速进行检测，因而其应用领域也在不断延伸[2]。随着PCR 技术的不断发展，在常规PCR 技术的基础上又衍生出了许多技术，如多重PCR技术、实时荧光定量PCR技术、单分子PCR 技术、变性梯度凝胶电泳技术。目前应用最多的为荧光定量。本文主要介绍4种PCR技术及其在各个领域的应用现状。并对PCR的前景进行了展望，让其更好的服务于人们的生活。 PCR技术原理 PCR 技术是根据待扩增的已知DNA片段序列、人工合成与该DNA 2条链末端互补的2段寡核苷酸引物，在体外将待检DNA序列（模板）在酶促作用下进行扩增。PCR 的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步是高温条件下的DNA模板变性，即模板DNA在93~94℃的条件下变性解链；第2步是退火，即人工合成的2个寡核苷酸引物与模板DNA链3’端经降温至55℃退火；第3步是延伸，即在4种dNTP底物同时存在的情况下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物链将沿着5’-3’方向延伸与模板互补的新链[3]。经过这个循环后，合成了新链，可将其作为DNA模板继续反应，由此循环进行。循环进程中，扩增产物的量以指数方式增加，一般单一拷贝的基因循环25~30次，DNA可扩增l00 ~200万倍。PCR反应的步骤很简单，但是具体的操作是复杂的，如退火温度的确定、延伸时间的长短以及循环数等。因此，不同的反应体系应该确定适当的反应条件，以避免假阴性或假阳性等情况的产生。 PCR技术的分类 在传统PCR 技术的基础上，根据人们的需要以及各个领域的应用要求，又衍生出很多种类的PCR 技术。新技术在各领域广泛应用并逐渐改进，为进一步的研究提供了基础。 2.1 实时荧光定量PCR技术
关于PCR技术及其应用实例和前景
PCR技术及其应用实例和前景 检验0905郭媛媛 PCR是我们研究分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技 的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到 我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。 摘要：PCR (ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。 关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言 人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。 20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，
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浅谈PCR技术的发展与创新历程 姓名：娄旭学号：201218010015088单位：植物逆境生物学研究中心 PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction )，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR的问世，引起了一场分子生物学的革命，它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程，有力地推动了现代生物学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展，在分子生物学史上具有跨时代的意义。 首先，我们来了解一下PCR技术的基本原理。PCR技术是一种选择性体外扩增DNA 片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA 片段两翼互补的寡核苷酸。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。在合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。一个变性，退火，延伸的过程就是一个循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复，每一循环所得到的产物又可作为下一循环的模板，以此类推，以后每一循环模板均比前一循环增加一倍，理论上讲，PCR扩增DNA产物是呈指数上升的。简单来说，PCR就是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 接下来，我们来了解一下PCR技术产生的背景。20世纪70年代，“遗传工程”、“重组DNA”和“克隆”等科学技术进步产物的兴起，使生物技术产业炙手可热，它以效率和创造性为标志，为科学和商业提供了声望和商机，在科学进展与新产品开发和卫生保健行业发展直接挂钩的投资氛围下，分子生物学在美国蓬勃发展起来，也产生了孕育PCR技术的大环境：（1）“重组工程”和其他分子技术的重大突破；（2）具备了鼓励科研成果快速向应用问题转化的法规环境；（3）政府资助的研究与寻求投资的风险资本密切结合，为分子生物学的研究和开发奠定了雄厚的基础。由此，在对核酸研究了将近100年后，人们开始致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。1985年美国PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应：在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，并推出了第一台热循环PCR仪。Mullis也由此获得了1993年的诺贝尔化学奖。 从最初技术设想的提出到目前各种PCR方法的应用，PCR技术在分子生物学中已经有了四十多年的历史，短短四十年中，PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。接下来，本人就PCR技术
PCR技术发展与应用的研究进展
PCR技术发展与应用的研究进展 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR 技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR 技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。 关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。 随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。 生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR[4] )。迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作一综述作简要综述。 1 定量PCR技术 定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。广义概念下的定量PCR 技术可以分为五种类型：
PCR发展历程综述
PCR技术发展历程综述 摘要：PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。本文简要叙述了PCR技术的发展历程及现在所发展起来的相关技术。 关键词：PCR技术变性退火延伸 1.PCR技术的发展简史 1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功，1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者。 但当时Mullis所使用的大肠杆菌聚合酶1的片段Klenow存在一些缺陷：Klenow酶不耐热，在对DNA模板进行热变性时，会导致此酶的钝化，因此需要每完成一个扩增周期增加一次酶。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，提高扩增DNA片段的均一性，1988年Saiki等从温泉中分离的一种水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的
PCR技术综述
PCR技术综述 摘要：PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。本文主要针对PCR的概念，原理和方法，简要介绍常用的PCR相关技术及其原理，方法及应用。 关键词：PCR；原理；应用及展望 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由变性、退火及延伸等反应构成一个周期，可循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域都被广泛应用。 1、PCR技术发展史 上个世纪60年代末，人们开始致力于基因体外分离技术的研究，但由于核酸含量较少，大大限制了DNA的体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想，DNA经变性之后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不断重复该过程就可以克隆出tRNA基因。但是，由于当时的基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强的DNA聚合酶也还没有发现，相关引物的合成处在手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。 1985年，美国科学家KaryMullis在高速路的启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和合适的缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界的一致认可，KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。然而，最开始的PCR技术还很不成熟，在那个时候是一种操作复杂、成本高昂的实验室技术。直到Saiki等人从一种嗜热杆菌提取到一种耐热DNA聚合酶，才使得PCR的扩增效率得以提高，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传与分子生物学分析的根本基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：从定性发展到定量；从原先只能扩增几个kb到目前已能扩增几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。 2、PCR技术原理 基本PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成的原料及水。 PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：Denaturation、Annealing，andExtension。Denaturing即将DNA加热变性转为单链DNA作为复制的模板；而Annealing则是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端，最后在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一条链的合成。
pcr技术发展与展望
PCR技术的发展及展望摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术 开发出了许多新的用途。综述了PCR技术的主要扩展。 关键词：PCR技术 1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana 等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR 的应用和普及。 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断[1]。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。 1 .PCR技术的扩展 1.1 AP-PCR技术 1.1.1 AP-PCR技术的定义、来源及特点 AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下．主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增l至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图,即可反映出待分析基因组的特征。 AP-PCR技术由Williams等[3]于20世纪90年代建立．它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。 1.1.2 AP-PCR技术的应用 AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee[2]应用AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等[3]采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等[2]成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6J×DBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。 1.2 LP-PCR和彩色PCR 1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定义 LP—PCR(Labelled primers PCR)．即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引
PCR技术概论
PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术简史 PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
PCR技术的发展(上)
PCR技术的发展（上） 各位科研君每天穿梭于实验室，一定枯燥乏味吧！今天，和小编一起任性一回！听听小编给你讲故事。注意啦，小伙伴们搬起板凳坐好啦！小编要开始讲啦！ 故事还得从我们熟悉的PCR开始～～～ PCR (Polymerase Chain Reaction)，聚合酶链式反应，取名效法“原子核裂变链式反应”。首先将待扩增DNA模板加热变性解链；随之冷却至某一温度时，引物与待扩增模板序列发生退火结合；再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。其“链式”的含义在于，下一个反应循环(Cycle)使用的模板为上一个循环中的产物，故待扩增的DNA片段在链式反应中以2^n的几何级数增长。 虽然PCR的基本原理非常简单，但是其中隐藏了很多的有趣故事。让我们先从PCR发明的历史开始说起，聊一聊我们最熟悉也最陌生的PCR吧！究竟是哪一个大教授发明了PCR呢？对！就是当时的这个帅小伙，凯利?穆利斯（K.B.Mullis）博士！ K.B.Mullis出生于1944年，童年时光，Mullis和兄弟姐妹们一起在农场里顽皮。此时，Mullis的生活和自然科学还没有半点关系，他的童年时代并不像其他大科学家们那样，从小就对身边的自然现象充满了兴趣。1953年，PCR技术的理论基础——DNA双螺旋模型被提出的时候，Mullis和小伙伴们还仍然在乡间开心地玩耍着呢。中学时代，Mullis来到了南卡罗莱纳的首府Columbia，开始了一点点与科学相关的活动，可居然是造火箭。使用从妈妈厨房里拿出来的糖，以及从当地药店开出来的硝酸钾，还有不知道从哪里弄来的炸药引线，Mullis就和小伙伴们在自家院子里面设计火箭。经过一次次的实验，他们的火箭尺寸越做越大，最后竟然将一直青蛙发射了出去，飞了一英里多！
pcr技术发展与展望
p c r技术发展与展望 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
PCR技术的发展及展望 摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。综述了PCR技术的主要扩展。 关键词：PCR技术 1971年Khorana等最早提出PCR理论：“DNA变性解链后与相应引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，重复该过程便可克隆tRNA基因”。因当时基因序列分析方法尚未成熟、热稳定DNA聚合酶还未发现及寡聚核苷酸引物合成仍处于手工和半自动阶段，核酸体外扩增设想似乎不切实际，且Smith等已发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，Khorana等的早期设想被忽视。1985年Mullis等用大肠杆菌DNA聚合酶工Klenow 片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因成功以及1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq酶)引入PCR，使扩增反应的特异性和效率大大提高，并简化了操作程序，最终实现了DNA扩增的自动化，迅速推动了PCR的应用和普及。 PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下。以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点。通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断[1]。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。 1 .PCR技术的扩展 AP-PCR技术 AP-PCR技术的定义、来源及特点 AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技术[2]，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下．主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增l 至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图,即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等[3]于20世纪90年代建立．它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。 AP-PCR技术的应用 AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离，Liang和Pardee[2]应用AP-PCR技术对正常A31和肿瘤起源的BPA31细胞进行了鉴定，并分离得到了仅存在于正常细胞的N1及仅存在于肿瘤细胞的T1片段；(2)菌株鉴定，杨国玲等[3]采用AP-PCR技术对甲真菌病病原菌进行了快速鉴定；(3)遗传作图，Welsh等[2]成功地应用AP-PCR方法快速鉴定了重组鼠(C56BL/6J×DBA/2J)扩增多态性在染色体图谱中位置。 LP-PCR和彩色PCR LP-PCR和彩色PCR的定义 LP—PCR(Labelled primers PCR)．即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。 彩色PCR(Color Complement Assay)是指利用荧光染料标记引物的5’端，不同荧光(荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE和FAM呈绿色荧光,COUM呈蓝色荧光)标记的引物同时
PCR技术的发展前景及特点——张影影
PCR技术的发展前景及特点摘要：PCR技术是遗传与分子生物学分析的根本性基石，近年来．基于常规PCR技术开发出了许多新的用途。本文主要阐述PCR技术的发展扩展及特点。 关键词：PCR技术 引言 PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。现已被广泛应用于农学、植物病理学等领域的研究。最初的PCR技术相当不成熟,但在随后的几十年里，PCR技术被不断改进。它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片断到目前为止，PCR技术已有十几种之多。本文对其近年来的主要扩展及应用进行综述。 1 .PCR技术的扩展 1.1 AP-PCR技术 1.1.1 AP-PCR技术的定义、来源及特点 AP-PCR技术，是指在对所扩增基因顺序一无所知的情况下，主观上随意地设计或选择一个非特异引物进行PCR扩增，反应在不严格条件下扩增至数轮后，再于严格条件下进行。通过比较扩增产物的指纹图，即可反映出待分析基因组的特征。AP-PCR技术由Williams等于20世纪90年代建立，它可以快速地从两个或更多的个体组织细胞中分离出差异基因或基因差异表达产物，具有简单、灵敏、有效和重复性好等特点。 1.1.2 AP-PCR技术的应用 AP-PCR技术是常规PCR技术在差异基因分离方面的扩展，主要应用在：(1)差异基因的分离；(2)菌株鉴定；(3)遗传作图。 1.2 LP-PCR和彩色PCR 1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定义 LP—PCR：即标记PCR，它是指利用同位素、荧光素等对PCR引物5’端进行标记，通过PCR反应扩增，来检测目的基因存在与否。 彩色PCR是指利用荧光染料标记引物的5’端，不同荧光荧光染料TAMRA呈红色荧光，JOE 和FAM呈绿色荧光,COUM呈蓝色荧光)标记的引物同时参加反应,经PCR反应扩增后，根据不同荧光的色泽来判断目标基因是否存在及扩增基因的类型。 1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比较 LP-PCR与彩色PCR由荧光PCR那发展而来，彩色PCR是LP-PCR的一种。与常规PCR相比，LP-PCR更为直观,其省去了限制性内切酶酶解及分子杂交等繁琐步骤，并且一次可以同时分析多种基因成分，但是LP-PCR只能对产物进行定性鉴定。与LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2种不同颜色的引物：一种作为基因检测引物；另一种作为控制条件的内对照。但是在检测多点突变时，彩色PCR需用更多的色彩。 1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的应用 LP-PCR和彩色PCR是常规PCR技术与标记技术相结合的产物，LP-PCR常被用于大量临床标本的基因诊断，同时可用于对PCR产物进行定性鉴定。彩色PCR常被用予检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的型别鉴定等，如被用于检测多突变点的遗传病。1.3免疫PCR技术 1.3.1免疫PCR技术的定义、来源及特点 免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗
PCR技术的研究进展与临床应用
参考文献 1 赵年丰1非生物性人工肝疗法抢救重症肝炎1临床内科杂志,1996,13(6):10～11 2 B is m u th H,F igueiro J,Sam uel D.A rtif O rgan s,1998, 22:26～31 3 K i m o to S.A SA I O T ran s,1995,5:102 4 N yberg SL,Shatfo rd RA,H u W S,et al.C rit CareM ed, 1992,20:1157 5 李兰娟,黄建荣,陈月美等1人工肝治疗重型肝炎应用研究1中华传染病杂志,1999,17(4):228～230 6 江元森,陈幼明,姚集鲁等1人工肝支持系统治疗重型肝炎的疗效评价1中华内科杂志,2000,39(2):115～117 7 Yo sh ibaM,Sek iyam a K,I w am u ra Y,et al.D ig Sci,1993, 38(3):469 8 A sh SR.A SA I O T ran s,1994,40:80 9 M atsbara S.A rtif O rgan s,1994,18(5):63 10 Kondrup J,A l m adal T,V ilstrup H,et al.In t J A rtif O rgan s,1992,15(11):669 11 李兰娟,黄建荣,陈江华等1人工肝支持系统治疗重型 病毒性肝炎的研究1中华肝脏病杂志,1997,5(4):202～203 12 D ix it V,Gitn ick G.Scand J Gastroen tero l,1996,31 (220):110～114 13 Co rno V,Don in iA,V ianello V,et al.T ran sp lan t P roc, 1998,30:2469～2470 14 Kelly JH,Su ss m an NL.A sia T ran s,1994,40:83～85 15 王英杰,李梦东,王宇明等1人肝细胞的微载体培养及其意义1中华消化杂志,1997,17(4):191～193 16 王英杰,王宇明,李梦东等1体外生物人工肝支持系统的构建及其意义1中华内科杂志,1997,36(10):665～667 17 D em etri ou AA,Rozha J,Podesta L,et al.Scand J Gastroen tero l,1995,30(208):111～117 18 W atanabe FD,D em etriu AA.Cu rren t Op in i on Gastroen tero l,1996,12:213～236 编辑 任鸿兰 PCR技术的研究进展与临床应用黄荣宁 综述 周祖文 审校 广西玉林市第一人民医院(537000) 聚合酶链反应(Po lym erase Chain R eacti onm,PCR)是一项体外基因扩增技术,1985年美国PE公司人类遗传研究室M u llis等人发明了该项技术,Saik i等首先应用于镰状红细胞贫血的产前诊断〔1〕,但由于操作方法繁琐未能全面推广应用。直到1988年耐热DNA聚合酶(T aq酶)的发现和应用〔2〕,使PCR技术变得极为简单,才被迅速应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学领域,也使人类疾病的基因诊断进入了临床实用阶段。历经十余年,PCR技术已由当初只能对样品中的DNA和RNA定性分析发展到能够进行定量分析。本文对PCR技术的研究进展与临床应用作一综述。1 定性PCR技术的方法与临床应用 111 PCR扩增的基本方法 PCR扩增过程是一套反复进行的“三步曲”。①变性:双链DNA在94℃左右的高温下变性,形成单链DNA模板。②退火:变性后的单链DNA在55℃左右与反应液中的引物互补结合。③引物延伸:在73℃左右,引物的3端逐个接上与模板碱基互补的核苷酸,形成核苷酸链,这一步在T aqDNA聚合酶和4种单核苷酸存在的情况下完成。“变性-退火-延伸”为一个循环,每一个循环约需3m in,反复进行20～40个循环,即完成了PCR的扩增过程,扩增产物与标准靶DNA样品同时进行凝胶电泳即可确定要扩增的目的DNA存在与否。 112 巢式PCR 即进行两次PCR扩增反应,应用一对引物进行扩增,获取较大的DNA片段,再取少量的产物作模板,以另一对引物扩增其中一部分序列。巢式PCR可以提高敏感性和特异性。 113 等位基因特异性PCR〔3〕,基本原理是设计两个引物,其中一个引物的3端与待扩增基因的野生型碱基互补,另一个引物与待扩增基因的突变型碱基互补,两个引物分别与第3个引物组成两个独立的PCR反应体系,同时检测一标本。因待测基因要么是野生型,要么是突变型,所以只有其中一个反应体系能扩增成功,就可确定基因是否突变。这一技术已应用于多种单基因病的诊断。 114 复合PCR 一般PCR是用一对引物扩增一个DNA片段。如果在反应体系中加入两对以上的引物,就可以同时扩增两个以上基因片段。该技术可使多种或多型病原体的检测一步完成。 115 逆转录PCR PCR是以DNA为模板进行扩增,如果要检测RNA,则须先以RNA为模板进行逆转录扩增,获得c DNA,再以后者为模板进行扩增,这就是逆转录PCR。116 定性PCR的临床应用 11611 在感染性疾病诊断中的应用 利用物种间遗传基因存在特征的差别,对其进行检测是鉴定感染性疾病病原微生物最可靠最直接的方法,优于细菌学、生物化学和免疫学等传统的方法,已有近百种微生物可通过PCR技术进行检测〔4〕,且大多数的检测试剂已经商品化,国内常用的有各型肝炎病毒、EB病毒、巨细胞病毒、结核杆菌、淋球菌、幽门螺杆菌、支原体、弓形体等试剂盒。PCR技术用于HBV-DNA的检测,可大大提高检测敏感性,对HBV感染后复制状态及传染性的判断的认识可弥补乙肝免疫检测五项的不足〔5〕。众多的研究表明:HBV感染后,不管s、e系统是否有抗体出现,也不管是否有活动性肝病,应用PCR技术均有可 442?医学信息2001年7月第14卷第7期 综述●