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细菌室操作手册

临床细菌检验工作的基本要求和技术

一、对临床细菌检验人员的要求

1.负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。

2.一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。

3.通晓细菌室守则,并严格遵守。

4.负责人应不断更新知识,了解细菌学检验的新进展。

5.定期或随时与临床医师联系,主动参与临床病例讨论,了解病情及治疗情况,达到细菌检验与临床的密切联系。

6.工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种,增强自身抵抗能力。

二、工作人员守则

在细菌室工作人员应注意,既不要给室内带来污染,也不要被室内的微生物感染。工作人员必须遵守以下规则:

1.穿专用的工作衣、帽入室;必要时应戴口罩。

2.不允许无关人员进入实验室。

3.室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。

4.养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。

5.操作中不可说话,以免口中飞沫污染标本。

6.每次完成工作和离开实验室前,应用肥皂洗手,接触了致病菌类,须用消毒剂消毒手。

7.个人物品不许带入室内。

8.当工作环境被细菌培养物污染,必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物,并报告主管人员采取必要的措施。

9.工作人员被细菌培养物污染,应用弱或中等消毒剂清洗,必要时应给予药物治疗,并向主管负责人报告,进一步采用特殊措施。

基本染色方法

染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时,用接种环沾取菌液点在载玻片上,标本可直接在玻片上涂布。菌落涂片时,先取生理盐水1滴,置玻片上,用接种针挑取菌落,在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式,或造成细菌鞭毛脱落,影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥,并经火焰固定,固定温度不宜过高,以玻片背面接触手背不烫为准,否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。

一、革兰染色

本染色是最基本的染色法,可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。

试剂

1. 结晶紫溶液

A液:结晶紫2g

95%乙醇20ml

B液:草酸铵0.8g

蒸馏水80ml

需在用前24h将A液、B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。

2.碘液

碘1g

碘化钾2g

蒸馏水300ml

碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升水,使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。

也可用少量蒸馏水,先将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。

3.脱色液:95%乙醇。

4.复染液

A. 贮存液:沙黄 2.5g

95%乙醇100ml

B. 应用液:A液10ml

蒸馏水90ml

染色方法:

1.涂片经火焰固定,加结晶紫液染1 min,清水冲去染液。

2.加碘液染l min,水洗。

3.加脱色液,不时摇动约10~30s,至无紫色脱落为止,水洗。

4.加复染液,染30s,水洗。

5.干后镜检。

二、抗酸染色

抗酸染色直接用于痰标本时,可以适当增加标本涂片的厚度,以提高检出率。染厚涂片时,须掌握复染色时间。如果背景过深,影响镜检。

奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性,取培养菌落涂片染色时,呈现两种现象,视野中有些菌细胞阳性,另外一些则阴性;有时同一个菌体上,红色的深浅亦有不同,观察时应予注意。

抗酸染色有两种常用方法:①碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。②荧光染料金胺O法

(也称金胺O-罗丹明B法)。

(一)碱性复红染色法

试剂

1.萋纳石炭酸复红溶液

碱性复红乙醇饱和溶液10ml

5%石炭酸溶液90ml

2.脱色剂*

浓盐酸3ml

95%乙醇97ml

3.复染液(吕弗勒美蓝液)

美蓝乙醇饱和溶液30ml

10%氢氧化钾0.1ml

蒸馏水100ml

染色方法

1.涂片经火焰固定,加石炭酸复红溶液,徐徐加热至有蒸汽出现,切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间),水洗。

2.加脱色剂,不时摇动玻片至无红色脱落为止,水洗。

3.加复染液,染0.5~l min,水洗。

4.干后镜检。分枝杆菌呈红色,背景为蓝色。

*:奴卡菌、放线菌标本染色时,脱色剂改用2%硫酸水溶液。

(二)金胺O-罗丹明B染色法

染剂

1.罗丹明B液:罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml;

2.0.1%金胺O液:金胺O 0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸5ml,混匀;

3.3%盐酸酒精;

4.稀释美蓝液:吕弗勒美蓝液10ml,加蒸馏水90ml,混匀。

方法

1.涂片固定后加第1液30~90s。

2.弃去第1液后加第2液染15min。

3.用第3液脱色1~2min,水洗。

4.滴加第4液染30s,水洗,待干,荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。

三、鞭毛染色

用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。在细菌鉴定中,特别是非发酵菌的鉴定中很重要。

鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落,或从斜面上刮菌苔涂片即可,但必须注意动作尽量轻,以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是

生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选择性培养基,如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。观察鞭毛时,应耐心寻找整个涂片上的菌细胞,因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样,应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。

鞭毛染色(改良Ryu法)

试剂

A液:5%石炭酸10ml

鞣酸2g

饱和硫酸铝钾液10ml

B液:结晶紫酒精饱和液

应用液:A液10份,B液1份,混合,室温存放。

染色方法

1.玻片的处理:要求用新的载玻片。用前须在95%酒精中浸泡24小时以上。用时从酒精中取出,以干净纱布擦干后使用。

2.在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制2个涂片。

3.用接种环挑取血平板上菌落少许,将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只需点一下,仅允许极少量细菌进入水滴,不可搅动,以免鞭毛脱落。

4.玻片置室温自然干燥。

5.滴加染液于玻片上,染色。

6.约10~15min后,用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上,影响镜检。

7.玻片自然干燥后,镜检时应从涂片的边缘开始,逐渐移向中心。寻找细菌较少的视野,鞭毛容易观察。细菌密集的地方,鞭毛被菌体挡住,不易观察。

四、异染颗粒染色

用于白喉棒状杆菌染色,异染颗粒可明显地被显示出来。

标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(Albert)法染色来观察异染颗粒。

试剂

甲液:甲苯胺蓝0.15g

孔雀绿0.2g

冰醋酸1ml

95%乙醇2ml

蒸馏水100ml

将各染料先溶于乙醇,然后加入水与冰醋酸的混合液中,充分混匀。静置24h后过滤备用。

乙液:碘2g

碘化钾3g

蒸馏水300ml

先将碘化钾加少许蒸馏水(约2m1),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后,加蒸馏水至300ml。

染色方法

1. 涂片经火焰固定,加甲液,染3~5 min。水洗。

2.滴加乙液,染l min。水洗。

3.干后镜检,菌体呈绿色,异染颗粒呈蓝黑色。

五、墨汁荚膜染色

用于观察菌体有无荚膜结构,借此鉴定某些菌,如新型隐球菌。

传统的方法是用印度墨汁,但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水代替,但应注意颗粒不能太粗,否则影响观察结果。有人用5%黑色素(nigrosin)水溶液做染料,效果较好。

试剂

印度墨汁或5%黑色素水溶液。

染色方法

将标本与1滴染色液在载玻片上混合,加上盖玻片,轻轻压一下,使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后,转换高倍镜确认。

葡萄球菌属

一、常规鉴定

葡萄球菌的鉴定:首先须与其他的革兰阳性球菌鉴别,然后再作属内种的鉴定。

(一) 与其他革兰阳性球菌鉴别

临床标本中常见到的革兰阳性球菌,除葡萄球菌属外,还有微球菌属和气球菌属等。所以,在菌属内菌种鉴定之前,首先与这几属细菌鉴别(见表)。

表葡萄球菌属与其他革兰阳性球菌的鉴别 a

菌名

特征b

严格

需氧

四联状

排列

紧粘

琼脂

5%NaCl

琼脂

触酶c

氧化酶d

(改良法)

厌氧下

葡萄糖

产酸e

耐药

杆菌肽f

0.04U/片

呋喃唑酮g

100ug/片

葡萄球菌属- D - b - + + - d + -

气球菌属- + - - + - - (+) - -

动性球菌属+ D - + + + ND - ND -

口腔球菌属- D + - - 土- + - -

微球菌属+ + - - + + + - - + 注: a.葡萄球菌属、动性球菌属、口腔球菌属、微球菌属皆隶于微球菌科。

b.符号:+,90%以上阳性;土,90%以上弱阳性;一,90%以上阴性;d,1l%一89%阳性;ND,未试验;

( ) 迟缓反应。

c.在某些菌种中出现触酶弱阳性或假阳性反应,是由于在培养中补充血红素,活化某些菌株触酶活性。

d.Faller和Schleifer改良氧化酶试验为检出细胞色素C。

e.标准的氧化—发酵试验。

f.+,耐药或无抑菌环,微球菌、口腔球菌、气球菌敏感,抑菌环10~25mm。

g.十,耐药或抑菌环≤9mm;一,敏感,抑菌环15~35mm。

h.表皮葡萄球菌有些菌株生长时紧固地粘附于琼脂表面,此种特性与细菌产生浓的粘液相关。

1.与链球菌鉴别:葡萄球菌与链球菌的区别如下:在镜下,葡萄球菌以单、双、葡萄状排列,菌体呈圆形。链球菌以成单、双、链状排列,菌体形态为圆形或椭圆形。葡萄球菌触酶试验阳性,链球菌则阴性。

2.与微球菌的鉴别:实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。在镜下,葡萄球菌以葡萄状排列为主,菌体较小;微球菌以四联排列为主,且菌体较大。葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性,微球菌阴性。此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。

(二) 临床8种常见葡萄球菌的鉴别

目前葡萄球菌已被命名有27个种。临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。

首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(包括中间和猪葡萄球菌)和凝固酶阴性的其他葡萄球菌,然后用新生霉素敏感试验。推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。

二、试验方法

(一)触酶试验(过氧化氢酶试验)

试剂:3%H2O2溶液,置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。

方法:先挑取固体培养基上的菌落,置于洁净的玻片上,然后滴加3%过氧化氢溶液1~2滴。

静置之,lmin内产生大量气泡的为阳性,不产生气泡的为阴性。

表有临床意义的8种葡萄球菌关键性鉴定

菌种

试验

D

N

A

β

V

|

P

B

需氧下产气

D

|

D

|

D

|

D

|

D

|

D

|

金黄色葡萄球菌+ + + + + - - d - + - + + + + + - - + + 表皮葡萄球菌- - - - + - (d)+ - + - + - - (+)(d)- - + + 溶血葡萄球菌 d - - - - + - - - + - - + d - (d)- - + + 里昂葡萄球菌 d - (+)- - + + d - + - d + - + (d)- - + + 施氏葡萄球菌- - + + + + - - (+)+ - - d - + - - - - - 腐生葡萄球菌 d - - - - - - + + + + - + d - + - - + + 中间型葡萄球- + d + + + - + + - - - + (d)+ d - - ±+ 猪葡萄球菌菌- d- + + - - d - - - + + - + - - - - +

注意点:1.注意过氧化氢为3%,应用30%浓的H2O2,用时稀释10倍。

2.不应在培养基上做试验。

3.每次试验时,应以阳性和阴性菌株做对照。

(二)葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验

葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶,玻片法为检测凝聚因子。

1.凝聚因子试验:取1滴蒸馏水于洁净的玻片上,用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中,制成浓的菌悬液,无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合,10s内观察结果,出现明显细菌凝块为阳性,否则为阴性。如超过10s可出现假阳性,有10%一15%金黄色葡萄球菌呈假阴性,因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

操作过程中的注意点:

(1)10s内观察结果。

(2)必须制备浓厚的均匀菌悬液。

(3)用EDTA抗凝的兔血浆为最好。

(4)加血浆后不要再混搅,以免细菌凝块分散变小。

(5)生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。

2.葡萄球菌凝固酶试验:用生理盐水将血浆4倍稀释,取0.5ml。然后挑取3~5个菌落于稀释血浆中,成浓菌悬液。置37℃水浴,3~4h后读取结果,凝固者为阳性。若阴性,继续观察到24h,不凝固者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照。

试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者,应见到明显的纤维蛋白凝胶块,出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固,应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育,才可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况:

①某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶,溶解纤维蛋白凝块。

②所用血浆缺乏纤维蛋白原。

③试验菌株不纯。

(三)碳水化合物氧化、发酵试验(OF试验)

葡萄球菌的OF试验应使用专用配方,不可与非发酵菌用的OF管混用。培养基用的指示剂必须

用水配制,因为个别菌株能分解乙醇产酸。

培养基:

酵母浸膏0.1g

胰胨1g

牛肉浸液l00ml

0.2%溴甲酚紫溶液lml

校正pH7.0,按常规方法加入1%的碳水化合物,分装,灭菌,备用。

溴甲酚紫的配制:溴甲酚紫lOOmg,0.01mol的NaOH 18.5ml,加水至50ml。

方法:挑取待检菌落,接种于2支O-F培养基管中,发酵管加灭菌液体石蜡油约lcm深,氧化管不加。35℃孵育24h后观察,培养基变黄即产酸。结果判定如下:

代谢型加石蜡不加石蜡

发酵产酸产酸

氧化不变色产酸

(四)新生霉素耐药试验

方法:挑取待检菌菌落数个,制成相当0.5号麦氏管(McFarland)浓度菌液,棉拭子浸透,挤去多余液,均匀涂在M—H平板上,贴上含5ug/片的新生霉素纸片,35℃孵育16~20h,抑菌环直径≤16mm为阳性(耐药)。试验时应以金黄色葡萄球菌ATCC25923做阴性(敏感)对照,以确认纸片是否有效。

(五)氧化酶(改良法)试验

试剂:

四甲基对苯二胺(TMPD) (Tetramethylphenylenediamine) 6.0g

二甲基亚砜(DMSO) (Dimethy sulfoxide) 100.0ml

溶解TMPD于DMSO中,置于避光玻塞瓶中,可在室温中保留几个星期。

方法:被检菌株移种于7%羊血琼脂上,30℃需氧条件下孵育15~18h,刮取菌落涂布于无色滤纸片上,加1滴上述试剂,阳性者在2min内呈深蓝色。

若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上,至少孵育3天以上,才可检测,阳性反应5~10min 出现。

链球菌属

一、常规鉴定

(一)属间鉴别

临床标本检到革兰阳性球菌、触酶阴性,除链球菌属外,尚有6个菌属,是:

肠球菌属Enterococcus 乳球菌属Lactococcus 无色藻菌属Leuconostoc 平面球菌属Pediococcus 孪生球菌属Gemella

气球菌属Aerococcus

在鉴别上述菌属时,关键是:①革兰染色。上述菌属的革兰染色特性相似,若从琼脂平板上涂片染色,无色藻菌属中某些菌种的形态呈现球杆形、杆形,容易与乳杆菌属菌种相混淆,后者触酶亦阴性。若生长在盐肉汤涂片,最容易出现不一致性。②触酶试验。目的是与葡萄球菌属和口腔球菌属鉴别。属间鉴别参见下表。

表触酶阴性或弱阳性的革兰阳性球菌的鉴别特征

菌属

试验 a

形态万古霉素

30ug/片

葡萄糖

产气

PYR LAP

6.5%

NaCl

45℃

生长

10℃

生长链状成对四联成簇

链球菌属+ + - - S - - b + - V -

肠球菌属+ + - - S - + + + + + c 乳球菌属+ + - - S - - b + V - +

气球菌属- + + + S - + - + - -

孪生球菌属+ + + + S - + V - - -

平面球菌属- + + + R - - + V + -

无色藻菌属+ + - - R + - - V - + 注:a.S,敏感;R,耐药;+,阳性反应;一,阴性反应;V,反应不定(有些菌株+,另外菌株-) b.化脓链球菌和L-garviae可阳性。

c.偶尔例外。

(二)属内鉴别

链球菌属内鉴别,首先观察在血液琼脂平板上的溶血环,是β溶血型,或非β溶血型,参照这二类溶血型菌种的鉴别。

1.β溶血链球菌的鉴定:β溶血型链球菌的鉴定都是检测特异多糖抗原称为链球菌群多糖抗原来分群,可采用商业性试剂盒,当前血清学诊断方法尚未普及之前,传统的对β溶血链球菌的鉴别仍是需要的。

A、B、D、G群细菌,一般可用杆菌肽、CAMP、胆汁七叶苷及PYR、VP等试验区别(见表)。

表β溶血链球菌的鉴别特征

血清学分

群种名

吡咯烷

酮酶

VP CAMP 七叶苷

杆菌肽

敏感

蕈糖黄色素山梨醇

A 化脓链球菌+ - - - + + - -

B 无乳链球菌- + + - - + + -

C 马链球菌- - -

D - - - -

C 似马链球菌- - - - - + - -

C 兽疫链球菌- - -

D - - - +

G LancefieedG群- - - + - -

A,C,F,G或

未分群

咽峡炎链球菌- + - + - - -

注:a.+,阳性;一,阴性;d,不同菌株。

b.有人认为咽峡炎链球菌与米勒链球菌是同义词。

2.非β溶血链球菌鉴别

肺炎链球菌的鉴定:生长在血琼脂平板上的菌落细小,圆形,表面光滑、灰白色、边缘整齐,半透明,开始扁平以后中心塌陷,呈脐窝状。菌体呈矛头状成双排列。该菌对Optochin敏感和胆汁溶菌试验阳性。

3.牛链球菌的鉴定:具有D群多糖抗原,6.5%NaCl不生长,PYR阴性,胆汁七叶苷阳性,与其他草绿色链球菌鉴别见下表。

表非β溶血型链球菌的鉴别

菌种/群

试验

Optochin

敏感

胆汁溶菌

胆汁

七叶苷

6.5%NaCl

肉汤

吡咯烷

酮酶

卫星现象CAMP 血清群

肺炎链球菌+ + - - - - - -

牛链球菌- - + - - - - D 无乳链球菌- - - - - + B 草绿色链球菌- - - b - - - - -

营养变异链球菌- - - - + + - - 注:a. +,阳性反应;-,阴性反应;土,有些菌株阳性,另外菌株阴性。

b. 偶见例外。

营养变异链球菌是草绿色链球菌的营养变种,在普通肉汤或琼脂平板上生长不良(通常发现在血液培养瓶中)。若培养基中加入吡哆醛或做“卫星现象”试验容易被发现,有二个种,即缺陷链球菌S.defectivus,毗邻链球菌S.adjacens。

草绿色链球菌的鉴定:革兰阳性球菌,触酶阴性,非β溶血、胆汁溶菌阴性,Optochin阴性,不存在B、D群抗原,6.5%NaCl肉汤不生长,PYR阴性,10℃,45℃不生长,胆汁七叶苷阴性,万古霉素敏感。该类链球菌种较多,目前临床仅鉴定到群,参见下表。

表草绿色链球菌的鉴定

种群

试验 a

甘露醇山梨醇VP 精氨酸七叶苷脲酶

变异链球菌群 c + + + - + -

唾液链球菌群- - + - + 土

血液链球菌群- - b - + + -

缓症链球菌群- - - - - -

咽峡炎链球菌群- b - b + b + + -

注: a.+,阳性反应;一,阴性反应;土,有些菌株阳性而另外菌株阴性。

b.偶见例外。

c.变异链球菌群包括:仓鼠、道尼、野鼠,猕猴、鼠亲缘链球菌,唾液链球菌群包括:肠、前腔链球菌,血液链球菌群包括:戈登、H.W群链球菌,缓症链球菌群包括:温和、口腔、血链球菌生物'型链球菌,咽峡炎链球菌群包括:中间、星座、米勒链球菌。

咽峡炎链球菌是未分群的链球菌,被认为是“米勒链球菌”的同义词,有β溶血的菌种,属于A、C、F、G群,也有非β溶血菌种,在A、C、G群链球菌中有小菌落型菌株。非β溶血,带有相同的Lancefield抗原,属于草绿色链球菌(“米勒”群)细菌,有3个种;米勒链球菌、中间链球菌、星座链球菌。

(三)与链球菌属相关菌属的描述

1.乳球菌属:原链球菌属中乳链球菌现成为乳球菌属。乳球菌和乳脂乳球菌在制酪和粮食工业生产中使用。临床标本中也常见到。该属菌种与肠球菌相似,唯一不同点是45℃不生长。

2.孪生球菌属:原麻疹链球菌现转入孪生球菌属,另一种是溶血孪生球菌。该属菌种曾从临床标本中检到,见于临床感染如心内膜炎。其特点是生长缓慢,可能被误认为营养缺陷链球菌,应用“卫星现象”试验区别开来。菌种鉴定,参照下表所示。

表孪生球菌属菌种鉴定

菌种

试验

革兰染色菌细胞排列吡咯烷酮酶甘露醇山梨醇

溶血孪生球菌+ - - 成双,四联,成簇麻疹链球菌+?+?+?成对,短链注:+,阳性;一,阴性;+?,弱阳性反应。

3.平面球菌属:该属菌种对万古霉素耐药,PYR阴性,发酵葡萄糖不产气,胆汁七叶苷、精氨酸阳性,含有D群抗原,不发酵乳糖,在含盐肉汤中生长缓慢,属内鉴别参见下表。乳酸平面球菌和戊糖平面球菌曾从临床标本中分离到。

表平面球菌属菌种鉴定

菌种

试验

麦芽糖阿拉伯糖淀粉蔗糖 6.5%NaCI肉汤

乳酸平面球菌- - - - +

戊糖平面球菌+ + - - +

危害平面球菌+ - - + -

糊精于面球菌+ - + + -

马尿平面球菌+ - - + +

微小平面球菌- - - - +

注:+,阳性,一,阴性。

4.无色藻菌属:该属菌种万古霉素耐药,PYR、LAP阴性,发酵葡萄糖(MRS肉汤)产气,有4个菌种曾从临床标本中检到,种间鉴别参照下表。

表无色藻菌属菌种鉴定

菌种

试验 a

水解

七叶苷

牛乳产

酸凝固

棉子糖蜜二糖

6.5%NaCI

肉汤

阿拉伯糖蕈糖5%蔗糖

枸橼酸无色藻菌+ - - - ±+ + +

乳无色藻菌- + + + - - - -

肠膜无色藻菌+ - b + + + b + + +

假肠膜无色藻菌+ + + b + - + + +

类肠膜无色藻菌+ ?+ + + + + -

乳脂无色藻菌- ?- - - - - -

葡聚糖无色藻菌+ ?+ + - - + - 注:a.+,阳性;-,阴性;?,不了解;5%蔗糖,菌细胞外产生多糖(粘质物)

二、试验方法

(一)溶血性检查

溶血性是鉴定球菌最常用的项目,也是鉴定过程中重要的一步。1919年Brown对溶血性进行了描述。

α溶血:或称甲型溶血,在血平板上,菌落周围部分红细胞被破坏,呈现一个草绿色环。

β溶血:或称乙型溶血,在血平板上,菌落周围红细胞完全溶解,呈现一个清楚透明溶血环。

γ溶血:或称丙型溶血,血平板上,菌落周围无红细胞溶解,因而无溶血环。

溶血性的识别可在血平板表面菌落周围和穿刺处通过肉眼观察,也可用显微镜观察。除在分离血平板上观察菌落周围的溶血性外,还可用以下方法确认。

材料:羊血平板。

方法:将标本接种于羊血平板上,用接种针在已接种过的血平板上扎2~3处,使细菌被接种到琼脂层深处,35℃孵育过夜。

观察结果:在接种针穿刺过处,羊红细胞完全溶解,形成无色透明区,为β溶血。羊红细胞部分溶解或不溶解呈草绿色的环,为α溶血。不溶解无溶血环为γ溶血。

(二) Optochin敏感试验

材料:Optochin (ethylhydrocupreine HCI。)纸片(直径6mm),每片含5μg。血平板。

方法:挑取被检菌落,涂在血平板上,贴Optochin纸片于接种处,35℃,烛缸孵育18h。

观察结果:抑菌环直径≥14mm为敏感,推断肺炎链球菌。

抑菌环直径≤14mm时参照胆汁溶菌,或为其他草绿色链球菌。

(三) 杆菌肽敏感试验

材料:含0.04U/片的杆菌肽纸片,血平板。

方法:挑取被检菌落,密涂于血平板上,接种量应大,以免出假阳性。贴上杆菌肽纸片,35℃过夜。

观察结果:形成抑菌环为敏感,则被检菌推断为A群链球菌。

(四) CAMP试验

材料:血平板,金黄色葡萄球菌A TCC25923。

方法:在血平板上,用金黄色葡萄球菌划种一条直线,再将被检菌距金黄色葡萄球菌3mm处垂直接种一短线。用同样方法接种阴性和阳性对照菌。35℃孵育过夜。

观察结果:在被检菌接种线与金葡菌接种线之间有一个矢形(半月形)加强溶血区,此即CAMP 试验阳性。阴性无加强溶血区。

(五) 胆汁-七叶苷试验(平皿法或斜面法)

培养基:

牛肉膏3g

七叶苷1g

蛋白胨5g

枸橼酸铁0.5g

胆盐40g

蒸馏水1000ml

琼脂1%

牛肉膏、蛋白胨和琼脂溶于400ml蒸馏水中,胆盐溶于400ml蒸馏水中,枸橼酸铁溶于l00ml 蒸馏水中,三者混合,加热充分溶解后,高压灭菌121℃ 15min。七叶苷溶于l00ml蒸馏水,过滤除菌,以无菌手续加到培养基中,倾倒平皿或斜面。

方法:接种被检菌1—3个菌落,涂划开,置35℃下,孵育24~48h。

观察结果:培养基变黑色或棕褐色为阳性,不变色为阴性。

注意事项:接种细菌量不能过大。本试验是测定细菌在胆盐中生长情况及同时分解七叶苷的能力,如接种菌量过大,细菌不需要生长而本身固有的酶足以造成七叶苷分解,出现假阳性结果。

(六)七叶苷试验

培养基:

蛋白胨5g

七叶苷3g

K2HPO41g

枸橼酸铁0.5g

蒸馏水1000ml

将上述成分加热溶解,分装试管,高压灭菌12rClomin。

方法:接种被检菌于培养基中,35℃过夜。

观察结果:培养基变黑为阳性,不变为阴性。

(七) 6.5%NaCl生长试验

培养基

NaCl 6.5g

牛肉粉0.3g

葡萄糖0.1g

蛋白胨1g

琼脂粉 1.8g

蒸馏水l00ml

溴甲酚紫指示剂适量

调整pH7.4,121℃ 15min灭菌后制成平皿或斜面。

方法:接种被检菌,35℃孵育过夜。

观察结果:培养基上生长出菌落并变黄色为阳性,不变色为阴性。

注意点:本试验是测定细菌在高盐中的生长能力,葡萄糖作为是否生长的指示剂。细菌接种量不能过大,否则细菌并不需要繁殖即可使葡萄糖产酸,培养基变色,导致假阳性结果。

(八) 色素试验

色素试验在鉴定B群链球菌的几个方法中,特异性最好。这是Noble改良的Islam法。

培养基:

淀粉10g

胨23.0g

NaH2PO4 1.48g

Na2HP04 5.75g

琼脂l0g

水1000ml

调pH7.4,121℃15min灭菌后,加入10ml灭活马血清,倾制平板或高层琼脂。接种细菌,35℃过夜培养。

观察结果:细菌菌落及周围的培养基呈黄色为阳性。

肠球菌属

一、常规鉴定

为便于鉴定,将肠球菌分成3个组,主要根据甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸来分群。

Ⅰ群菌种分解甘露醇、山梨醇、山梨糖。精氨酸水解酶阴性。

Ⅱ群菌种发酵甘露醇、水解精氨酸。不分解山梨糖,山梨醇不定。

Ⅲ群菌种水解精氨酸,既不发酵甘露醇与山梨醇,亦不分解山梨糖。

二、试验方法

丙酮酸盐利用试验

酵母浸出粉5g

磷酸氢二钾5g

氯化钠5g

丙酮酸钠10g

麝香草酚蓝104mg

蒸馏水1000ml

除指示剂外,上述试剂加热溶解,调整pH7.1~7.4后,再加指示剂,用13mm×l00mm试管分装,高压121℃ 15min。

方法:接种被检菌株于上述培养基中,孵育35℃ 7天以上,培养基由绿色变成明显黄色为阳性,如仍为绿色或黄绿色判定阴性。

嗜血杆菌属

一、常规鉴定

1.与相关菌属、种的鉴别:嗜血杆菌属常与放线菌属、艾肯菌属、心杆菌属、金氏菌属相鉴别,见下表。

表嗜血杆菌属菌种与相关菌种鉴别试验

菌种需

X

V

嗜沫嗜血杆菌+ - - - - + + + - + -

副嗜沫嗜血杆菌- + - - - + + + - + -

伴放线杆菌- - - - - + - - D + +

侵蚀艾肯菌- - - + + - - - - + -

人心脏杆菌- - + - - + + - + - -

产靛基质金氏菌- - + - - + + - - - -

嗜血红素嗜血杆菌+ - + - - + + - + + +

2.属内鉴别可利用分离培养时,对X、V因子的需要和溶血性可初步区别不同的嗜血杆菌种。

进一步的鉴别可通过生化试验来确定到种。流感嗜血杆菌发酵木糖,与埃及嗜血杆菌木糖不发酵相区别。杜克雷嗜血杆菌有特殊临床来源,所以较易诊断。属内种的鉴别见下表。

表嗜血杆菌属中种的特征

嗜血杆菌

因子

β

溶血

发酵

CO2促

进生长

ONPG b X V 葡萄糖蔗糖乳糖甘露糖木糖

流感嗜血杆菌 a + + - + - - - D + - -

溶血嗜血杆菌+ + + + - - - D + - -

杜克雷嗜血杆菌+ - - - - - - - - - -

副流感嗜血杆菌- + - + + - + - D D D

副溶血嗜血杆菌- + + + + - - - + - -

迟缓嗜血杆菌- + - W W - - - D - D

副嗜沫嗜血杆菌- + - + + + + D - + +

嗜沫嗜血杆菌- - - + + + + - - + + 注:a.包括埃及嗜血杆菌;D.不同结果;w.弱发酵反应

b.ONPG,O-硝基酚-β-D半乳糖吡喃苷。

(1) 流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌的鉴定。

用金黄色葡萄球菌作“卫星”试验阳性。但应注意“副流感”只需V因子即生长。可同时用M—H 平板作卫星试验,能在M—H平板呈卫星生长的菌可否定流感嗜血杆菌。二者也可用糖发酵试验加以鉴别。

(2) 作为院内感染病源追踪的流行病学的需要,对流感、副流感嗜血杆菌须鉴定到型。可用吲哚、尿素、鸟氨酸3个试验将“流感嗜血杆菌”分为8个生物型(详见表),或用血清学进行分型。

表流感嗜血杆菌及副流感嗜血杆菌生物型鉴别

靛基质尿素鸟氨酸脱羧靛基质尿素鸟氨酸脱

流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌

Ⅰ+ + + Ⅰ- - +

Ⅱ+ + - Ⅱ- + + Ⅲ a - + - Ⅲ- + -

Ⅳ- + + Ⅳ+ + +

Ⅴ+ - + Ⅴ+ - +

Ⅵ- - + Ⅵ+ + -

Ⅶ+ - - Ⅶ+ - -

Ⅷ- - - Ⅷ

注:a.埃及嗜血杆菌与流感嗜血杆菌Ⅲ生物型主要生化特性相似,二者区别参考有关资料。

二、试验方法

1.卫星试验:挑取可疑菌落密涂划种于血平板上或M—H平板上,再将金黄色葡萄球菌点种或划种其上,35℃24h孵育。如葡萄球菌菌落邻近处被检菌的菌落较大,远离葡萄球菌菌落处的菌落小或不生长,即“卫星”试验阳性。在血平皿上划上葡萄球菌时,X,V因子都具备,在M-P,平板上接种葡萄球菌、只具备V因子。

2.糖发酵试验

培养基:1%糖的酚红肉汤,并补充所需生长因子,方法参考奈瑟菌鉴定。

3.吲哚(快速法)试验:在pH 6.8的磷酸缓冲液(0.05mol)中,加0.1%的L-色氨酸。大量接种被检菌,孵育4h后,加Kovacs试剂。

4.尿素酶试验

培养基:

KH2PO40.1g

K2HPO40.1%

NaCl 0.5g

0.2%酚红水溶液0.5ml

蒸馏水100ml

pH 7.0高压后加20%的尿素溶液10.4ml。

方法:与其他菌相同。注意接种量要大,4小时观察结果。

肠杆菌科

一、常规鉴定

肠杆菌科虽然有100多个种,在临床常见的不过是其中的一部分,约20余种。从临床标本中分离的频率较高的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌。对3个菌种的鉴别鉴定,实验室可用常规的方法,一般不困难。其他菌种应按规程的操作从属到种的步骤进行。

(一)与其他科属细菌的鉴别

革兰阴性杆菌除了肠杆菌科外,还有弧菌科和非发酵菌。所以,肠杆菌科的鉴定首先应注意与这些菌的鉴别。可用形态、葡萄糖氧化或发酵、氧化酶、鞭毛等特性加以区别,见表。

表肠杆菌科与其他科菌的区别

试验肠杆菌科弧菌科非发酵菌

葡萄糖 F F 0/-

氧化酶- + + *

形态杆状弧形杆状

鞭毛周毛或无单毛单、丛毛、周毛、无注:*,不动杆菌、嗜麦芽黄单胞菌除外。

(二)肠杆菌科的初步分群

可用两个试验将肠杆菌科初步分为二大类,即苯丙氨酸脱氨酶试验和葡萄糖酸盐试验(也可用V-P试验),见表:

表肠杆菌科初步分类

菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐菌属名苯丙氨酸葡萄糖酸盐变形杆菌属+ - 埃希菌属- -

普罗威登斯菌属+ - 志贺菌属- -

摩根菌属+ - 沙门菌属- -

克雷伯菌属- + 枸橼酸杆菌属- -

肠杆菌属- * + * 爱德华菌属- -

沙雷氏菌属- + 耶尔森菌属- -

哈夫尼亚菌属- +

注:·有例外。

(三)苯丙氨酸阳性菌属及种的鉴别

苯丙氨酸阳性、葡萄糖酸盐阴性的有变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属。

1.各属的鉴别:变形杆菌属、普罗威登斯菌属、摩根菌属的区别可用H2S、鸟氨酸、枸椽酸盐三个试验,其鉴别见表:

表苯丙氨酸阳性的各属鉴别

试验变形杆菌属普罗威登斯菌属摩根菌属

H2S + - -

鸟氨酸+/- - +

枸椽酸盐+/- + -

2.变形杆菌属种的鉴别:变形杆菌属常见有三个种即普通变形杆菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌。产粘液变形杆菌仅从活的或死的吉普赛蛾幼虫中发现,与人类的关系未见报道。鉴别见表。

表变形杆菌属内种的鉴别

试验普通变形杆菌奇异变形杆菌潘尼变形杆菌

靛基质+ - -

鸟氨酸- + -

麦芽糖+ - +

3.普罗威登斯菌属种的鉴别:该属临床常见有3个菌种,即产碱普罗威登斯菌、斯图普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌,其鉴别见表:

表普罗威登斯菌属内种的鉴别

试验产碱普罗威登斯菌斯图普罗威登斯菌雷极普罗威登斯菌

尿素- -/+ +

蕈糖- + - 侧金盏花醇+ - +

4.摩根菌属的鉴定:摩根菌属常见1个种,即摩根摩根菌,其鉴定见”苯丙氨酸阳性的各属鉴别表”。

(四)苯丙氨酸阴性、葡萄糖酸盐阳性各属及种鉴别

1.葡萄糖酸盐阳性各属的鉴别:这类细菌有克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、哈夫尼亚菌属。可用动力、山梨醇、DNase、棉子糖等试验将其区别(见表)。

表5-3-28 葡萄糖酸盐阳性的各属的鉴别

试验克雷伯菌属肠杆菌属沙雷菌属哈夫尼亚菌属动力- + + +

山梨醇+ +/- + -

Dnase - - + -

棉子糖+ + +/- -

枸橼酸盐利用+a+ + -

鸟氨酸脱羧酶-d+b+c+

注:a.鼻硬结亚种、臭鼻亚种的某些菌株阴性。

b.聚团肠杆菌阴性。

c.芳香沙雷菌生物2群、普城沙雷菌、深红沙雷菌阴性。

d.解吗氨酸克雷伯菌阳性。

2.克雷伯菌属种的鉴别:克雷伯菌属有肺炎克雷伯菌(亚种)、臭鼻亚种、鼻硬结亚种、产酸克雷伯菌。肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌是临床中分离较多的,二者的区别在靛基质。另外,两个亚种虽然临床不多见,但已从臭鼻患者、呼吸道慢性病患者以及鼻硬结患者中分离到,因此,鉴别它们也是有一定的临床意义。可用甲基红、赖氨酸、丙二酸盐鉴别(见表5—3—29)。

表5-3-29 克雷伯菌属种的鉴别

试验产酸克—雷伯菌

肺炎克雷伯菌

肺炎亚种臭鼻亚种鼻硬结亚种

靛基质+ - - -

甲基红- - + +

枸椽酸盐+ + -/+ -

赖氨酸+ + -/+ -

丙二酸盐+ + - +

3.肠杆菌属种的鉴别:肠杆菌属常见有5个菌种:阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌、产气肠杆菌、格高菲肠杆菌。在其鉴别上,氨基酸脱羧酶试验的价值较大。坂崎肠杆菌、聚团肠杆菌可产生黄色素,为鉴定提供了较为明显的特征。聚团肠杆菌还有一个特点,就是赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸皆为阴性。坂崎肠杆菌与阴沟肠杆菌的区别在于山梨醇,坂崎肠杆菌为阴性,阴沟肠杆菌为阳性。格高菲肠杆菌与产气肠杆菌也很相似,可用尿素酶和山梨醇相区别。前者尿素酶阳性,山梨醇阴性;后者尿素酶阴性,山梨醇阳性。5个种的鉴别详见表。

表5-3-30 肠杆菌属种的鉴别

试验阴沟肠杆菌坂崎肠杆菌聚团肠杆菌产气肠杆菌格高菲肠杆菌赖氨酸- - - + +

鸟氨酸+ + - + +

精氨酸+ + - - -

山梨醇+ - -/+ + -

尿素酶+/- - -/+ - +

黄色素- + + - -

4.沙雷菌属种与哈夫尼亚菌属种的鉴别:沙雷菌属有8个种,但临床只有粘质沙雷菌相对较多见,可用阿拉伯糖、木糖与其他沙雷菌相鉴别(见表)

表粘质、液化沙雷菌的鉴别

试验粘质沙雷菌液化沙雷菌红色沙雷菌

阿拉伯糖- + +

棉子糖- +/- +

木糖- + +

鸟氨酸+ + -

哈夫尼亚菌属只有1个种,即蜂房哈夫尼亚菌,其特点是不分解乳糖(偶也有分解的,约5%),发酵葡萄糖产气,动力“+”,靛基质“一”,V—P“+”,枸橼酸盐“+”,H:S“一”,赖氨酸“十”,鸟氨酸“十”,山梨醇“一”,棉子糖“一”。该菌种的生化反应在25℃比较稳定,与其他菌属的区别见前表5—3—22。

(五)苯丙氨酸、葡萄糖酸盐阴性的各属及种的鉴别

1.这一类菌属有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华菌属、耶尔森菌属。他们的区别可用H2S、动力、枸橼酸盐、靛基质、赖氨酸、尿素6个试验相鉴别(见表5—3—32)。

表5-3-32 苯丙氨酸、葡萄糖酸阴性各属的鉴别

试验埃希菌属志贺菌属沙门菌属枸橼酸杆菌属爱德华菌属耶尔森菌属

H2S - - +/- +/- + -

动力+ - + + + - *

枸橼酸盐- - +/- + - - 靛基质+ -/+ - -/+ + -/+ 赖氨酸+/- - + - - +/- 尿素- - - +/- - +/- 注:·30℃以下培养有动力。

2.枸橼酸杆菌属种的鉴别:该属常见有弗劳地枸橼酸杆菌、异型枸橼酸杆菌、丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌等。三者的鉴别用靛基质、H2S、侧金盏花醇(见表5-3-33)。

表5-3-33 枸橼酸杆菌属种的鉴别

试验弗劳地枸橼酸杆菌异型枸橼酸杆菌丙二酸盐阴性枸橼酸杆菌H2S +/- - -

靛基质- + - 侧金盏花醇- + -

丙二酸盐-/+ + -

KCN生长+ - +

3. 爱德华菌属,虽有3个种,但只有迟缓爱德华菌具有临床意义。其特点是不分解乳糖,分解葡萄糖产气,产生H2S,动力“+”,靛基质“+”,V-P“-”,枸橼酸盐“-”,赖氨酸“+”,鸟氨酸“+”,其他糖和醇皆“-”。与其他菌属的区别见表5—3—22。

4.埃希菌属从临床标本中常分离的是大肠埃希菌,靛基质“+”,甲基红“+”,枸橼酸“-”,但某些菌株动力“-”,迟缓发酵或禾发酵乳糖。不产气的菌株与志贺菌属的区别见表5—3—34。出血性腹泻的大肠埃希菌,其中最常见的为Ο157:H7型,研究也较清楚。该菌种对山梨醇不分解(35℃24~48h)。最后用血清学诊断方法确定。

表5-3-34 埃希菌种与其他菌种的鉴别

试验蟑螂

埃希

大肠

埃希

大肠埃希菌

(代谢不活

泼菌株)

费格

森埃

希菌

赫尔

埃希

创伤

埃希

宋内

志贺

其他

志贺

聚团

肠杆

迟缓

爱德

华菌

不脱羧

莱克勒

靛基质- + [+] + + - - d [-] + +

V-P - - - - - - - - d - -

枸橼酸盐 d - - [-] - - - - d - -

硫化氢- - - - - - - - - + -

尿素水解- - - - - - - - [-] - [-] 赖氨酸+ + d + - [+] - - - + -

鸟氨酸+ d [-] + + - + - - + -

动力- + - + + + - - [+] + [+] 氰化钾生长- - - - + [-] - - d - +

丙二酸盐+ - - D - [+] - - d - +

葡萄糖产气+ + - + + + - - [-] + +

侧金盏花醇- - - + - - - - - - +

纤维二糖- - - + + + - - d - +

乳糖- + [-] - d [-] - - d - +

甘露醇- + + + + + + + + - +

蜜二糖- [+] d - - + [-] d d - +

鼠李糖+ [+] d + + + [+] - [+] - +

山梨醇- + [+] - - - - d d - -

木糖+ + d + + + - - + - +

粘酸盐 d + d - + [+] - - d - D 醋酸盐- + d + [+] d - - d - [-] 黄色色素- - - - + d - - [+] - [-y] 注:-,0~10%阳性;[-],11%~25%阳性;d,26%~75%阳性;[+],76%~89%阳性;+,90%~100%阳性;