MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

第16卷第2期V ol.16N o.2

草地学报

ACT A A GREST IA SINI CA

2008年3月

M ar.2008

MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

刘小琳1,康俊梅1,孙彦2,王继峰1,胡晓艳1,3,杨青川1*

(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100094; 2.中国农业大学草地研究所,北京100094;

3.西北农林科技大学资源环境学院,陕西712100)

摘要:以紫花苜蓿/中苜1号0(M edicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)7日龄无菌苗子叶为外植体,建立适用于农杆菌介导的转基因组织再生体系,并进行MsN H X1基因转化试验。Ms N H X1基因编码/中苜1号0液泡膜N a+/H+逆向转运蛋白,将其转化到/中苜1号0中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。利用PCR技术、RT-PCR技术及Dot Blotting 技术对转基因植株进行鉴定,结果显示:M sN H X1基因已经整合到/中苜1号0基因组内,并且可以转录为mRNA。

关键词:中苜1号;紫花苜蓿;M sN H X1基因;转化;转基因植株鉴定

中图分类号:Q785文献标识码:A文章编号:1007-0435(2008)02-0115-06

Agrobacterium-mediated Transformation of Alfalfa by MsNHX1G ene

and Molecular Detection for Transgenic Alfalfa

LIU Xiao-lin1,KANG Jun-m ei1,SU N Yan2,WANG J-i feng1,

H U Xiao-y an1,3,YANG Qing-chuan1*

(1.Institute of Animal Science,Chinese A cademy of A g ricultur al Sciences,Beijing100094,China;

2.China A g ricultur al U niv er sity,Beijing100094,China;

3.Co llege o f Reso urces

and Enviro nment,N o rthwest A&F U niver sity,Yang ling,Shaanx i Pro vince712100,China)

Abstract:In order to o btain the mater ials w ith better perfo rmance of salt to ler ance,the plant regener ation system m ediated by A gr obacter ium tumef aciens w as established using the co ty ledons as the ex plants from the sterile7-day old seedling s of Medicago sativa L.cv Zhongmu No.1and the genetic transfo rmatio n of MsN H X1gene w as conducted.The v acuo lar Na+/H+antiporter o f Zhongmu N o.1w as co ded by g ene MsN H X1and then transformed back into Zho ng mu N o.1.PCR,RT-PCR,and Dot Blo tting analy sis w ere used to verify the transg enetic plants and the results indicate that MsN H X1gene had been inserted into the g enom e of the transgenic plants and the ex trinsic gene had been transcr ipted to mRNA.

Key words:M edicag o sativa L.cv.Zho ng mu No.1;Alfalfa;MsN H X1g ene;T ransfor matio n;T ransgen-ic plants identificatio n

目前,土壤盐渍化问题已成为限制农业可持续发展和生态环境恢复所面临的主要问题[1~3],而苜蓿有限的耐盐能力限制着其栽种范围,急需对其耐盐性状进行改良,培育耐盐性强的紫花苜蓿(M.sa-tiva)新品种,扩大在盐碱地区的种植范围。随着分子生物学的快速发展,借助植物基因工程手段改良苜蓿性状已成为现代育种的重要途径,最常用的转基因方法是建立在植物组培基础上的农杆菌介导法。1988年,H inchee等首先用根癌农杆菌介导法获得了大豆转基因植株[4],本实验利用紫花苜蓿遗传转化中应用最多的根癌农杆菌LBA4404,通过PCR,Southern Blot,RT-PCR的方法检测再生植株。

M sN H X1基因是从/中苜1号0中克隆的与耐盐性相关的基因,对植物耐盐性起重要作用[5]。在烟草中基因H RP-C的导入可以超量表达[6],在拟南芥中,PAP1基因的转入可以MYB转录因子超量表达[7],本研究利用农杆菌介导法将MsNH X1基因再次转化/中苜1号0,希望能使Na+/H+逆向转运蛋白

收稿日期:2007-06-07;修回日期:2007-09-14

基金项目:/十五0国家高技术发展计划(863计划)(2002AA241101);国家自然科学基金项目(30471110)

作者简介:刘小琳(1982-),女,内蒙古赤峰市人,硕士研究生,研究方向为牧草生物技术;*通讯作者Author for correspondence,E-mail:qchy-ang66@https://www.wendangku.net/doc/1b9921444.html,

草地学报第16卷

得到超量表达,以期进一步提高苜蓿的耐盐性。

1材料与方法

1.1植物材料

/中苜1号0(M edicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)7日龄无菌苗子叶;农杆菌菌株为LBA4404;质粒为pBINHX,质粒载体含有MsN H X1基因。

1.2试剂

Taq DNA聚合酶、Taq TM H ot Start DNA poly-merase、限制性内切酶BamH?、EcoR?、EcoR?、H ind ó和Pst?均购自TaKaRa公司。DEPC为AMRESCO 公司产品,Tris和RNase A为Sigma公司产品,异硫氰酸胍购自Promega公司,dNTP为TaKaRa公司产品。其余常规药品均为进口或国产分析纯级。

逆转录试剂盒为Pro mega公司产品,核酸纯化试剂盒为TaKaRa公司产品,点杂交试剂盒为Roche公司产品。

1.3试验方法

1.3.1苜蓿的转化 a.直接从-80e冰箱中取1 mL用甘油长期保存的菌液,加入到40mL YEB+ Rif25mg/L+Str50m g/L+Km50mg/L液体培养基中,180r/min离心,28e培养过夜至A600U 0.6,准备侵染用。b.将切好的培养7d的苜蓿无菌苗子叶浸泡到农杆菌菌液中,侵染8min;留出一部分子叶作对照,分别为:CK1:未侵染的外植体放入U M+

2.4-D2m g/L+KT0.25m g/L上,检测培养基的有效性;CK2:未侵染的外植体放入U M+ 2.4-D2mg/L+KT0.25m g/L+75mg/L Km+ 500m g/L Cef上,检测抗生素的有效性。c.将侵染过的外植体接种到加盖一层无菌滤纸的UM+2.4-D 2mg/L+KT0.25mg/L培养基上,共培养7d。d.取出共培养后的子叶放入三角瓶中,按以下步骤清洗外植体表面的农杆菌:灭菌ddH2O;灭菌ddH2O+Cef (500mg/L);液体UM+Cef(500mg/L);每步清洗20 min,期间不断振荡。e.将外植体转入诱导愈伤组织形成的筛选培养基上培养(UM+2,4-D2mg/L+KT 0.25mg/L+75mg/L Km+500mg/L Cef),约20d 继代1次,并逐渐减少Cef用量到100m g/L。f.当子叶分化出抗性愈伤组织时,将其换到诱导体胚分化的筛选培养基培养(UM+2.4-D0.5mg/L+KT 2mg/L+75m g/L Km+100mg/L Cef),约25d 继代1次。g.当抗性芽长到1~ 1.5cm时,将其转到1/2M S+100m g/L Cef培养基中生根成苗,约30d后生根完全,即可移栽温室。

1.3.2再生植株的PCR检测利用CT AB[8]法少量提取再生植株的DNA,以备PCR扩增检测用。

1.3.3再生植株的RT-PCR鉴定利用异硫氢酸胍法提取上述结果呈阳性的植株总RNA,用无RN ase的DNase I消化可能存在的DNA,mRNA 逆转录后,用引物GUSF、GU SR进行RT-PCR电泳检查(表1)。

表1再生植株特异片段的检测

T able1Detect ion of specific frag ments o f regenerat ion plants

名称Name

上游引物

Upstream probe

下游引物

Dow nst ream probe

长度

L engt h

(bp)

退火温度

A nnealing

t emperat ure(e)

GU S部分片段GU S fragment GUSF:5c-GCAA CT GGA C

AA GGCA CT-3c

GU SR:5c-GA GCGT CGC

A GAA CA T T ACA-3c

75054

35S启动子片段

35S promot er f ragment P35S-1:5c-CT T A CGCAG

CA GGT CT CAT CA-3c

P35S-2:5c-CCACCT T CCT T T T

CCACT AT CT T-3c53054

MsN H X1基因中间片段MsN H X1gene fragment N HXF:5c-CCACCT AT(AT)A T(A T)

T T(CT)A AT GC(A GC)GG(AG)T T-3c

NHXR:5c-CA C(AT)ACACC(CT)T C(A G)

CC(CA G)A AGAC(A G)A G(A C)CT-3c25052

MsN H X1基因全长Whole M sN H X1gene Psy:5c-CACA AT CCCACT AT CCT T

CGCAA G-3c

Pgy:5c-CAAT T CCA CA GT T T T

CGCGAT CCA-3c170060

1.3.4再生植株的Dot Blotting检测

1.3.4.1探针标记以pBINH X为模板,用特异引物(上游引物5c-CACAATCCCACTAT CCT T CG-CAAG-3c,下游引物5c-CCAAAGTT AT T-GAAAGCACCAG-3c)扩增的DNA片段为探针,探针标记按照Ro che公司的/Dig H ig h Prim e DNA Labeling and Detection Starter Kit?0的操作手册提供的方法进行。

1.3.4.2Dot Blotting检测参考Sambrook等[9]方法和Roche公司的/Dig H ig h Prime DNA Labe-ling and Detection Starter Kit?0的操作手册提供的方法进行。

116

第2期刘小琳等:M sN HX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

2结果与分析

2.1目的基因MsNHX1对苜蓿的转化

培养7d的苜蓿无菌苗子叶,经农杆菌侵染,共培养结束后,转至诱导愈伤组织形成的筛选培养基中进行愈伤组织的诱导,约2周后即可看到愈伤组织产生(图1A);CK2中几乎所有的子叶都未能分化出愈伤组织,并随着时间的推移逐渐褐化死亡(图1B);而CK1中的子叶近100%分化出愈伤组织,且其愈伤组织比转化的生长更加迅速(图1C)。抗性愈伤组织生长到足够大时,转到诱导体胚分化培养基中诱导体胚的分化(图2A),当体胚长出的抗性芽约2~3cm长时(图2B),将其移入生根培养基中诱导生根(图2C),诱导生根的小苗转移到事先浸透的(营养土:蛭石=1:1)小花盆中繁种(图2D)。当苜蓿小苗长出健壮的根、茎、叶时,可将其移入大田(图2E)

。

图1不同处理下愈伤组织的分化情况

F ig.1Callus induction under differ ent tr eatments

图1(A)子叶经浸染且有500mg/L Cef胁迫的愈伤组织;图1(B)子叶未浸染但有500mg/L Cef胁迫的生长情况;图1(C)子叶未浸染且无C ef胁迫的愈伤组织

Fig.1(A)Callus of cotyledon after th e inoculation of A gr obacer ium and under the stress of500mg/L Cef;Fig.1(B)Cotyledon w ithout in-ocu lation of A g robacer iu m,but under the stress of500mg/L Cef;Fig.1(C)Callus of cotyledon neither through the inoculation of Ag robac eri-um n or un der the stress of

Cef

图2转基因苜蓿的组培

F ig.2T he tissue culture o f transgenic alfalfa

图2(A)转化苜蓿的胚状体;图2(B)具有抗性芽的愈伤组织;图2(C)生根的转基因小苗;图2(D)栽入小花盆中的转基因小苗;图2(E)栽入土中的转基因小苗

Fig.2(A)T he somatic embryo of transgenic alfalfa;Fig.2(B)T he callus w ith sh oots;Fig.2(C)T he transg enic plantlet w ith roots;Fig. 2(D)The transg enic plantlet in pot;Figur e2(E)T he transgenic plantlet in field

117

草 地 学 报

第16卷

2.2 再生植株的PCR 检测

以再生植株基因组DNA 为模板,用引物GU SF 、GU SR 扩增GU S 基因部分片段,其大小约750bp,P35S -1、P35S -2扩增35S 启动子部分片段,约530bp 。发现所选植株的DNA 中都能扩出目的片段(如图3A 、B),从而初步确定它们有可能为转基因阳性植株。再用引物NH XF 、NH XR 对上述结果呈阳性的植株进行M sN H X 1基因中间片段的PCR 扩增(如图3C),在所选的4株植株中,3号植

株PCR 结果为阴性,说明该植株可能是被空载体转化或未被转化,其它3株初步确定为转基因阳性植株。对于上述PCR 结果为阳性的植株,为检测基因组中外源基因的完整性,选用引物Psy 、Pg y 进行M sN H X 1基因全长的PCR 扩增(如图3D),所扩增的片段包括35S 启动子部分片段、M sN H X 1基因全长和GUS 基因的部分片段,约1.7Kb,在所选的11株植株中,有7株PCR 结果为阳性,初步判定它

们为转基因阳性植株。

图3 再生植株的PCR 检测

F ig.3 PCR ident ificatio n o f reg ener ation plants

图3(A)GU S 片段PCR 鉴定;图3(B)35S 启动子片段的PCR 鉴定;图3(C)M sN H X 1基因中间片段的PCR 鉴定;图3(D)M sNH X 1基因全长的PCR 鉴定

-为未转化植株阴性对照;+为质粒阳性对照。M 1:分子量标准DL2000;M 2:分子量标准DGL4000

Fig.3(A)PCR identification of GU S fragm ent;Fig.3(B)PCR identification of 35Promoter fragment;Fig.3(C )PCR identification of M sN H X 1gene fragm ent;Fig.3(D)PCR identification of w hole M sN H X 1gen e

-:Negative control;+:Positive con trol (plasm id pBINH X);M 1:DL2000marker;M 2:DGL4000mar ker

2.3 再生植株的RT -PCR 鉴定

总RNA 的质量是关系逆转录cDNA 完整性的重要因素。提取的紫花苜蓿总RNA 用无RNase 的DNase ?处理,除去污染的基因组DNA,结果见图4(A)。28S RNA 和18S RNA 条带清晰,浓度比例符合要求,表明提取的RNA 完整性较好。

以未转化的阴性对照和再生植株的叶片总RNA 为模板逆转录合成cDNA 第一链,用引物对?扩增GUS 部分片段,检测结果如图4(B)。阴性对照泳道2中没有扩增条带,而泳道1转化的植株中扩增出明显的特异条带。这表明表达元件中GUS 基因已经整合入基因组,并且可以转录为mRNA 。2.4 Dot Blotting 检测

用地高辛(DIG)标记的692bp 的探针对PCR

检测呈阳性的植株进行DNA Dot Blotting 检测(图5)。结果表明,A1质粒pBINH X 和植株A3、B4、C2、C5、D4出现杂交信号,而B1非转化植株和其它植株没有出现杂交信号。DNA Dot Blotting 进一步证明了部分转化植株中外源MsN H X 1已稳定整合到了苜蓿的基因组中。

3 讨 论

苜蓿的离体再生体系目前还不像模式植物如烟草那样稳定和高效。在外源基因转入苜蓿时,几乎所有器官或组织都可作为外植体,但是外植体的选择是决定组织培养成功的一个关键因素。Galleg o 等在利用子叶、下胚轴、叶柄和叶片做外植体时,得出叶柄是最好的外植体的结果,平均产生18个体细

118

第2期刘小琳等:M sN HX 1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

胞胚,8%的体细胞胚转变为正常的植株[10];Cuadrado 等在实验中也得到了同样的结论)))叶柄是最好的外植体

[11]

;Iantchev a 等利用杂花苜蓿

品种R108的根作外植体,根先被1mol/L 蔗糖溶液预处理48和72h 后,在液体培养基中培养,预处理72h 的根完成再生所用时间最短,需要55d,体细胞胚转化为完整植株的比例最大,达到70%[12]。由于苜蓿生长周期长的生物学特性以及该属种类繁多,基因组大等原因,要想获得比较统一可行的诱导和分化培养基,目前是比较困难的[13]

,不同的品种

需要不同的再生体系。

在本试验中,以苜蓿品种/中苜1号0为材料,以子叶为外植体,以UM +2,4-D 2mg/L+KT 0.25m g/L 为诱导愈伤组织生成的最佳培养基,这与陈晨等的研究结果一致[14]。

在对转基因植株鉴定方面,PCR 法是建立在核酸水平上最常用的检测方法,近年来,一些实验室尝试通过复合PCR 来检测转基因植株。在复合PCR 检测中,需在同一反应管中加入多对引物,反应中易产生二级结构和引物竞争,因而结果不够稳定,可同时检测的目标产物数量也会受到限制,且其中产物片段较大的往往扩增受到抑制[15]。所以本试验采取常规PCR 的方法,分别对GU S 基因部分片段、35S 启动子部分片段进行PCR 检测,但进一步的研究表明,一些整合有Gus 基因、35S 启动子基因的转基因株系的基因组中并不含有目的基因M sN H X 1,这可能与外源基因的整合机制有关,例如染色体上易位、倒位及重组的发生,都可能导致目标序列的删除或缺失,所以又对M sN H X 1基因中间片段及M sN H X 1基因全长进行PCR 检测,初步确定结果呈阳性的植株为转化植株。DNA Dot Blotting 检测,可有效地去除经PCR 结果为假阳性的植株,并具有较高的准确性,是转基因研究中快速有效的手段。但是对转MsN H X 1基因的/中苜1号0来说,探针的设计上要注意特异性,探针只能与转化植株的DNA 结合,才能起到筛选作用,这点与其他转外源基因植株的检测有所差别。

在核酸水平上对转基因植株进行检测后,转录水平检测RT -PCR 也是必要的。RT -PCR 结果说明,经PCR 、DNA Dot Blo tting 鉴定为阳性的转化苜蓿植株中,表达元件已经整合入基因组,并且在转录水平上未沉默。

4 结 论

以紫花苜蓿/中苜1号07日龄无菌苗子叶为外植体,建立了适用于农杆菌介导的转基因组织再生体系,所选用的培养基、抗生素浓度、农杆菌菌液侵染浓度适合/中苜1号0的转基因研究。本研究共获得42株再生植株,对它们进行的针对报告基因G US ,35S 启动子,MsN H X 1基因全长的PCR 鉴定,结果表明有18株的检测结果呈阳性;然后再对其中8株进行了RT -PCR 鉴定,共得到2个阳性株系;最后,又对这18个植株进行DNA Dot Blot 检测,共得到5个转基因植株。因此,我们得出的结论

119

草地学报第16卷

是:在42株再生植株中有5株目的基因MsN H X1已经整合到苜蓿基因组中,转化率为11.9%,并在转录水平上得到表达。

该实验将编码/中苜1号0液泡膜N a+/H+逆向转运蛋白的MsN H X1基因转化到/中苜1号0中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。此外,探针的设计上注意了探针的特异性,使探针只能与转化植株的DN A结合起到筛选作用[16],这点与其他转外源基因植株的检测有所差别。

本实验为其他基因转入/中苜1号0建立了适用于农杆菌介导的转基因组织再生体系,为其基因转化工作打下基础,为苜蓿新品系的培育提供了重要种质资源,对分子育种体系的建立具有重要的指导意义,为以后的生产实践奠定了理论基础。

参考文献

[1]Rhoades J D,Kan diah A,M ashali A M.T he use of saline wa-

ters for crop production[J].FAO,Irrigation an d Drainage Pa-per,1992:80-92

[2]Jacoby. B.M ech anis ms in volved in salt tolerance b y plants.

M.Pes sarak li(ed.),Handbook of Plant and Crop Stress.

M arcel Dekker[M].New Yor k,1993.97-123

[3]牛东玲,彭宏春,王启基,等.柴达木盆地弃耕地盐渍状况的主

分量分析[J].草业学报,2001,10(2):39-46

[4]H INC HEE M aw,DVCONNER W ard,NEWE LL C A.Pro-

duction of transgenic soybean plants us ing Agrobacterium m e-diated DNA tran sfer[J].Bio T echnology,1988(6),915-922 [5]H amada A,ibino T,amura T,et al.Na+/H+antip orter from

S ynechocystis species PCC6803,homologous to SOS1,contains an as partic residu e and long C-terminal tail important for th e carrier activity[J].Plant Phys iology,2001a,125:437-446[6]Laura H eggie and M arcel A.K.J ans en.T ransgenic tobacco

(Nicotiana tab acu m L.cv.Samsun-NN)plants over-express-ing a synthetic HRP-C gen e ar e altered in grow th,d evelop-men t and susceptibility to abiotic stress[J].Plant Phys iology an d Bioch emis try,2005,(43):1067-1073

[7]T akayuki T ohge,Yasutaka Nish iyama.Functional genomics b y

integr ated analysis of metabolom e and tran scriptome of Arab-i

dopsis plants over-exp ress ing an M YB transcription factor[J].

T he Plan t Jou rnal.2005,(42):218-235

[8]萨姆布鲁克J.,拉塞尔D.W.分子克隆实验指南[M].北京:科

学出版社,2002

[9]Sambrook J.M olecular Cloning,A Laboratory M an ual,2nd ed

[M].New York:Cold S pring H arb or Laboratory Press,1989.

475-490

[10]Gallego P,H ita O,Villalobos N,e t al.Somatic embry ogene-

sis and plant regeneration in M ed icag o arbor ea L.[J].Vitro Cell.Dev.Biol.Plant,2001,37(2):199-203

[11]Cuadrado Y,Guerra H,M artin A B,et al.Differences in in-

vertase activityin embryogenic and non-embr yogenic calli fr om M edicag oarborea[J].Plant Cell T https://www.wendangku.net/doc/1b9921444.html,.Cult.,2001,67: 145-151

[12]Iantcheva A,S lavov S,Prinsen E,et al.Emb ryo induction

an d r egen erationfr om root explants of M edicago tru ncatula af-ter osmoticpr e-tr eatm ent[J].Plant Cell T https://www.wendangku.net/doc/1b9921444.html,.Cu lt., 2005,81:37-43

[13]金淑梅,管清杰,罗秋香,等.苜蓿愈伤组织高频再生遗传和

转化体系的建立[J].分子植物育种,2006,4(4):571-578 [14]陈晨,曹致中,贺顺姬,等.农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体

系的建立与优化[J].甘肃农业大学学报,2004,39(5):516-519

[15]金芜军,郝旸,程红梅,等.用复合PCR方法检测6种转基因玉

米外源DNA中的特异性[J].农业生物技术学报,2005,11

(5):562-567

[16]毛培胜,张涛,杨青川.紫花苜蓿品种鉴定的RAPD分子标记技

术研究[J].草地学报,2007,15(2):124-128

(责任编辑梁艳萍)

120

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

植物杂交种鉴定的方法综述

Open Journal of Nature Science 自然科学, 2018, 6(3), 170-173 Published Online May 2018 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/1b9921444.html,/journal/ojns https://https://www.wendangku.net/doc/1b9921444.html,/10.12677/ojns.2018.63026 A Review of Methods in Plant Hybrids Identification Zhie Liu College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan Hubei Received: May 4th, 2018; accepted: May 22nd, 2018; published: May 29th, 2018 Abstract Hybridization is extremely prone to occur in nature, especially in the plant kingdom, which plays an important role in shaping the diversity of plants. Therefore, it is extremely significant to select suitable methods for identifying hybrids, and to have a certain understanding of the formation of hybrids and the conservation of species, which has an essential guiding significance. This article summarizes two methods of morphological identification and molecular marker aiming to provide reference for follow-up research. Keywords Hybridization, Identification, Methods, Review 植物杂交种鉴定的方法综述 刘志娥 武汉大学生命科学学院，湖北武汉 收稿日期：2018年5月4日；录用日期：2018年5月22日；发布日期：2018年5月29日 摘要 杂交在自然界极易发生，尤其在植物界，其在塑造植物的多样性中具有重要作用，因而选择合适的方法鉴定植物杂交种显得极其重要，对了解杂交的形成及在物种保育上具有一定的指导意义。本文简要综述了形态鉴定和分子标记两种鉴定方法，以期为后续研究提供借鉴。

植物及其产品转基因成份检测抽样及制样方法征求意见稿

SN/T1194—×××× I ICS SN 植物及其产品转基因成份检测 抽样及制样方法 Methods of sampling and preparation of samples for detection of genetically modified components in plants and their derived products （征求意见稿） 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布

SN/T1194—×××× II 前言 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布。 本标准代替SN/T1194-2003《植物及其产品转基因成份检测抽样和制样方法》。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曹际娟、郑江、陈红运、黄新、陈颖、朱水芳。 本标准系代替了SN/T1194-2003。

SN/T1194—×××× 植物及其产品转基因成份检测 抽样和制样方法 1 范围 本标准规定了植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样方法。 本标准适用于植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 0798 进出口粮油、饲料检验检验名词术语 SN/T 0799 进出口粮油、饲料检验检验一般规则 SN/T 0800.1 进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法 SN/T 0952 进出口商品抽样检验程序孤立批计数抽样批不合格品率的估计及样本量的选（适用于批量较大的情形） GB/T 10111 随机数的产生及其在产品质量质量抽样检验中的应用程序 GB/T19495.1 转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法 3 定义及术语 3.1 定义 转基因植物 Genetically Modified Plants 指用基因工程技术或者现代生物技术改变基因组构成的植物。 3.2 术语 本标准采用SN/T 0798中的一般术语以及GB/T19495.1、GB/T19495.7中的术语。 4 总则 4.1 一般规定 4.1.1 抽取及制备的样品应具有代表性。 4.1.2 应确保抽样器具清洁、干燥、无异味，抽样、制样器具及样品容器所用材质不应对待抽取样品造成污染。 4.1.3 为避免交叉污染，尽可能使用不同的抽样和制样器具或设备抽取和制备不同交付批的样品，盛装样品的容器或包装应尽可能一次性使用。如果不能做到（例如使用机械取样设备时），则应在抽取和制备一个交付批的样品后使用适当方法清洁所有器具和设备。 4.1.4 在所有抽样过程中应避免样品散落，防止有活性的生物污染生态环境。 4.1.5 应在物理隔离的区域制备样品，防止对其他区域或实验室的污染，并应及时清洁制样区域。4.1.6 必要时使用DNA销毁剂处理抽样和制样器具和设备、样品容器及制样区域。 4.1.7 适用时，应参照GB/T 1949 5.1《转基因产品检测通用要求和定义》中的规定防止污染。 4.1.8 抽样时应注意保护样品，抽样器具和样品容器应存放于清洁的环境中，避免雨水和灰尘等外来物引起的污染。 1

转基因植物产品检测实验室一览

转基因植物产品检测实验室一览 序号仪器名称用途参考品牌型号与配置大大致预算 1 高速冷冻离心机生物样品的高速分离 （冷冻保持样品生活 活性）。 德国eppendorf；美国 Thermo；德国Sigma； 德国Herolab。 50000 120000 2 定性PCR扩增仪 微量基因片段 （DNA/RNA）的扩增 德国Peqlab、美国ABI、 德国eppendorf、美国 Bio-rad。 50000 110000 定量CR扩增仪 （荧光定量PCR） 扩增的同时对基因片 段做定量检测。 美国ABI、德国 eppendorf、美国 Bio-rad。 250000 780000 3 PCR专用工作台保证PCR时的无污 染。（或建设标准的 PCR层流实验室） 德国Peqlab。 （国产超净台也可替 代。） 10000 34000 4 电泳槽、电泳 仪 基因片段扩增之后跑 凝胶。 德国Peqlab、美国 Bio-rad。或北京六一。 15000 40000 5 凝胶成像系统对凝胶进行分子量、 等定性分析 法国VL，美国Bio-rad、 或国产。 350000 150000 6 紫外透射仪国产6000 15000 7 制冰机国产20000 35000 8 CO2培养箱美国Tehrmo。美国 shellab 20000 50000 9 液氮罐国产。4000 10000 10 超纯水 美国millipore；美国 Tehrmo。 40000 76000 双蒸馏水发生 器 国产 4000 18000 11 分子生物常用耗 材与试剂 5000 10000 12 转基因专用试剂5000 10000 其他设备： 细胞融合仪、核酸提取仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪磁力搅拌机杂交仪、-30℃低温冰箱、超低温冰箱、漩涡混合器、超声波细胞粉碎仪、自动恒温酶标。

植物转基因技术

植物转基因技术 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

生物工程的导论论文之植物转基因技术 生物1002班郭雅莉 201041006 摘要：目前，转基因技术已经成熟，转基因作物已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。为此，我将对植物转基因技术及其应用、和当代社会发展的概况进行系统阐述，同时对转基因食品的安全性问题进行系统的讨论。 关键词：国际状况转基因技术应用安全性问题 自1983年美国在世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 然而由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食 品”[1]。 一、国际植物转基因技术状况简介 转基因技术已在多种植物上获得成功，转基因的棉花、大豆、玉米、水稻、烟草、番茄、油菜等重要粮食作物和经济作物已作为商品投入市场。其进入田间实验的种类不断增加，除转基因粮食作物之外，转基因蔬菜、瓜果、牧草、花卉、林木及特用植物数量逐渐增加，基因种类和来源日益丰富，转基因性状日趋多样复杂。 在所涉及的转基因方法中，农杆菌介导法占50种，基因枪轰击法24种，DNA直接转移法2种，电击介导法2种，化学介导法1种[5]。已把一

植物抗逆性的鉴定(电导仪法)

植物抗逆性的鉴定（电导仪法） 一、原理 植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。在正常情况下，细胞膜对物质具有选择透性能力。当植物受到逆境影响时，如高温或低温，干旱、盐渍、病原菌侵染后，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，以致植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。这样，比较不同作物或同一作物不同品种在相同胁迫温度下膜透性的增大程度，即可比较作物间或品种间的抗逆性强弱，因此，电导法目前已成为作物抗性栽培、育种上鉴定植物抗逆性强弱的一个精确而实用的方法。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：小麦、女贞叶片; （二）仪器设备：1）电导仪；2）天平；3）温箱；4）真空干燥器；5）抽气机；6）恒温水浴锅；7）注射器。 （三）试剂：NaCl溶液 三、实验步骤 1）制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测定，可读出电导度。 1）制作标准曲线：如需定量测定透性变化，可用纯NaCl配成0、10、20、40、60、80、100μg/ml的标准液，在20～25℃恒温下用电导仪测定，可读出电导度。2）选取小麦或其他植物在一定部位上生长叶龄相似的叶子若干，剪下后，先用纱布拭净，称取二份，各重2g。 3）一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻

杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。 3）一份插入小杯中放在40℃恒温箱内萎蔫0.5～1h，另一份插入水杯中放在室温下做对照。处理后分别用蒸馏水冲洗二次，并用洁净滤纸吸干。然后剪成长约1cm小段放入小玻杯中（大小以够容电极为度），并用玻棒或干净尼龙网压住，在杯中准确加入蒸馏水20ml，浸没叶片。 4）放入真空干燥器，用抽气机抽气7～8min以抽出细胞间隙中的空气；重新缓缓放入空气，水即被压入组织中而使叶下沉。 5）将抽过气的小玻杯取出，放在实验桌上静置20min，然后用玻棒轻轻搅动叶片，在20～25℃恒温下，用电导仪测定溶液电导率。 6）测过电导率的之后，再，放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。 6）测过电导率的之后，再，放入100℃沸水浴中15min，以杀死植物组织，取出放入自来水冷却10min，在20～25℃恒温下测其煮沸电导率。 四、实验结果及分析 比较不同处理（萎蔫处理与对照）的叶片细胞透性的变化情况，记录结果，并加解释。 生科院07级8班董悦200711320801

植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定

植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定 金万枚　巩振辉　李桂荣　张桂华 (西北农业大学　陕西杨陵　712100) 提　要　对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。 关键词　植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。关 3国家自然科学基金资助,项目编号39770522。 优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。 3.3.2　播种　研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6～8kg,渭北应控制在9kg。播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2～3d。提倡机械以精量半精量播种。 3.4　灌水 灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。 3.5　地膜覆盖 地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。优质专用小麦可以采用地膜栽培,但不应忽视地膜覆盖后对小麦生育期及农艺性状的影响,比如植株增高,应采取化控措施,在小麦返青～起身期,喷施壮丰安防止倒伏;再如部分病虫害发生的提前与危害加重问题,应及时开展病虫防治,减少对产量和品质的影响。同时提供麦收前一个月揭膜,减少地膜污染。 3.6　病虫害防治 优质专用小麦病虫害的防治,应尽量减少化学药品残苗,不要影响食用品质。应坚持综合防治的原则,要采用农业防治、物理防治和生物防治措施,减少化学药剂防治次数;选用高效低毒低残留农药;收获前20d以内严禁施药;使用农药增效剂,提高防治效果。 3.7　收获 收获是优质专用小麦栽培的最后一个环节;也是比较关键的环节。要做到单收、单贮、单独销售,实现优质优价优加工。

农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。 2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

转基因植物的检测与鉴定

收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #

关于植物转基因技术的一些读书报告

关于植物转基因技术的一些读书报告 在生物工程导论课上，我了解到了一些关于植物转基因技术的知识，对此产生了浓厚的兴趣，加上自己的专业在以后会有这方面的学习和发展，所以查阅了一些相应的资料，有了一些感想。 世界上首次使用植物转基因技术是1983年美国获得了转基因烟草，自 此以后，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用。目前，转基因技术已经成熟，转基因作物也已进入产业化阶段，而且种植面积逐年扩大，呈直线上升趋势。植物转基因技术主要应用于农业，生物和医学等领域。进行植物品种的改良，新品种的培育以及作为生物反应器生产生物药物和疫苗等。世界上已通过转基因技术培育出许多产量高、品质好、抗性强的农作物新品种，生物技术产品已应用到医药，保健食品和日化产品等各个方面，生物制药产业已成为最活跃，进展最快的产业之一。因此，人们将以转基因技术为核心的生物技术上的巨大飞跃誉为第二次“绿色革命”。这次技术革命将使全球农业生产发生深刻的变革，使人们看到消除饥饿与贫穷的希望。植物转基因技术巨大的生产潜力将为人类带来很大的经济效益和社会效益，并将辐射性地影响人类社会、经济、技术、生活、思想等方面的发展。 但是，像其它新生事物的发展过程一样，由于人们最初对转基因技术的认识不足或不理解，以至对转基因技术存在不同的态度和看法甚至偏见，使植物转基因技术面临着不少冲击。在20世纪末，转基因作物的安全性问题 就在全球范围内引起了激烈的争论，反对者认为转基因作物具有很大的潜在危险，可能会对人类健康和生存环境造成威胁。在欧洲，转基因作物曾被一些媒体称之为“恶魔食品”。甚至当前，一些电视、广播、报纸等新闻媒体为了某些利益也对公众进行炒作和误导，夸大转基因作物的风险，使人们对转基因技术及其转基因食品由最初的争论演变为恐慌甚至存在一定的抵触 情绪。如某电视广告中所提到的：某某食用油，不含转基因成分，为健康加油；某网站新闻报道：湖北某超市惊现转基因大米等等，使人们对当前社会上对转基因技术存在的一些偏见。 在此我希望可以尽量避免偏见，对植物转基因技术的应用和当代社会发展的概况进行一些比较系统的阐述，对植物转基因技术与当代社会发展的关系进行一点探讨。 植物转基因技术的基本概念和原理 基因是生命体具有的特定遗传信息和遗传效应的核苷酸序列，存在于DNA （脱氧核糖核酸）上，是控制生物性状遗传的结构和功能单位。转基因是指利用分子生物学手段，将人工分离和修饰过的某些生物的基因转移到其它物种，以改造该物种的遗传特性。植物转基因技术又称植物基因工程，是把从动物、植物或微生物中分离到的目的基因转移到植物的基因组中，即对植物进行遗传转化，使其在性状、营养和消费品质等方面满足人类需要的技术。应用转基因技术构建的植物为转基因植物，又叫基因修饰植物，其中发展最快的是转基因植物食品。 植物转基因技术的内容包括：目的基因的分离和鉴定、植物表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、转化细胞的筛选、转基因植物细胞的鉴定以及外

识别植物种类方法

1.2 识别植物种类的方法 一、运用植物的分类原则和演化趋向的理论来提高识别各个植物类群的能力 裸子植物是介于蕨类植物和被子植物之间的、能产生种子（不形成果实）的一群维管束植物；被子植物的最显著特征就是种子外包有子房壁（形成果实），是一群演化水平最高、结构与机能最复杂、种类最多、经济用途最大、分布最广的最高级的维管束植物。 植物在长期的演化过程中，在自然条件下不断地选择和影响下，它们的外部形态和内部解剖构造等特征，与其亲缘关系和进化的程度，一般来讲是相适应的、是统一的。因此，植物的特征，特别是形态特征，便成为人们容易辩论和掌握的植物系统演化上的重要标志。系统分类既然必须以进化原则为依据，则植物的形态学特征便成为分类的主要标准之一，特别是花和果实的形态特征作为分类的标准最为普遍，因为这些特征的变异要比营养器官小，相对来讲是比较稳定的。 在被子植物的分类中，一般以子叶的数目、叶脉的类型、中柱的类型、花部排列的状况、数目、离生或合生，两性或单性，以及果实、胚乳的有无等作为纲、目、科的特征；而各部器官的形状、大小、颜色、有毛与否等性状，则常用作属、种的分类依据。习惯上把现存分类群中也为祖先所具有的性状看作是原始的性状，而把那些多少显得特化的性状看作是进化的性状。如能掌握这些分类原则和演化趋向的理论，就可以帮助我们判断每个植物类群在整个植物系统演化中的位置，也就是说，这个植物类群在系统演化中是属于原始的类群，还是比较进步或是最高级的植物类群。 二、注意从植物与环境的辩证关系中提高识别植物种类的能力 任何植物的生长发育，和周围的环境是密不可分的。也就是说，每一种植物在通常的情况下，只能在对它适宜的环境条件下生长发育。植物的这种特性，正是在植物长期对环境条件的适应过程中所形成的。因此，在不同的环境条件下，就会有不同的植物种类。如水稻可以生长于水田，而玉米、小麦只能种在旱地，柑桔生长于我国亚热带，而苹果则分布在温带。植物的生长发育规律又能反映环境的各种特点，如常绿林植物反映出该地区全年温度较高，雨量丰富；落叶植物是冬季低温的反映。而植物的生长发育对环境也必然会产生一定的影响。由此可见，植物与环境有着极为密切的辩证关系。植物能改造环境，同时又是一定环境条件下的产物。 环境是各个生态因子的总和，它包括光、温度、水、空气和土壤等，这些因

转基因检测试剂盒(植物)介绍

转基因检测试剂盒(植物)介绍 在今年年初，农业农村部制定了《2020年农业转基因生物监管工作方案》，该方案的主要就是为了切实做好农业转基因生物安全监管工作，保障我国农业转基因生物研究与应用的健康发展。一直以来，转基因作物及其产品的检测技术是转基因生物安全管理的基础和技术保障，随着转基因技术研究和应用的不断扩大，国际贸易日益频繁，引种交流力度加大，每年都涌现出大量新的转化体和新的加工品，因此，只有通过准确检测和科学溯源，才能确保标识制度的实行，才能实现对转基因作物及其产品的有效监督和有力监管。那么，对于不可见的转基因物质我们该如何快速有效地检测呢？可以使用转基因检测试剂盒。 Cry1C 转基因检测试剂盒也叫转基因植物蛋白浓度测定试剂盒，可用于转基因作物叶片蛋白浓度测定，转基因Cry1C 试剂盒系用特异性抗Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的Bt-Cry1C 蛋白。 【Cry1C转基因检测试剂盒原理】 转基因Cry1C 试剂盒系用特异性抗Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的Bt-Cry1C 蛋白。 【Cry1C转基因检测试剂盒试剂准备】 试剂盒中的20×浓缩洗涤液30 ml 加570 ml 灭菌ddH2O 溶解稀释至1×洗涤液， 5×抽提液（30 ml）加120 ml ddH2O 稀释至1×抽提液，4℃存放备用。 【样品准备】 称取约20 mg 叶片，加0.5 ml 1×抽提液（使用前30 min 放置室温）研磨至匀浆，室温放置30 min，测定前把样品上清液稀释5-20 倍。 测定茎干和胚乳中的Bt 蛋白时，样品称取约40 mg，加1 ml 1×抽提液研磨。 【Cry1C 转基因检测试剂盒注意事项】 1. 测定中需使用的所有试剂和96 孔板提前30 min 放置室温温育（否则会影响试验准确性），注意12 连管必须温育后再从平板上取下，未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存； 2. 试剂使用前应充分摇匀； 3. 摇动平板混匀时注意避免样品之间交叉污染；

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1．了解创建烟草突变体库的方法； 2．理解每种方法的基本原理； 3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数

据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。

常见植物转基因技术

五种常用的植物转基因技术 植物转基因技术是通过各种物理的、化学的和生物的方法将从动物、植物及微生物中分离的目的基因整合到植物基因组中，使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物预期性状的一种生物技术方法。1983年，首例抗病毒转基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技术改良农作物。目前，植物转基因技术已在作物改良和育种领域发挥了重要作用。通过植物转基因技术，一些来自于动物、植物及微生物的有益基因如抗病／虫基因、抗非生物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以改良现有的农作物和培育新的农作物品种。以DNA重组技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的来源，打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障。植物转基因技术已应用到玉米、水稻、小麦、大豆和棉花等许多农作物。同时，该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中‘1’纠。目前，根据转基因植物的受体类型，植物转基因方法可以分为3大类：以外植体为受体的基因转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法和超声波介导法；以原生质体为受体的基因转化方法，如聚乙二醇法、电击法、脂质体法及磷酸钙-DNA共沉淀法；以种质系统为受体的基因转化方法，如子房注射法和花粉管通道法。由于以原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大，培养过程繁杂，培养工作量大且培养技术不易掌握；原生质体再生植株的遗传稳定性差、再生频率低并且再生周期长；相关的转化方法的转化率低、效果不理想等缺点，所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用。本文将对农杆菌介导法、基因枪法、超声波介导法、子房注射法和花粉管通道法的原理、基本步骤和优缺点作以简要介绍。 1 以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用、最实用有效并且具有最多成功实例的一种植物转基因方法。农杆菌是一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。目前，用于植物转基因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌。某些根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200 -800bp的结构和功能相似的Ti质粒和Ri质粒。Ti质粒和Ri质粒含有3个功能区：参与农杆菌侵染植物过程的vir区、参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区、在农杆菌中启动质粒复制的ori区。在vir区上的vir操纵子群作用下，Ti质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内，而后将T-DNA整合到植物基因组中。T—DNA是质粒上一段10—30kb 的序列，它的两端各有一段高度保守的25bp的同向重叠序列。由于T-DNA转化无序列特异性，因此可用任何基因片段代替原来的T-DNA基因片段进行。 农杆菌介导法的原理是：在农杆菌基因ehvA，chvB，pscA，and att家族所编码的蛋白和植物伤口产生的酚类物质和糖类物质的共同作用下，农杆菌识别并附着在宿主细胞壁上。virD4和virB基因编码蛋白组成的type IV分泌系统将单链VirD2-T-DNA复合体运送到宿主细胞内。此外，VirE3、VirE2和VirF蛋白也通过该系统进入宿主细胞质中。在宿主细胞质中，VirE2蛋白与VirD2-T-DNA复合体结合。在V irD2核定位信号、某些农杆菌蛋白和宿主细胞蛋白的共同作用下，VirD2-T-DNA复合体进入细胞核。在VirD2、VirE2、某些宿主细胞核蛋白如AtKu80和DNA连接酶的作用下，T-DNA被整合到宿主基因组中，但具体过程不详。 农杆菌介导法的基本步骤是：(1)诱导目标植物外植体；(2)构建含有目的基因的质粒；(3)质

植物制片的染色及显微化学鉴定方法

植物制片的染色及显微化学鉴定方法 集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#

植物制片的染色及显微化学鉴定方法 一、目的与要求 1、学习植物制片的一般染色方法。 2、学会并掌握常用显微化学鉴定法，即细胞壁化学组成及细胞内主要后含物性质的鉴定方法。 二、材料和用品 1、自备材料：植物叶片、芹菜叶柄、土豆块茎、花生种子等等，解剖器、剃刀或双面刀片。 2、其它材料和用品：显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、吸水纸、蒸馏水、染色缸；%番红、% 固绿或1%苯胺蓝等染液、中性树胶、二甲苯、酒精、碘—氯化锌、盐酸—间苯三酚、苏丹Ⅲ、碘—碘化钾、10%氯化铁、盐酸等。 三、实验内容 1、植物制片的染色方法 2、常用显微化学鉴定法 四、实验方法 1、植物制片的染色方法 用徒手切片法切得的薄片，如果仅仅是为了临时观察，制成临时装片即可，这种临时制片不能长久保存，只能作临时观察之用，又由于没经过染色，结构显示的也不够清晰。为了求得更清晰地显示其细微结构及化学成分，并能够较长时间的保存，可以进一步染色及其它处理以至封片，从而可制成半永久或永久制片。常用的染色方法是番红—苯胺蓝（或固绿）二重染色法，具体操作方法有二： 方法一： （1）将植物切片材料放入30%酒精中，5分钟后移入水中。 （2）用%番红水溶液染色12—24小时。 （3）倒去番红液，用清水冲洗数次后，再放回50%酒精中浸泡5分钟。 （4）将材料从50%酒精中转入70%酒精中脱色，直至硬木质化的细胞壁呈现红色，其它部分呈粉红色或近于无色时为止。 （5） 1%苯胺蓝（用70%酒精配制）对染2—5分钟。若用%固绿对染，则仅需半分钟左右即可。注意：此步染色，要不时地在显微镜下检视，切忌染色过深，当木质化细胞壁呈红色，其它部分为淡蓝或淡绿色时，即可停止。 （6）用95%酒精冲去多余染液，再经无水酒精脱水5分钟。 （7）放入等量无水酒精与二甲苯溶液中及纯二甲苯中透明各3分钟。 （8）将切片材料移入载玻片上，在二甲苯未干时立即加一滴中性树胶封片，尔后将玻片平放，自然凉干或置于摄氏35度温箱中烘干。 染色结果：木质化细胞壁呈现红色，纤维素细胞壁呈现蓝色或淡绿色。 方法二： （1）将切得的薄片移入盛有FAA固定液的小容器中，盖上盖固定半小时到1小时，24小时以上也可。材料经固定如不及时制片可移入70%酒精中长期保存。 （2）材料从固定液中移入盛有蒸馏水的小培养皿中，漂洗半小时到1小时，换水一次。 （3）将材料移入载玻片上，用吸水纸吸去多余水分，加一滴苯胺番红染色约10分钟。 （4）吸去染液，滴入95%酒精洗两次，去浮色及脱水。 （5）加一滴苯胺固绿复染约2～5秒钟，并轻轻晃动玻片，使染色均匀。（注意：此步骤要迅速，若染色时间过长会使红色全部褪去。） （6）吸去染液，滴入无水酒精洗两次，去浮色及脱水。

转基因植物及其产品检测 通用要求

转基因植物及其产品检测通用要求 前言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准起草单位：中国农业科学院植物保护研究所、中国农业科学院生物技术所、农业部科技发展中心、中国农业大学。 本标准主要起草人：彭于发、王锡锋、李宁、张大兵、罗云波、黄昆仑、汪其怀、贾士荣。 本标准为首次发布。 转基因植物及其产品检测通用要求 1范围 本标准规定了转基因植物及其产品检测的通用要求及转基因植物PCR检测实验室的操作规范。 本标准适用于转基因植物及其产品中转基因成分的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。 GB/T15481-2000 检测和检验实验室能力的通用要求 GB/T6682 分析实验用水规格和试验方法 NY/T673 转基因植物及其产品检测抽样 NY/T674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化 NY/T675 转基因植物及其产品检测大豆PCR方法

3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 一般术语 General terms 3.1.1 转基因生物 genetically modified organism (GMO) 通过基因工程技术改变基因组构成的生物。包括转基因植物、动物和微生物。 3.1.2 转基因植物 genetically modified plant organism (GMP), transgenic plant 通过基因工程技术改变基因组构成的植物，是转基因生物的一类。 3.1.3 定性检测极限 detection limit 以转基因生物（如种子）提取的DNA或标准双链DNA分子作为PCR反应的模板，所能检测到的脱氧核糖核酸（DNA）的极限（需要确保阳性样品的纯度，才能达到本标准检测方法的灵敏度）。 3.2 与DNA提取和纯化相关的术语 Terms relative to extraction and purificati on of DNA 3.2.1 DNA提取 DNA extraction 将DNA从一个样品的多种组分中分离出来。 3.2.2 DNA纯化 DNA purification 获得不含PCR反应抑制因子的DNA。 3.3 与DNA扩增和PCR技术相关的术语 Terms relative to DNA amplification and to the PCR technique 3.3.1 DNA扩增 DNA amplification 体外放大DNA分子拷贝数的生物学方法，如PCR。 3.3.2 扩增子 amplicon 由PCR等DNA扩增方法产生的DNA片段。 3.3.3 聚合酶链式反应（PCR）polymerase chain reaction， 模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与模板D NA两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP （deoxy ribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DN A，如此变性、退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。 3.3.4 引物 primer