PCR技术及习题

PCR技术及习题

PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶链式反应

1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA 聚合酶只能从3′端延伸DNA链。

2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；

③引物的延伸：72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。

3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

4、细胞被DNA复制与PCR技术的比较：

细胞内DNA复制体外DNA扩增（PCR）

不同点解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

引物RNA DNA、RNA

温度体内温和条件高温

相同点①需提供DNA模板

②四种脱氧核苷酸为原料

③子链延伸的方向都是从5'端到3'端

知识点拨：

1、DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种引物。

控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

2、PCR的含义是多聚酶链式反应。

3、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境（一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到~之间）；②DNA模板；③合成引物（2个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备

4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。

5、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。

知识拓展：

1、DNA聚合酶不能够从头合成DNA，只能从DNA的3'端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要引物。

2、引物: 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

3、PCR引物设计原则：

（1）PCR引物通常长15-25碱基，其中G＋C约占50%。

（2）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。

（3）引物的3’末端必须与目的片段完全相配。

（4）引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成

习题训练

1．聚合酶链式反应(PCR 技术)是在实验室中以少量样品DNA 制备大量DNA 的生化技术，反应系统中包括微量样品DNA 、DNA 聚合酶、引物、足量的4种脱氧核苷酸及ATP 等。反应中新合成的DNA 又可以作为下一轮反应的模板，故DNA 数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。

（1）某个DNA 样品有1000个脱氧核苷酸，已知它的一条单链上碱基A:G:T:C=1:2:3:4，则经过PCR 仪五次循环后，将产生 个DNA 分子，其中需要提供胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数量至少是 个。

（2）分别以不同生物的DNA 样品为模板合成的各个新DNA 之间存在差异，这些差异是 。

（3）请指出PCR 技术与转录过程的三个不同之处：

① 。 ② 。 ③ 。

2．通过DNA 重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技

循环重复

术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是一G↓GATCC一，请回答：

（1）从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是。

（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。

（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是

，“插入”时常用的工具是。

3．下面甲图中DNA决定某一多肽链中的酪氨酸和丙氨酸过程示意图，乙图示样品DNA经PCR技术(聚合酶链式反应)扩增，可以获取大量DNA克隆分子。分析回答：

（1）甲图中含有种核苷酸；丙氨酸的遗传密码子是。该图表示了DNA中遗传信息的过程。

（2）有一种贫血症是血红蛋白分子的一条多肽链上，一个酪氨酸被一个苯丙氨酸所替代造成的。此种贫血症的根本原因是，即发生了改变。

（3）乙图的“PCR”与人体内的DNA复制相比有何特殊之处。（4）现在要通过“PCR”得到甲图中DNA片段的1024个克隆片段，则至少要向试管中加入个腺嘌呤脱氧核苷酸。