血涂片的制备及染色
血涂片的制备及染色
摘要
血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。
关键词：血涂片制备，染色
前言
血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。
列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。
为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。
血涂片制备
载玻片
载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。
最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。
载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。载玻片可以是平面的或有磨砂或涂层面以供书写。与有直角边缘的载玻片相比，圆边或有破口的载玻片使用上更安全，降低了皮肤和手套割破或刺破的几率。
载玻片的清洗
脏的载玻片需浸透在60℃的清洁剂中清洗15-20分钟，然后用热水冲洗并干燥。新载玻片需置于重铬酸钾洗涤液中（20g Cr
2
K
2
O
7
溶于100mL水并加入900mL浓硫酸）48小时。之后用流动自来水彻底冲洗。载玻片应保存于95%甲醇中，使用前小心擦拭干净并干燥。
血涂片制备方法
典型的血涂片制备方法是：人工（楔入，盖玻片），半自动（楔入，旋转），以及自动（楔入）。
楔入法（“推”）
人工、半自动及自动化环境中常用此法。若正确使用楔入法，可有足够大的区域供显微镜检测使用：这种区域中所有的细胞彼此几乎不接触或分离（单层部分）。对于显微镜检查来说，涂片上距推动起始处最远的部分会很薄（导致产生形态改变），然而距推动起始处邻近的部分会很厚。
自动化装置能够制得优质的血涂片，比通过人工方法得到的血涂片相比更具一致性。楔入法制备的主要问题是不同类型细胞的不均匀分布。特别是单核细胞（以及其他大的白细胞）被推向铺展膜（“羽状”边缘）底部以及两侧。与以单克隆抗体为基础的流式细胞术分类计数仪相比，
上述情况将导致单核细胞数被低估5%-10%（正常个体经显微镜检测的比例计算常限上限为11%，非10%）。
盖玻片法（“拉”）
小型盖玻片不能被恰当地标记，应避免使用。此外与楔入法相比，本技术自身存在更高的生物危害风险。这种方法被认为是过时淘汰的，不应使用。
旋式血涂片
此法可谓是楔入法的替代方法。经离心力大面积摊开血细胞后，单层血细胞可供显微镜检测。虽然需注意避免污迹细胞的形成，但制备正确的旋式血涂片中所有类型的细胞形态通常是极好的。建议使用经生理盐水稀释后的血液，但出色的准备工作一般都离不开这一步。没有证据表明旋式血涂片制备会导致细胞类型的不均匀分布。
过去的旋转离心机在所有实验室仪器中最具危险性，因为可形成小滴和气溶胶以及机器内部的血液污染。最近研制出的旋转离心机已能克服上述问题并且可安全使用。
对于旋转离心机来说，为了获得一致的单层，采用精确正好的血量是至关重要的。因此，建议使用微量移液管滴涂血液，而不是毛细管。
血液样本的类型
血液样本的两种类型为静脉血（抗凝）和毛细血管血，毛细血管血是由毛细血管采血法（非抗凝）得到。已有些关于样品采集使用及操作设备的标准化文献发表，读者可以参考这些文本细节。
抗凝
可使用的抗凝剂是K
2EDTA或K
3
EDTA，
柠檬酸钠以及枸橼酸盐葡萄糖（ACD：储血稳定剂）。不建议使用肝素，因易发生血小板凝聚，进而干扰血小板形态解释和血小板计数的估测。肝素也会导致染色涂片上紫色/蓝色色调的变化。
样品保存影响
血样应在采集后尽可能快速地进行处理。随着保存时间的延长以及时间和温度的影响，样品会发生较大的形态改变。为了获得最佳实验结果，血涂片应在血样采集后两小时内就制备好。
保存温度如下：短期（＜8小时），4℃较好，但室温下保存也可；长期，4℃。通常在长期保存后需经至少10次完全（180°）倒置混合血样。
毛细管
推荐使用塑料（聚苯乙烯或类似物）管（不易破损）把血滴滴至于载玻片上。应避免使用玻璃管，因为有破损的可能，这会导致生物危害。毛细管应光滑平整，不含肝素。可以选择使用专门为制备血涂片设计的血液容器螺旋帽打孔装置。
血量
滴加的血量应使楔入法制得的血涂片拥有合适的厚度，长度在 cm。使用旋转离心机时，应使用微量移液管以确保单层细胞的均一性。对于典型的旋式涂片，30μL 血量能制得足够大的单层细胞，但是不同的血量需用不同的离心机。
血滴位置
血滴的位置应距载玻片末端大约1cm （与标记端相反）。或者选择距标签（或载玻片磨砂部分）1cm处。确定离心机中的位置时应按照制造商的说明。
涂布器
理想情况下，为了降低分配作用，涂布器应比载玻片略窄。实际上，经常使用另一载玻片充当涂布器。充当涂布器的载玻片应有圆滑边缘或坡口，这使得载玻片的展宽比实际的载玻片宽度窄。
涂布器使用后应丢弃或者在重新使用前彻底清洗并干燥。涂布器的边缘应总是平滑，以确保血涂片整宽的厚度均匀一致。
在涂布器边缘若有先前样本的血细胞将导致血细胞明显移行到相邻血涂片中，包括红细胞中的疟原虫以及白血病白细胞。
涂布器提取血样
当血滴置于载玻片时，涂布器应以相对血滴大约30°-45°角缓慢向后移动。血滴应沿着涂布器边缘快速铺展。一旦血滴沿着整个边缘铺展，涂布器就应成45°角并以稳定的相对较快的速率向前移动，直到全部血液铺展成膜。制备贫血患者的血涂片时，涂布器应保持更加垂直，一边制得较厚的涂片。
铺展/旋转速度
血液在载玻片上铺展愈快，涂片愈厚。为了获得一致和合格的结果，需要一定的训练和经验。众所周知的是，某些样本很难由楔入法制备血涂片，例如新生儿的血样。对于旋式载玻片，离心速度和次数可从制造商处获知。
血涂片厚度
血滴的大小，病人的血红蛋白水平，涂布器的角度（角度愈大，血涂片愈厚愈短）以及铺展速度会影响血涂片的厚度。
血涂片的干燥
一般无强制空气循环下就足以晾干。在潮湿环境中，建议在采取适当的预防措施下进行强迫通风干燥，以防止气溶胶的形成。当采用强制干燥时，建议在配有高效微粒空气（HEPA）过滤器的生物危害罩中进行。
制造伪像
常见的伪像通常是由欠佳的涂布技术，潮湿环境中的缓慢干燥，固定不充分或迟缓以及固定液含水造成的。不干燥的载玻片造成血涂片铺展欠佳或不规则，通常伴有较差的形态。
某些细胞类型会在涂片制备时被轻易破环。特定条件包括大量的非典型淋巴球，慢性淋巴细胞白血病（CLL），以及急性白血病。有时这些破裂的细胞（“污迹”细胞）可通过在血涂片制备前添加白蛋白来避免。
缓慢干燥导致细胞收缩，然而当甲醇固定液中水含量超过3%时就会造成明显的形态伪影，例如细胞形态的脆性降低（尤其是红细胞和细胞核）以及假液泡的形成。
退行性病变，例如单核细胞、中性粒（白）细胞的细胞质液泡化，核分叶或者有核细胞分裂以及凋亡通与其说是制备造成的，而不如说是由样品长期保存或保存不当造成的。
可能的干扰
影响血涂片制备和质量的病情有：贫血、红血球增多症,脐带血，血小板凝集，冷凝集素，严重的溶血性贫血中的抗红细胞抗体，严重的红细胞叠连以及新生儿的血样。
用于疟疾检测的血涂片制备
公认的是通过血涂片中（厚或薄）的疟原虫形态识别不是检测疟疾最灵敏的方法。分子生物学方法更具灵敏性，但也很昂贵。因此，在今后有一段时间，疟疾的形态识别法会在很多实验室中存在并成为发现和监测疟疾的主要方法。
薄或厚血涂片都可用于疟原虫的形态检测。用厚涂片识别疟疾比薄涂片灵敏10倍左右，但厚涂片中疟原虫类型的实际识别很难进行。
对于厚血涂片的制备，小血滴置于玻璃载玻片上，铺展至比起始表面大约四面积倍。充分干燥后，最好在50℃-60℃下操作，时间控制在7-10分钟，载玻片可以染色。若干燥不充分，细胞会被洗掉。
两种染色程序：常规血涂片在30秒内快速染色，姬姆萨染色用于厚滴制备，大约需30分钟。有一种厚滴制备的替代方法，即经皂素的血细胞溶菌作用后离心分离除去杂质。
网织红细胞制备
抗凝血必须首先在体外活体染料中温育，网织红细胞中的RNA（主要是核糖体）被染色，这将导致RNA聚集成形态上典型的深蓝色网状（网状组织）和粒斑。
染色液和血液在试管中等分混合，室温下温育15分钟。10次完全倒置再混合后，在显微镜分析之前，至少制备出2张风干的血涂片。
固定/染色
为了获得最理想的结果，应在血涂片完全风干后迅速固定并染色。建议在染色前对血涂片进行固定，但许多实验室有在血涂片完全风干后就立即染色的习惯。这一过程经常产生不合格的结果。然而如果载玻片不能立即染色，那么在甲醇中固定4小时就变得很重要了，但是这一过程最好在风干1小时后；否则的话，血浆会产生灰/蓝背景影响。染色剂和固定液必须尽可能无水（＜3%），以防形态伪像。
若进行人工染色操作，建议将载玻片沉浸于装有试剂（科普林氏缸）的广口瓶中而不是用染色剂覆盖载玻片，因为蒸发后可能会形成沉淀。若在极热环境下进行
染色，必须防止染色过程中的蒸发，例如在一密闭广口瓶或密闭有盖培养皿中进行染色。
自动化染色装置拥有其自己特定的染色程序，此程序由制造商提供。使用者可以修改这些程序来满足细胞染色的要求。
不同实验室间的染色方案不同，不存在被普遍接受的常规染色方法或结果。染色和染色结果的指导方针能在血液学和实验室指南和教科书中找到。国际血液学标准化委员会（ICSH）已经发布了一种基于纯天青B和曙红Y染色剂的血涂片“参考”染色方法。
判断染色血涂片质量的一种通则是实验室必须确保血涂片中所有细胞类型可通过染色过程被可靠识别。此规则同样适用于人工和自动化的方法。
血涂片通常由罗氏染料（含有各种噻嗪类和曙红）染色。其他若干方法如下：瑞氏染色，瑞氏-姬姆萨染色，May-Grünwald-Giemsa染色和利什曼染色。下面将对一些普遍采用的风干血涂片染色方法进行举例。
瑞氏染色
试剂
（1）无水甲醇（2）染色剂（可从商业渠道购买现成品或粉末）。通常将瑞氏染料粉末溶于100mL无水甲醇中，室温下保存于密闭容器中24小时。使用前必须过滤。
（3）索氏缓冲溶液，pH ；无水KH
2PO
4
，
无水Na
2HPO
4
，蒸馏水稀释至1000mL。
方法
步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒
步骤 2.倾斜载玻片除去甲醇
步骤3.载玻片水平放置，涂染色剂，保持2分钟
步骤4.加等份不含任何染色剂的缓冲溶液于载玻片上。将缓冲溶液和染色剂
轻轻混合，同时应避免接触载玻片
上血涂片的表面（染色剂混合物表
面将呈现金属光泽）
步骤 5.静置3分钟
步骤 6.用（蒸馏）水冲洗载玻片30秒
步骤7.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干步骤 8.若需要可添加盖玻片
May-Grünwald-Giemsa染色
试剂
（1）无水甲醇（2）染色剂I：May-Grünwald-Giemsa染色粉末溶于100ml 无水甲醇室温下保存于密闭容器中24小时。使用前必须过滤。染色剂II（姬姆萨染色剂）1g姬姆萨染料粉末溶于66mL甘油并在56℃下加热90-120分钟。添加66mL无水甲醇后充分混合，溶液应在室温下保存于密闭容器中。使用前必须过滤。（3）缓冲溶液：索氏缓冲溶液。May-Grünwald-Giemsa染色染色剂的pH必须为，而瑞氏染色剂的pH为。
方法
步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒
步骤2.倾斜载玻片除去甲醇或者简单地从固定广口瓶中移出
步骤 3.用等份缓冲溶液稀释染色剂I，涂于水平放置的载玻片上或在一广口
瓶中，保持5分钟。
步骤4.从广口瓶中移出载玻片，不要清洗（或者经垂直放置载玻片除去染色
剂）至染色剂II中10-15分钟，此
染色剂II应用9份缓冲溶液刚稀释
过。
步骤5.载玻片除去染色剂后移至装有缓冲溶液的广口瓶中
步骤 6.用大量水冲洗载玻片
步骤 7.将载玻片移至含水广口瓶中2-5分钟
步骤8.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干步骤 9.若需要可添加盖玻片
评论
此方法中重要的一点是载玻片不允许在两步骤之间干燥或蒸发，以防形成染色伪像和沉淀。
疟疾染色法
常规血涂片，快速方法
试剂
染色剂I：将曙红Y溶于500mL含Na
2
HPO
4
·12H
2
O和 g KH
2
PO
4
的蒸馏水中。室温下与密闭容器中静置24小时。染色剂I 也可经亚甲蓝和亚甲基天蓝（天蓝I—亚甲蓝的氧化衍生物）溶于500mL含
Na
2
HPO
4
?12H
2
O和 g KH
2
PO
4
的蒸馏水中制得。
确保步骤间无蒸发。染色剂II：将亚甲蓝
溶于500mL含 Na
2HPO
4
?12H
2
O蒸馏水中，煮
沸至干粉状以备进行多色染色。粉末应在
500mL蒸馏水中重悬浮并添加 KH
2PO
4
。两种
染色剂都必须在使用前过滤并保存于密闭容器中以防氧化。
方法
步骤 1.无水甲醇中固定至少30秒
步骤2.在血涂片上滴加稀释过的染色剂I 12滴（一份染色剂用四份蒸馏水稀
释）
步骤3.立即滴加未稀释的染色剂II 12滴并与已滴加在载玻片上的已稀释的
染色剂I混合
步骤 4.静置1分钟
步骤5.沥干载玻片，放置于索氏磷酸盐缓冲液中，pH ，保持5秒（为了充分
染色）
步骤 6.用水冲洗
步骤7.倾斜放置载玻片并干燥，不要吸干室外染色
干燥的或者其他未固定的薄涂片和厚血滴制剂可浸于染色剂I中1-2秒，然后用pH 的索氏缓冲液冲洗，直至无染色剂从血涂片中释放。接下来将涂片浸于染色剂II中1秒并立即用相同的缓冲液冲洗。剩余的水经震动，非吸干除去后将载玻片垂直放置干燥。
厚滴法（姬姆萨）
试剂
姬姆萨染色剂可直接购买获得或由实验室制备（见“May-Grünwald-Giemsa染色”下“方法”）
方法
步骤1.将干燥的载玻片完全沉浸于广口瓶或将载玻片保持水平，用稀释过的
姬姆萨染色剂染色（用pH 的索氏磷
酸盐缓冲溶液以1:10的比例稀释），
保持20-30分钟。
步骤2.用相同的缓冲溶液洗涤载玻片（轻轻地，否则血涂片将从载玻
片上漂浮）
步骤 3.将载玻片倾斜或垂直放置干燥；不要擦干
评论
因这一技术的目的之一是溶解红细胞，使疟原虫透过几层细胞后可见，厚滴制备得到的大多数血细胞的形态欠佳。在稀释过的染色剂中浸泡过长时间会使制剂易于从载玻片上漂浮走。
网织红细胞染色
新亚甲蓝（1g）溶于100mL稀释液中（柠檬酸盐：20mL 30g/L柠檬酸钠加80mL 9g/L氯化钠）。染料溶解后，在使用前必须过滤染色剂。
关于染色和染料的总评
染料和固定剂必须在室温下保存于密封容器中；冻结温度下会破坏罗氏染液。血涂片染色试剂应有标签来记录容器开启的时间；截止日期应标注于瓶身。
虽然原材料易得以及所有的染色剂可由实验室配制，但是值得注意的是这是一个费力的过程。总之，使用现成的染色剂可以获得更一致的染色结果。
染色血涂片的评价
宏观上看，正确制备和染色血涂片应在其薄的部分呈粉色，厚的部分呈紫/蓝色。通过显微镜观察，红细胞应呈粉色，白细胞核应呈蓝偏紫色。涂片应不含或含极少沉淀，整个载玻片应染色均匀。血细胞应无液泡（见“固定/染色”）。
染色伪像及潜在的染色问题
过度粉色染色可能是由于使用了较低pH的缓冲溶液，染色不充分或者过度洗涤/冲洗造成的。染色剂若超过四周，尤其是被暴露于空气时也会导致粉色，因为甲醇中会有甲酸的形成。应对措施：检查缓冲溶液pH，使用新制染色剂，其中的甲醇应未暴露于空气过，并且确保染色试剂正确，有时可能需要改变试剂批次。如果使用商品染色剂，缓冲溶液pH和染色时间需正确，尝试其他批次可能是必要的。在寒冷环境中，确保染色剂在运输中不会凝固。
过度蓝色可能是由于使用碱性pH的缓冲溶液，染色时间过长，或者洗涤不充分造成的。厚血涂片也会导致细胞出现更蓝的现象。应对措施：检查缓冲溶液pH，使用更多稀释剂，以及/或者缩短染色时间。
不充分染色的核通常是由于染色不充分造成的，然而老化样本（采集血样超过8
小时）中的有核细胞，尤其是在室温下保存时，可能表现出与凋亡（核破裂）一致的核变化。
沉淀的形成可能是由于甲醇从染色剂中蒸发或因为不正确的洗涤过程，特别是在洗涤的初级阶段没有保持载玻片完全平整造成的。自制染色剂在使用前未充分过滤，使用不洁净的载玻片以及在血涂片或载玻片上落有灰尘也同样会造成沉淀。
盖玻片
一般而言，没有必要使用盖玻片，然而如果血涂片需经数人审评或长时间保存，盖玻片就可以提供保护以防力学损伤（反复擦拭）和染色剂由于暴露于空气发生变质。加盖玻片的潜在优点是用盖玻片覆盖患者血液的整个区域（染色和未染色）可以降低处理血涂片时的生物危险。
盖玻片应由高纯无色玻璃（“水白，无色透明”）制成，必须抗水化，尤其是当处于高湿度的环境中时。盖玻片应有均匀的表面质量，无任何不规则，完全平整。典型的盖玻片为25×25 mm，厚度为（其他范围的尺寸可从经销商和制造商处获得）。特厚盖玻片（ mm）降低了破碎的几率，但是显微镜使用会受限。
盖玻片对洁净度，水化以及保存的要求与玻璃载玻片相同。为了防止灰尘聚集和水化，盖玻片在不使用时应保存于密闭容器中。自动盖玻片仪可供大型实验室使用。
封片材料
为了永久装配盖玻片，溶于无机溶剂的合成树脂（甲苯和二甲苯）已经大部分替代了加拿大香脂（加拿大松脂或冷杉香脂），因其黄化和不易完全干燥不太令人满意。
封片材料应具有低粘性以确保粘合剂层较薄并防止气泡的形成。它不能因衍射问题或生物染色剂的颜色改变影响光学分析。封片介质中的抗氧化剂能防止染色剂和介质材料自身变色。封片材料不应随着时间的推移而失去粘性。
不建议在不使用盖玻片的情况下就用封片材料充当血涂片的覆盖物，因为这些制剂易聚集灰尘，当经长时间保存和多次观察后，不像玻璃有防刮和防指纹的能力。
标记
血涂片应标记清楚，标签应不易模糊以及不易受用无机溶剂进行固定，染色和清洗的影响。标签内容至少包括患者姓名，时间以及样本采集时间，样本编号。可靠的标签也建议包括患者特定识别号。制备血涂片时建议使用印刷标签来标记（若使用压印型染色剂，在涂片背面标记可以避免标签污染）。
应检查印刷标签随时间褪色的可能性以及浸入油和实验室中常用溶剂时的敏感性。手工标记血涂片可使用铅笔、蜡笔（对乙醇或其他溶剂不敏感）、记号笔或钻石划针。
生物危害
处理所有患者的样本包括血涂片时应采取一般的预防措施，无论是风干、固定或染色。
样本处理和血涂片制备
血涂片的制备不是特别危险，但在打开血容器时必须小心，特别是用橡胶塞而不是螺旋盖封闭时。打开橡胶塞经常会导致小滴或微滴的形成，因此必须用擦布或类似物覆盖橡胶塞，最好在生物危害罩中进行并且远离操作者脸部。
如果处理得当，使用带螺旋盖的试管时就不会形成可测量的微滴和气溶胶。血样也可从样本试管中通过使用血容器塞子穿孔装置安全地获得，这种装置专门为血涂片制备设计。
已染色血涂片
像罗氏染液这样的嵌入式染料是致癌的，应小心处理，避免皮肤或粘膜接触。经常假定用罗氏染液染色的血细胞不具备传染性，一般来说经完全染色的血涂片不认为有生物危害性。然而甲醇固定液不能抗艾滋病或乙型肝炎，也不太可能为某些其他类型的传染病提供保护，例如朊病毒造成的传染病。
部分染色的血涂片
通常情况下，载玻片上的血涂片只有一部分被染色，因此未染色部分具有直接的生物危害性。
盖玻片封装介质
封装盖玻片时所使用到的某些材料和溶剂存在潜在致癌性，应根据制造商说明小心处理。
试剂安全性
本文提到的罗氏染液，甲醇，乙醇，丙酮，二甲苯，甲苯和盖玻片胶水具有高度的易燃性，应保存于为易燃材料所设计的安全橱中。当处理这些试剂时，应考虑它们的挥发性和潜在的致癌性。
长时间保存
如果血涂片要长时间保存，应避免光照。尽管长时间保存时建议使用盖玻片，但如果未用盖玻片的已染色载玻片密封保存于密闭容器或安全橱暗处，干燥环境中时，涂片也不太可能发生变质。
染色剂和溶剂的处理
罗氏染液和挥发性溶剂应按照当地废物处理部门的相关规章制度进行处理。
载玻片处理
使用过的载玻片应放置于有特别标记的指定容器中，这种容器用于收集有生物危害性和锐利的物品。
显微镜检查和载玻片处理
基于“生物危害”中已提到的相关原因，当处理血涂片和进行显微镜分析时建议使用手套。与带有圆滑边缘或破口的载玻片相比，带有直角边缘的载玻片更易割或刺破皮肤或手套材质。破粹的载玻片应极其小心处理，这样的载玻片应被丢弃，除非血涂片无可取代。
血涂片的使用
血涂片可以以多种方式使用。大部分用于常规临床定量和/或者定性分析形成的血液元素。用于形态筛选可能比纯定量目的更强，因为白细胞差异电子分析技术已有很大提高。血涂片也用于质量控制/质量保证以及评估以自动化设备为基础的方法。
人工分类计数作为参照方法的作用
以血涂片为基础的白细胞分类计数参考方法的作用，请参考美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件H20-A。
注意事项
需注意的一点是楔入法制得的血涂片中细胞分布情况；像单核细胞这样的大细胞可能会被推向血涂片的边缘以及羽化区。一般的形态学问题
某些类型的血细胞（单核细胞，有核红细胞，杆状细胞等）不好识别，导致低估和/或者误分类。像血液始祖细胞或淋巴细胞亚群这样的细胞类型很难或者不太可能通过单独的形态学方法进行分类。
小概率事件
反常的细胞类型特别易于造成低估。细胞计数的数量相对较少，甚至当总数为400的白细胞分类时，会导致准确性和再现性上的显着问题，这主要是因为Poisson 误差分布。这一情况在细胞数量小的细胞类型中很明显，例如嗜碱粒细胞。
基于这些考虑以及特别是因为细胞分类问题，其他替代性的方法，例如基于单克隆抗体的流失细胞术已经成为更普及的参考方法，尤其是对小概率事件的分析。
合格血涂片及其质量控制过程的最低要求注意要对血涂片正确染色并详细标记。用于形态评估的区域应足够大，在样本中至少有100个白细胞能被识别，其白细胞总数应在具体个体的参考范围内。一个高质量的血涂片应有一足够大区域来进行形态评估。
楔入法制备的血涂片中，红细胞几乎不相互接触的区域是显微镜检测的最佳区域。旋式涂片通常有大面积的单层区。
细胞不应在制备或染色过程中或者因剪切力被破坏。尤其是在制备旋式涂片时，必须小心以确保制备过程中单层内无任何类型的细胞被破坏。然而，像慢性淋巴细胞性白血病这样的某些疾病来说，感染的细胞或者淋巴细胞就很难防止细胞被破坏。
对于重复的显微镜分析，应使用盖玻片，对于今后的分析来说，浸没油的除去不会破坏血涂片。
显微镜的使用
血涂片的正确显微镜分析方法已在别处叙述过并且不再本文的范围内。
质量控制
血涂片是实验室的产品，因此就合格产品的最低要求而言，其应能经受住一致性和质量的检查。实验室管理人员有责任进行相关的检查过程。完全人工环境下，
应提供给实验员足够的训练和矫正训练（必要时）以确保制备血涂片有足够和一致的质量。自动化和半自动化环境下，实验员应受正确使用仪器的相关训练以及对仪器维护保持记录。
能力验证
（建议）实验室可以参加（外部）能力验证项目，这样的项目大多是检测实验室正确染色血涂片的能力和评估实验员形态学检测的能力。外部能力验证项目中，尤其是当向个别研究机构寄送血样时，物流以及血样老化经常妨碍血涂片制备。
致谢
作者对许多有帮助的建议和评论表示感谢，尤其是来自于英国伦敦皇家研究医学院的Mitchell Lewis博士；佛罗里达州迈阿密贝克曼库尔特集团的Robert Raynor博士以及他的同事；澳大利亚墨尔本Auscorp营销顾问Terry Fawcett先生。使用若干教科书作为一般参考。
血涂片及骨髓涂片的制片与读片
血涂片及骨髓涂片的制作与读片 潘志强 2006-3-30 实验准备 一．器材： 载玻片：每只动物一块 盖玻片：每只动物一块 滴管：4个 橡皮吸头：4个 中号镊子：4把 大剪刀：4把 眼科镊：4把 玻璃棒：4根 烧杯：1000 ml，2个 量筒：100ml、500 ml、1000 ml各一 蜡笔 棕色小口瓶 碾钵 载玻片处理：一般将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分钟，用流水冲洗，再经清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入95%酒精浸泡约1小时。取出，以洁净布巾夹持玻片边缘擦干备用。 二．试剂： 瑞氏染液240ml 瑞氏染料粉剂0.1g 纯甲醇（AR）60ml 将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周后才能使用。染料存放越久，染色效果越好。 磷酸盐缓冲液 1%KH2PO4 30ml 1%Na2HPO4 20ml ，定容至1000ml。 甲醇 鸡蛋清：蒸馏水与鸡蛋清按1/1的比例稀释。 中性树胶：如果中性树胶过于粘稠，可将中性树胶与二甲苯按7/3的比例稀释。 二甲苯
实验步骤 一．涂片 （一）血液涂片的制作 （1）需载玻片2张，分别称为玻片1和玻片2（推片）。 （2）用玻片1一端接约3mm直径的血滴，将此玻片1保持水平。 （3）取另一边缘平整的载玻片2（推片），将其前端放在血滴前，与片1保持30°角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2（推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。 （4）立刻将推片与载玻片呈30°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。 （5）挥动片1使血膜吹干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。 （6）每只动物涂片一张。 （7）一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。 （8）置30min～1hr后较利于观察红细胞的形态。 注意事项： ●如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。 ●载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不 是30°而是35°～40°左右），以较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。 ●如用力过猛白细胞容易破损。 （二）骨髓涂片的制作 用手术剪刀剪掉大腿部的肌肉，充分暴露股骨，再用大剪刀从上端剪断第2股骨，用中号 镊子夹股骨以挤出骨髓，如果骨髓不易取出，可用直头眼科镊插入骨髓腔挑出骨髓，置骨髓于 一载玻片上，由于骨髓液的纤维蛋白原含量较高，易于凝固，可先在骨髓液内加5~10倍的稀 释后鸡蛋清，充分混匀，取1滴至另一载玻片上，涂片。涂片方法同血液涂片，但推片要快并 迅速使之干燥。每只动物涂片一张。 二．染色 （一）血液涂片的染色 （1）将待染涂片平放于染色架上。 （2）用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置1～3分钟。 （3）加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色5～10分钟（白细胞数多或骨 髓标本时间应长一些，如20～30min）。 （4）染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。 （5）再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。 （6）甩干或晾干玻片。 （7）封片。 （二）骨髓涂片的染色 同血液涂片。
实验四 血涂片的制备与染色
实验四血涂片的制备与染色 【目的】掌握血涂片的制备和染色方法（preparation and staining of thin blood films）。 【原理】将一小滴血液均匀涂在玻片上，呈单层紧密分布，制成薄血片。用含天青B和伊红的Romannowsky类染料进行染色。细胞中的碱性物质如RBC中的血红蛋白及嗜酸性粒细胞胞质中的嗜酸性颗粒等与酸性染料伊红结合染成红色；细胞中的酸性物质如淋巴细胞胞质及嗜碱性粒细胞质中的嗜碱性颗粒等与碱性染料亚甲蓝结合染成蓝色；中性粒细胞的中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染成淡紫红色。 【器材】 1．载玻片使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。 2．推片选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm 宽度的推片。 3．吸耳球。 4．显微镜。 5．酒精灯或Bunsen灯。 6．采血针。 7．注射器和针头。 【试剂】 1．瑞氏（Wright）染液 （1）Ⅰ液：包含瑞氏染料1.0g、纯甲醇（AR级以上)600ml、甘油15ml。将全部染料放入清洁干燥的乳钵中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒入洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。再加15ml甘油密闭保存。 （2）Ⅱ液：磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8），包含磷酸二氢钾（KH2PO4）0.3g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）0.2g、蒸馏水加至1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口贮存。如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。 2．吉姆萨染液包含吉姆萨染料0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。将吉姆萨染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器内，每天混匀3次，连续4天，最后过滤备用。 3．瑞-吉复合染液 （1）I液：包含瑞氏染料1g、吉姆萨染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。将瑞氏染料和吉姆萨染料置洁净研钵中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此连续几次，共用甲醇500ml。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、晚各摇3min，共5d，以后存放1周即能使用。 （2）Ⅱ液：即磷酸盐缓冲液（pH6.4～6.8）。包含无水磷酸二氢钾6.64g、无水磷酸氢二钠2.56g，加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。 【标本】 EDTA抗凝静脉血或末梢血。 【操作】 1．采血 （1）静脉采血法：用EDTA·K2抗凝1～2h内的标本，使用玻棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴抗凝血，直径约4mm。 （2）皮肤采血法：选择第三、四手指，并先采红细胞、白细胞计数，再采血1滴置洁净玻片上用于血涂片制备。
血涂片制作
血涂片制作 将血标本均匀地涂抹在清洁干燥的载玻片上，经染色后在显微镜下检查，这是血细胞形态学检查的基本方法，临床应用很广，特别是对各种血液病的形态学诊断很有价值。但是，如果血徐片制备不良，染色不佳，常使血细胞的形态学鉴别和诊断发生困难，甚至导致错误的结论。如血膜过厚，细胞重叠缩小；血膜太薄，白细胞多集中于边缘。因此，制备厚薄适宜、分布均匀的血涂片是血液学检验的基本技术之一。 一、载玻片的清洁 新载玻片上常有游离碱质，必须用约lmol／L HCI浸泡24h 后，再用清水彻底冲洗，干燥备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或合成洗涤剂的清水中煮沸20min，再用热水将肥皂和血膜洗净，用清水反复冲洗，干燥备用。如急用载玻片，可将其置0、9乙醇中浸泡lh，用蒸馏水洗净后，擦干或烘干备用。使用载玻片时，只能手持玻片边缘，切勿用手触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 二、制作血涂片的标本 血涂片既可由非抗凝的静脉血和毛细血管血制备，也可由
EDTA抗凝血制备。EDTA抗凝血中，钙离子被螫合后，能阻止血小板聚集，推片时血小板均匀平铺，显微镜下易于对血小板进行观察评价。但有时可观察到因EDTA引起的红细胞皱缩及白细胞丛集现象。但随着血液分析仪的逐步普及，血标本多为EDTA抗凝血，除作全血细细胞计数及多参数分析外，制备血涂片也非常方便，虽有上述弊端，但显微镜下易于发现。 三、血涂片的制备 血涂片的制备方法很多，如手工推片法、自动推片法、载（盖）玻片压拉法、旋转涂片法、棕黄层（buffy－coat）涂片法及厚血膜涂片法等，现介绍如下。 1、手工推片法取血标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持25～30o的平面夹角，平稳地将血向前推动，血液即在载玻片上形成一薄层血膜。将制成的血膜在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。 一张良好的涂片，要求厚薄适宜，头体尾分明，边缘整齐，两侧应留有空隙。玻片的一端应留有贴标签的地方。涂片的好坏与血滴大小、推片与载片之间角度、推片时的速度有关。血滴大、角度大、速度快，则血膜厚；反之则血膜薄。血膜分布不匀，主要是推片边缘不齐、用力不匀或载玻片不清洁
实验一 血涂片的制备
实验二、血涂片的制备和血细胞的观察 目的要求 1.掌握血涂片的的制备方法 2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态 基本原理 涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。 实验用品 1.器材：医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片； 2.试剂：Wright’s染液：Wright’s色素粉末0.1g，溶于60 ml甲醇。 方法与步骤 1．采血采血前用70％酒精棉球消毒人的指腹或耳垂，干后用采血针刺破指腹或耳垂的皮肤；动物采血时先将耳部剪毛，酒精消毒后，刺破动物耳部皮肤，挤去第一滴血不要（因含单核白细胞较多）。 2．涂片挤出第二滴血置于载玻片的一端，再取另一张边缘光滑的载玻片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状，两玻片的角度以45°为宜（角度过大血膜较厚，角度小则血膜薄），轻轻将载玻片向前推进，即涂成血液薄膜（图2-2）。推进时速度要一致，否则血膜成波浪形，厚薄不匀，初学者可把玻片放在桌上操作。 3．染色待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wright’s染液盖满血膜为止，染色1～3 min。然后滴加等量的缓冲液（pH6.4）或蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置2～5 min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干。 4．镜检显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核，淡红色，缘部分染色较深，中心较浅，直径7-8微米。白细胞数目少，为圆形。 颗粒白细胞（1）嗜中性颗粒白细胞：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1-5叶，直径10-12微米；（2）嗜酸性颗粒白细胞：略大于嗜中性白细胞，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色，直径10-15微米；（3）嗜碱性颗粒白细胞：体积略小于嗜酸性白细胞，细胞质中有大小不等被染成紫色的颗粒，颗粒数目较嗜酸性白细胞的颗粒少，核1-2叶，染成淡蓝色，直径10-11微米。 无颗粒白细胞（1）淋巴细胞：可观察到中、小型两种。小淋巴细胞与红细胞大小相似，圆形，核致密，染成深紫色。周围仅一薄层嗜碱性染成淡蓝的细胞质。中淋巴细胞较大，核圆形。直径6-8微米。（2）单核细胞：体积最大，细胞圆形。胞质染成灰蓝色。核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。直径14-20微米。 血小板为不规则小体，直径2 - 3微米。其周围部分浅蓝色，中央有细小的紫红色颗粒，聚集成群。 实验报告内容 绘制人血涂片镜下图
实验 血涂片的制作与血细胞的观察
实验血涂片的制作与血细胞的观察 一、引言 血涂片显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对各种血液病的诊断有很大价值，但血涂片制备和染色不良，常使细胞鉴别发生困难，甚至导致错误结论，因此，制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要基本技术之一。 二、实验目的 掌握血涂片的制作，观察血细胞的形态及在不同环境下的反应。 三、实验器材与试剂 器材：显微镜、医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片、盖玻片等。 试剂：瑞氏染液、0.9%Nacl溶液、蒸馏水等。 四、实验步骤 1、消毒与采血 先按摩采血部位（人的指腹），使血流通畅，采血前用70%酒精消毒人的指腹，干燥后用采血针刺破指腹，使血液自然流出（第一滴血不要）。取干净载玻片，让血滴在离玻片一端中4-5mm处，注意手指持载玻片的边缘，不触电及表面，也不能使载玻片接触取血部位的皮肤。 2、推片 取一块边缘光滑的载玻片做推片。将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载玻片呈30-40o角，向另一端平稳地推出（图1）。涂片推好后，迅速在空气中摇，使之自然干燥。 图1 推片示意图 3、染色 用特种玻璃铅笔在血膜两侧画两条线，防止染液外溢。再将瑞氏染色液（伊红-亚甲基蓝）滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染30秒。加等量蒸馏水与染色液混合后再染5分钟。最后用蒸馏水把染色液洗掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。 4、封片 经染色的涂片完全干燥后，用中性树胶封片保存。 五、结果观察 显微镜下观察血涂片结果如图2所示。血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。
1、红细胞： 小而圆，没有细胞核，血涂片中最多，常被染成淡红色，细胞的边缘厚，中间薄，使细胞边缘的颜色比中间的深。 2、白细胞： 分为有粒白细胞和无粒白细胞，有粒白细胞包括嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞和嗜中性白细胞；无粒白细胞包括淋巴细胞和单核细胞。 （1）嗜酸性白细胞： 数量较少，但在血涂片中可以找到。细胞质中存在粗大的嗜酸性颗粒，胞质常被染成红色或玫瑰花色，细胞核分叶形，染成紫红色。 （2）嗜碱性白细胞： 数量最少，在血涂片中很难找到。细胞质中存在粗大的嗜碱性颗粒，胞质常被染成兰紫色，细胞核分叶形，染色较深，但常被粗大的兰紫色颗粒掩盖。 （3）嗜中性白细胞： 在有粒白细胞中，它的数量最多，很容易找到。细胞质染成淡红色，胞质内含有细小的颗粒，一般不易看清，细胞核为兰紫色，核分杆状、蹄形和分叶形。 （4）淋巴细胞： 在白细胞中数目是最多的，大小不等，可分为大淋巴细胞、中淋巴细胞、小淋巴细胞。大淋巴细胞较少，占中小淋巴细胞的1/4～1/18。细胞质所占的比例较小，但随细胞体积增大而相应增多，核周围细胞质，染成天兰色，细胞核大，圆形，染成紫兰色。 （5）单核细胞： 数目不多，是血细胞中最大的细胞。核为肾形或马蹄形，颜色比淋巴细胞较淡，细胞质为淡灰兰色。 3、血小板： 为不规则的细胞质小块或碎片，形状象雪花，在血小板中有细小的紫兰色颗粒。血小板常聚集在红细胞之间（注意：在观察过程中注意染料、渣子和细胞及血小板等的区别）。 图2 血涂片中血细胞观察结果 五、注意事项： 1、载玻片的清洗：新玻片有游离碱质，因此应用10%盐酸浸泡24小时，然后再清水和蒸 馏水清洗。2、使用玻璃片时只能手持边缘，切忌触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥，无油腻。3、血涂片制好后，立即固定染色，以免细胞溶解和发生退行性变。3、血
血涂片的制备及染色
血涂片的制备及染色 摘要 血涂片是世界上使用最广泛的实验室检测方法之一，应用于疾病的筛查，发现，诊断以及监控。本文提供了在临床检验中制备及染色出优质血涂片的一种参考。虽然在如何人工制备血涂片上仍存在某些“工艺”，但是已尽可能采用了客观标准使得临床实验室能准备和染色出优质血片。本参考中包含固定和染色手工工艺中的问题解决方法。 关键词：血涂片制备，染色 前言 血涂片是世界上使用最广泛和最频繁的检测方法之一，但似乎没有关于血涂片制备要求，程序及潜在问题等的综合性文献。虽然血涂片的制备是个简单的过程，但作为一种检测方法，有很多因素可导致检测失败或比其预期低效。本文应国际血液学标准化委员会的请求所写，并作为实验室血细胞计数板的指导方针。本文旨在提供临床检验中用于形态评价的血涂片制备及其染色的指导和标准化。显微镜分析过程和解释不在本文的范围内。 列举的方法中包括最先进的技术以及发展中国家实验室的适用方法。发展中国家不具备最高水平的指标，但应在所有条件下可达到其规定的指标，以确保诊断测试的质量，以免降低病人护理。这点尤其重要，因为无论对于病例发现，诊断或疾病监测，血涂片显微镜分析所得数据通常在临床情况中起最终和决定性的作用。 为了方便参考使用，本文采用一种特殊的格式来描述涉及血涂片制备和染色的各个步骤。 血涂片制备 载玻片 载玻片应由最高纯度的耐腐蚀玻璃制成；通常不可接受其他材料如塑料。典型玻片为75×25mm，约有1mm厚度，必须平整，无扭曲和波痕，而且必须澄清无色（“水白，无色透明”）。荧光显微镜检测必须使用无自发荧光的玻片。 最好使用预洗过的载玻片，但至少实验室必须确保载玻片无划痕，干净无尘、绒线，油脂（指纹），而且必须干燥。这就意味着在潮湿环境中，载玻片必须能抗水。在所处密闭容器开启后，载玻片必须保存于干燥器或装有无水（甲基）乙醇或乙醇与丙酮混合液（3:1）的容器内直至被使用。 载玻片需一直保存于密闭容器中，只能在立即使用前开启。载玻片可以是平面的或有磨砂或涂层面以供书写。与有直角边缘的载玻片相比，圆边或有破口的载玻片使用上更安全，降低了皮肤和手套割破或刺破的几率。 载玻片的清洗 脏的载玻片需浸透在60℃的清洁剂中清洗15-20分钟，然后用热水冲洗并干燥。新载玻片需置于重铬酸钾洗涤液中（20g Cr 2 K 2 O 7 溶于100mL水并加入900mL浓硫酸）48小时。之后用流动自来水彻底冲洗。载玻片应保存于95%甲醇中，使用前小心擦拭干净并干燥。 血涂片制备方法 典型的血涂片制备方法是：人工（楔入，盖玻片），半自动（楔入，旋转），以及自动（楔入）。 楔入法（“推”） 人工、半自动及自动化环境中常用此法。若正确使用楔入法，可有足够大的区域供显微镜检测使用：这种区域中所有的细胞彼此几乎不接触或分离（单层部分）。对于显微镜检查来说，涂片上距推动起始处最远的部分会很薄（导致产生形态改变），然而距推动起始处邻近的部分会很厚。 自动化装置能够制得优质的血涂片，比通过人工方法得到的血涂片相比更具一致性。楔入法制备的主要问题是不同类型细胞的不均匀分布。特别是单核细胞（以及其他大的白细胞）被推向铺展膜（“羽状”边缘）底部以及两侧。与以单克隆抗体为基础的流式细胞术分类计数仪相比，
血涂片与分类流程
血涂片与分类流程Revised on November 25, 2020
血涂片和分类计数的质量控制流程1、目的： 规范血涂片评价和分类计数的质量控制管理流程，确保检验质量。 2、适用范围： 检验科门诊化验室、细胞室 3、职责： 检验科门诊化验室、细菌室检验人员均须熟知并遵守本程序。 4、质量控制流程： 血涂片的制备 玻片：保持中性、洁净、无油腻 制备血涂片：血涂片外观应头、体、尾分明，分布均匀，边缘整齐，两侧留有空隙。血膜外观应厚薄适宜。血膜厚度、长度和血滴的大小、推片与玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。一般血滴大、角度大、推片速度快则血膜厚；反之，则血膜薄。血细胞比容低于正常时，血液粘度高，宜保持较小的角度，可得满意结果；相反，血细胞比容低于正常时，血液较稀，则需用较大的角度和较快的推片速度，才可得满意的血涂片。良好的血涂片的“标准”为血膜由厚到薄逐渐过渡。 染色：血涂片应在1h内完成染色，或在1h内用无水甲醇固定后染色。 血涂片分类计数质量控制流程
血涂片白细胞分类计数方法：是有血涂片经瑞氏染色后，在油镜下根据白细胞形态特点逐个分类计数（一般计数100-200个白细胞），并观察其形态变化，然后求各种白细胞的比值。 血涂片分类计数注意事项：血涂片进行白细胞分类科稳定6-8h，但2h后粒细胞形态即有变化，故需要镜检分类应及早分血片：正确判断是否需要人工显微镜复查，凡出现以下情况之一者，都应当进行显微镜复查。（1）血细胞计数结果明显异常（WBC<×109/L，WBC>×109/L，Hb<50g/L，PLT<50×109/L）。（2）血细胞直方图异常：红细胞、白细胞、血小板任何一项直方图的峰值出现偏移。（3）出现警示信号。这需要我们操作人员在日常生活中严格执行，注意分析检验结果各参数之间的关系，才能对异常结果做出正确判断。加强与医护人员的联系：对在检测中出现的异常和阳性结果，要及时主动和临床医生取得联系，与临床资料进行相关性分析，对有疑问的做到合理解释。 1 、目的：
血涂片的制备与染色
血涂片制备与染色 血涂片是通过特定的方法将血液按一定方向均匀涂开的过程，微观上使细胞是由球形变为平面形或近平面形平铺在载玻片上。血涂片的显微镜检查是血液细胞形态学检查的基本步骤，特别是对于各种血液病的诊断和鉴别诊断，具有重要价值。血涂片制备是否合格、染色的好坏直接关系到检验结果的质量。 （一）血涂片制备 1.载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，须用浓度为lmol/L的HCl浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备用。旧载玻片要用含洗涤剂的清水中煮沸20min，洗掉血膜，再用清水反复冲洗，最后用0.95L/L乙醇浸泡1h，干燥备用。 使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2.血涂片制作方法 取血液标本一滴置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持30～45○夹角，平稳地向前推动，血液即在载玻片上形成薄层血膜。 涂片的厚薄与血滴大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及血细胞比容有关。血滴大、角度大、速度快则血膜越厚；反之则血膜越薄。 一张良好的血涂片，要求厚薄适宜，头体尾明显，细胞分布均匀，血膜边缘整齐并留有的空隙。 （二）血涂片染色 染色的目的是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。 血涂片染色包括两个过程：固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。常用的染色方法有瑞特染色法（Wright）、姬姆萨染色法（Giemsa）等。 1.瑞特（Wright）染色法 为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。目前常用瑞特染色法。 （1）瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。
血涂片的制备
实验二血涂片的制备 Preparation of Blood Smear 实验原理 使用推片将血液在载玻片制成血膜。 试剂器材 载玻片（清洁、干燥、无尘、无油脂、25cm×75cm，厚度0.8mm~1.2mm）、推片。 操作步骤 （1）采血静脉采血后，使用玻璃棒、毛细管、注射针头等在距载玻片一端1cm处加1滴（约0.05ml）抗凝血，如果使用手指采血则直接用洁净玻片蘸 1 滴血。 （2）推片左手平执载玻片，或放在类似桌子等平 坦地方，右手持推片从后方或前方接近血滴，使血液沿 推片边缘展开成适当的宽度，立即将推片与载玻片呈 30。~45。角，轻压推片边缘将血液推制成厚薄适宜的血 涂片（图1-6），血涂片应呈舌状，头、体、尾清晰可见。 （3）干燥将推好的血涂片在空气中晃动，使其迅 速干燥。天气寒冷或潮湿时，应于37 ℃温箱中保温促 干，以免细胞变形缩小。 图1-6 推片（4）标记在载玻片的一端用记号笔编号。 注意事项 1．要制备良好的血细胞涂片，玻片必须干净。新购置的载玻片常带有游离碱质，必须用约1mol/L HCl浸泡24h后，再用清水彻底冲洗，擦干后备用。用过的载玻片可放入含适量肥皂或其他洗涤剂的清水中煮沸20min，洗净，再用清水反复冲洗，蒸馏水最后浸洗后擦干备用。边缘破碎、玻面有划痕的玻片不能再用。使用玻片时，只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 2．最好使用非抗凝血制备血涂片，也可用EDTA抗凝血制备。使用抗凝血标本时，应充分混匀后再涂片。抗凝血标本应在采集后4h内制备血涂片，时间过长可引起中性粒细胞和单核细胞的形态学改变。制片前标本不宜冷藏。涂片的厚度、长度与血滴的大小、推片与载玻片之间的角度、推片时的速度及红细胞比容有关。一般认为血滴大、血粘度高、推片角度大、速度快则血膜厚，反之则血膜薄。故针对不同病人应有的放矢，对血细胞比容高、血粘度高的病人应采用小血滴、小角度、慢推；而贫血患者则应采用大血滴、大角度、快推。 3．血膜应厚薄均匀适度，头尾及两侧有一定的空隙。如血膜面积太小，可观察的部分会受到局限，故应以在离开载玻片另一端2cm的地方结束涂抹为宜。一些体积特大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此画线应注意保存血涂片尾部细胞。 4．血涂片必须充分干燥后方可固定染色，否则细胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色过程中容易脱落。 实验评价 血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。除可
实验四-血涂片形态检查
实验四血涂片形态检查 Examination of Blood Smear 实验原理 血细胞经涂片、固定和染色后，可体现出不同发育阶段及病理生理改变的白细胞，在细胞体积、细胞质成分及酸碱性、细胞核染色质含量及空间排列状态的差异，借助显微镜对上述差异进行总体分析而将各种白细胞区别开来。 成熟红细胞不含细胞核，细胞质的主要成分是血红蛋白，略呈碱性。制成血涂片经瑞-吉染色后，血红蛋白与染液中呈酸性的伊红结合而显桔红色或淡粉红色。同时也展现出红细胞的各种形态学特点。 试剂器材 1．试剂香柏油、二甲苯或乙醇—乙醚清洁液 2．器材经瑞氏染色的血涂片、拭镜纸、目镜测微尺。 操作步骤 1．肉眼观察血涂片的外观和染色情况，正面向上置于显微镜载物台上。 2．镜检 （1）调试好显微镜。 （2）低倍镜观察：采用10×目镜观察血涂片的质量，选择细胞分布均匀、染色良好、细胞排列不拥挤（即红细胞单个分散不重叠）的区域（一般在血涂片的体尾交界处），准备进一步检测。 （3）高倍镜观察：转换40×目镜，整体观察血涂片细胞着色，有无特殊细胞。 （4）油镜观察：在选定的观察区域，滴加香柏油1滴，转换油镜，仔细观察白细胞的形态结构，红细胞的大小、形态是否正常，细胞内有无内容物，以及血红蛋白的充盈度和着色是否正常。同时作好记录。 2．结果统计与报告白细胞分类计数百分比报，对异常形态白细胞描述；对所见大小、形态异常的红细胞及有核红细胞按百分比报告；红细胞内出现异常结构及血红蛋白充盈度异常和着色异常者按有或无报告。 注意事项 应用低倍镜浏览全片，特别是血膜的两侧和尾部，以防异常成分漏检。 参考范围 一、镜下所见正常白细胞形态： 1．中性粒细胞成熟的中性粒细胞胞体呈圆形，直径10μm ~15μm，细胞核呈分叶和单个杆状两种形态。核染色质疏密不匀，部分聚集成块状，DNA和组蛋白分别被美蓝和伊红着色染成深紫红色。细胞质内因充满大量细腻均匀的紫红色中性颗粒，染色后呈均一的呈粉红色。一般以核径最窄处小于最宽处1/3者，视为分叶核；核径最窄处大于最宽处1/3即为杆状核。中性杆状核粒细胞核形多样，胞核细长，弯曲，可呈C形、S形、V形或不规则形。中性分叶核粒细胞细胞核分2叶~5叶，甚至5叶以上，叶间以核丝或核桥相连。 2．嗜酸性粒细胞细胞体呈圆形，直径约13μm ~15μm，略大于中性粒细胞。细胞核多分为两叶，中间以细丝相连呈“眼镜”状，偶见分为3叶~4叶者。细胞核染色质粗糙，染成紫红色。胞质中充满粗大、均匀的桔红色嗜酸性颗粒，颗粒富有立体感，排列整齐、紧密。 3．嗜碱性粒细胞细胞体呈圆形，直径约10μm ~12μm，略小于中性粒细
血液涂片的制作与染色
血液涂片的制作与染色 日期:2010-06-04来源:作者:点击:1031次我要评论 分享到：检验微博新浪微博网易微博腾讯微博搜狐微 博QQ空间朋友社区人人网 核心提示:做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节 做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。 一．玻片的清洁 1．一般清洗法 （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。 （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2．油污载片清洗法 （1）清洗液 甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。 （2）清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。 二．血涂片制作 取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。 一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。 三．染色 1．瑞氏染色法（Wright staining） 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异
血涂片及染色操作程序
1.目的 规范血涂片及染色操作程序，确保检测结果准确度。 2.标本种类 人体静脉血或末梢血。 3.适用范围 操作区的血涂片及染色。 4．染色原理 血涂片染色过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。由于血细胞内不同结构所含有的化学成分不同，对瑞氏染料亲和力也不同，涂片经染色后，各类细胞呈现不同的着色，从而达到辨别其形态、特征的目的。 5.试剂与器材 5.1一次性采血针、末梢采血器、棉签、碘酒等。 5.2标准级显微镜载玻片、推片、瑞氏染液、OLYMPUSCH20双目显微镜（日本OLYMPUS公司） 6．操作步骤 6.1薄血膜推片法 取血标本一滴置载玻片的一端1cm处或载玻片一侧的3∕4处。以边缘平滑的推片端，从血滴前沿方向接触血液，使血液沿推片散开，推片与载玻片保持25～30o的平面夹角，平稳地将血向前推动，血液即在载玻片上形成一薄层血膜；将制成的血膜在空气中挥动，使迅速干燥，以免血细胞皱缩。天气寒冷或潮湿时，应置于37℃温箱中保温促干，以免细胞皱缩。最后在载玻片的一端用记号笔编号。 6.2厚血膜涂片法 取新鲜血液1滴于载玻片的中央，用推片的一角将血滴由内向外旋转涂布，制成厚薄均匀、直径约1.5cm的圆形血膜，待自然干燥后，滴加数滴蒸馏水，使红细胞溶解，脱去血红蛋白，倾去水，血涂片干燥后即可染色并用显微镜检查。本方法特别适合检查疟原虫、微丝蚴等。 6.3染色 平置玻片于染色架上加瑞氏染液3～5滴染色，使其迅速盖满血膜。约1分钟后滴加缓冲液布满，轻轻摇动玻片，使染色液充分混合。5～10分钟后，用水冲去染液，待干。 7.标本要求
7.1玻片必须清洁、干燥、中性且无油腻。 7.2最好使用非抗凝血，也可使用EDTA抗凝血，但必须在采集后4小时内制成血涂片。 7.3使用抗凝血标本不宜冷藏，用前必须混匀。 8.注意事项 8.1推制的涂片应厚薄适宜，血膜应呈舌状，头、体、尾清晰可分。 8.2涂片的好坏与血滴大小、推片与载片之间角度、推片时的速度有关，血滴大、角度大、速度快，则血膜厚；反之则血膜薄。 8.3血膜分布不匀，主要是推片边缘不齐、用力不匀或载玻片不清洁所致。 8.4瑞氏染液使用后，要迅速盖好，避免挥发。 8.5血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落，应在1小时内染色。 8.6染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，冬季室温过低时，染色时间要适当延长。 8.7冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防染料沉着。冲洗时间也不能长。8.8染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色。 参考文献 1.中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程（第3版）.南京：东南 大学出版社，2006. 2.江苏省卫生厅.医院检验科建设管理规范（第2版）.南京：东南大学出版社， 2013.
血涂片的制作
1．检验目的 指导血涂片的制作，进行血细胞显微镜检查。 2．方法原理 血涂片的显微镜检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛。一张良好的 血涂片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，血膜边缘要整齐，并留有一定 的空隙。血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血涂片愈薄。 3．方法性能参数（如线性、检出限、测量区间、不确定度、准确性、精密度、灵敏度和特异性） 4．标本类型（如血浆、血清、尿液等） 抗凝的全血标本。 EDTA-K 2 5．要求的容器、防腐剂或添加物、仪器、试剂或分析系统 载玻片、推片、微量吸管、瑞氏染液（刘氏快速染液）。 6．校准程序（计量学溯源性） 7．质量控制，控制品使用水平和频率，允许限的纠正措施 7.1引起血涂片分布不均的主要原因：推片边缘不整齐，用力不均匀，载片不清洁； 7.2血膜未干透，细胞尚未牢固附在玻片上，染色过程中容易脱落，因此血膜必须充分 干燥； 7.3血片制好后最好立即固定染色，以免细胞溶解和发生退行性变； 7.4血涂片太薄，50%的白细胞集中于边缘或尾部； 7.5血涂片过厚，细胞重叠缩小。 8．程序步骤 8.1取干净载玻片一张，手持玻片两端。 8.2用微量吸管取混匀的新鲜血液，将血液滴在距离载玻片一侧4-5mm处。 8.3取一块边缘光滑的载玻片作为推片，将推片的一端至于血滴的前方，向血滴处移动， 触碰到血液，使血液迅速均匀分布在推片与载玻片的接触处。 8.4将推片与载片呈30-45度角，平稳地向载片另一端推出。
8.5将推好的血片自然干燥。 8.6用瑞氏染液（刘氏快染）染色，见《瑞氏染色》。 9．计算结果原理 10．生物参考区间 11．警告值、危急值（适用时） 12．检验结果可报告区间 13．对超出可报告范围的结果的处理 14．实验室解释 15．安全防护措施 所有标本按具有潜在传染性的标本处理。 16．最常见的误差源。 17．方法的局限性（如乳糜血、溶血、高胆红素血等干扰影响、交叉反应等）18．参考文献 19．有关引用程序与文件 20．SOP涉及的记录与表格
血涂片的制作及应用
血涂片的制作及应用 血常规是医院常作的检查项目，但是由于大部分的医院用的都是三分类的血球仪（五分类血球仪价格太高），在分析上存在一定的缺陷，而血涂片则能在一定程度上很好的补偿，使得三分类的血球仪也能起到五分类的效果。而且血涂片的作用还不仅于此，它还能更直观的放映细胞的形态，以及血液的一种状态。现在就血涂片的制作和应用做一个介绍。 血涂片的制作： 血涂片的制作方法很多，但需要的材料也都是一样的，载玻片和（或）盖玻片。现在介绍一种我们医院常用的涂片方法： 1、首先左手持一载玻片，将采到的血（做血常规剩下的血）滴一滴到载玻片一端： 血涂片 2、右手持一盖玻片作为推片，成30-45度角于血滴前方靠近血滴 血涂片 3、右手移动盖玻片使其一端与血液接触 血涂片 4、右手持盖玻片往前推动，速度不能太慢，保证血液均匀的被推开 血涂片 5、做好的血涂片
血涂片 5、血涂片做好后需要风干，之后就可以进行染色，尽管每个医院所用染色液可能不一样，但基本的方法都一致，也可以根据染色液的说明进行具体操作，我们医院用的是diff-quick染液。 染好的片子就需要在显微镜下观察，一般我们会从低倍镜开始观察，再逐次转换为高倍镜甚至油镜。 。 细胞分类计数器 一般情况下，我们会在显微镜下找到一个合适的视野开始计数，按照一定的方向顺序来数白细胞，而这个视野的选着会很重要，在做血涂片的时候血涂片上通常会有三条带，中间的那一条带就是我们观察的区域，镜下会显示细胞既不重叠也不太稀疏。然后我们会把数的100个白细胞记录下来并分类，并分别记下各类细胞所占的比例。 细胞分类计数器 （细胞分类计数器） 通过这样的方法，我们就可以得到白细胞下各个种类的比例，结合血常规的白细胞数目就可以得到一个五分类的项目，这对于分析动物的身体状况更加的全面和科学。如上图的结果是：嗜中性粒细胞百分比：70%（分叶：57%，杆状：13%）；淋巴性细胞百分比：25%；单核细胞百分比：3%；嗜酸性粒细胞百分比：2%；嗜碱性粒细胞百分比：0。 再简单举例说一下血涂片在临床上的应用，也是结合血常规的分析。如下图为一只犬的血常规结果：
做好血液涂片和正确染色
（一）玻片的清洁 1．一般清洗法 （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。 （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95 ％乙醇中浸泡1 小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或 10 ％盐酸浸泡24 小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2．油污载片清洗法 （1）清洗液 甲液10g／L 过锰酸钾水溶液乙液25g／L 草酸水溶液 （2）清洗方法将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95 ％乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。 （二）血涂片制作 取末梢血1 滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。 推血片方式
一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50 ％的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。 （三）染色 1．瑞氏染色法（Wright staining） 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。 （1）原理瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离子。 如以M ＋代表美蓝，以E －代表伊红，其反应式为： M ＋Cl－＋Na ＋E→M E ↓＋NaCl 美蓝伊红伊红化美蓝（瑞士染料） 将适量的M E（瑞士染料）溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME 溶解，解离为M ＋和E －，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇（AR）的另一个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。
血液涂片的制作与染色
血液涂片的制作与染色 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
血液涂片的制作与染色 日期:2010-06-04来源:作者:点击:1031次 分享到： 核心提示:做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节 做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。？ 一．玻片的清洁？ 1．一般清洗法？ （1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。？ （2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。？ 2．油污载片清洗法？ （1）清洗液？ 甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。 （2）清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。？ 二．血涂片制作？
取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。？ 一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。？ 涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。？ 三．染色 1．瑞氏染色法（Wright staining）？ 本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。？ （1）原理瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离子。如以M+代表美蓝，以E-代表伊红，其反应式为：？ M+Cl- +Na+E→ ME↓+NaCl？ 美蓝伊红伊红化美蓝（瑞士染料）？ 将适量的ME溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着
血涂片的制作项目及评分细则
血涂片的制作及评分细则 一、时间：2013年11月 二、地点：生物实验室 三、材料、人员准备： 1.所需动物：家兔或鸡 2.所需药品：瑞氏染料、甲醇、0.9%生理盐水（NaCl）、碘酒、 酒精、棉签 3.比赛分组：5～８人／组，１只动物／组 4.参赛班级：15、16级农学班 四、比赛操作要求： （一）采血（三种方法中任选一种） （1）耳缘静脉取血：将家兔放在固定盒内，拔去拟采血部位的毛，用酒精棉球擦耳壳，使耳部血管扩张。用左手食指和中指夹住静脉近心端，拇指和小指夹住耳缘部分，以左手无名指和小指放在耳下作垫，待静脉充盈后，右手持注射器使针头由静脉末端刺入，顺血管方向向心端刺约1～1.5cm，一次抽取2～5ml血液后，棉球压迫止血。（2）兔耳中央动脉取血：在兔耳的中央有一条较粗、颜色较鲜红的中央动脉，用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉末端，沿着动脉向心方向平行刺入动脉，此法一次可取血10～15ml。取血完毕后注意止血。抽血时要注意：由于兔耳中央动脉易发生痉挛性收缩，因此抽血前，必须先让兔耳充分充血，当动脉扩张，未发生痉挛性收缩前立即抽血。不要在近耳根处取血，因耳根部软组织厚，血管位置较深，易刺透血管造成皮下出血。
（3）心脏取血：将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛剪去，用碘酒酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器。取得所需血量后，迅速将针头拔出，这样心肌上的穿孔易于闭合。经6～7天后，可以重复进行心脏采血。 （二）涂片： 1.采集绿豆大小的血滴，用清洁玻璃片面一端轻轻接触血滴，使血滴附于玻片上（注意动物皮肤不要接触到玻片，否则血在玻片上就不能成滴状；用玻棒蘸一滴血于玻片上也可） 2.以左手拿该玻片的两端，迅速以右手拿住另一载玻片的一端，在左手载玻片上由前向后接触血滴，使两玻片成45度角，轻轻移动，使血滴成一条直线，然后由前向后推为一均匀薄片。 3.涂片在空气中干燥后置于染色架上，滴上瑞氏染色剂，使涂片被染色液覆盖。 4.染色1分钟后，再滴加等量的缓冲液在染色液上，浸染约5～8分钟，此时玻片表面呈现一层古铜色。 5.用蒸馏水迅速冲洗，见涂片呈粉红色后，自然晾干。 （三）血细胞的识别 1、正确使用显微镜，并调至高倍镜（×40）下，成像清晰。 2、在显微镜下正确识别：红细胞、血小板（或凝血细胞）、淋巴细胞等。