固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究
菌物学报26（2）：273~278，2007
Mycosystema
固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究
胡奎娟1，2 吴克2 潘仁瑞2 刘斌2 蔡敬民1，2*
（1安徽农业大学生命科学学院 合肥 230036；2合肥学院生物与环境工程系 合肥 230022）
摘 要：研究了接种比例、接种时间、碳源、氮源等因素对木霉和黑曲霉混合发酵产木聚糖酶和纤维素酶的影响。试验结果表明，当木霉和黑曲霉按4:6同时接种，以玉米芯3.75g、麸皮3.75g、葡萄糖37.5mg 为混合碳源，Mandels营养盐11.5mL、添加NH4NO37.5mg为氮源，在84h产纤维素酶活力达到230IU/g干物质，木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质，与两菌纯培养相比，纤维素酶活力提高163%，木聚糖酶活力提高79.5%。
关键词：木霉，黑曲霉，接种比例，接种时间，碳源，氮源
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2007）02-0273-0278
Solid-state mixed fermentation increases activities of xylanase and cellulase
HU Kui-Juan1,2WU Ke2 PAN Ren-Rui2LIU Bin2 CAI Jing-Min1,2
（1College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036; 2Department of Biology & Environment Engineering, Hefei College, Hefei 230022）
Abstract: The influences of different factors, such as inoculum proportion, different incubation time, carbon sources and nitrogen sources etc., on the activities of xylanase and cellulase produced by solid-state mixed fermentation of Aspergillus niger A3 and Trichoderma sp. T6 were studied. The result showed that the optimal conditions for solid-state mixed fermentation of T6 and A3 was as follows: mixed inoculation of T6 and A3 in the ratio of 4:6, mixed carbon sources containing 3.75g corn cob, 3.75g wheat bran and 37.5mg glucose, and 11.5mL Mandels nutrient solution containing 7.5mg NH4NO3. In the period of 84h, mixed fermentation CMCase activity reached 230IU/g dry matter and increased by 163%, and xylanase activity reached 1308IU/g dry matter and increased by 79.5% over solitary fermentation of T6 and A3.
Key words: Trichoderma sp., Aspergillus niger, inoculum proportion, incubation time, carbon and nitrogen sources
纤维素和半纤维素是植物的主要组份，两者合计占植物干物质的2/3左右，是自然界蕴藏量最丰富的可再生资源。纤维素酶和木聚糖酶在开发和利用这一资源中具有十分重要的作用。这两种酶在食品工业、畜牧养殖业、环境保护、造纸和生物能源等领域中也有广泛用途（Wang et al.，1994；Viikari et al.，1994；Cai et al.，1998；Lemos et al.，2001）。在酶制剂工业中一般都是由一种微生物生产一种酶制剂，但在某些应用领域需同时存在两
基金项目：安徽省科技厅年度重点攻关项目（No.05023074）；安徽省优秀青年科技基金项目（No.04043051）
*通讯作者Corresponding author.Tel:0551-*******; E-mail:caijingmin@https://www.wendangku.net/doc/1811445860.html,
收原稿日期：2006-11-09，收修改稿日期：2006-12-07
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种或多种酶的产品，通常将几种酶制剂按比例混合制成混合酶制剂以满足市场需求。
国外报道了采用里氏木霉和温氏曲霉通过液态混合发酵，产生纤维素酶和半纤维素酶的制剂（Ghose et al.，1985）；通过上述两种菌的混合培养显著提高了木聚糖酶活力（Panda et al.，1987）。本研究采用木霉T6和黑曲霉A3通过固态混合发酵，同时生产并提高纤维素酶和木聚糖酶的活力。
1材料与方法
1.1菌种
黑曲霉Aspergillus niger A3和木霉Trichoderma sp.T6菌株，合肥学院实验室保存。1.2培养基及培养方法
1.2.1培养基：（1）斜面培养基：采用PDA培养基。（2）固态发酵基础培养基：在250mL 三角瓶中装入粉碎的100目麦秸、麸皮和玉米芯，按比例1:1:1，共7.5g，用1.5倍（v/w）改良的Mandels营养盐（蔡敬民等，1997）配制。
1.2.2接种和培养：制备孢子悬液（1.2×107个/mL），向三角瓶接种1mL，用接种针搅匀后培养。
1.3测定方法
1.3.1粗酶液制备：向取出的固体曲样中按1:10（v/v）加入0.2mol pH4.6醋酸盐缓冲液，室温浸提1h，抽滤得粗酶液。
1.3.2木聚糖酶活力测定：参见Bailey等（1992）方法，以木糖为标准每分钟形成1μmol 还原糖的酶量定义为1个酶活力国际单位（IU）。
1.3.3 CMC纤维素酶活力测定：参照Mandels et al.（1976）的方法。
1.3.4蛋白质含量测定：按Bradford（1976）考马斯亮蓝G-250比色法测定。
1.3.5还原糖含量测定：参照Miller（1959）的方法。
2 结果与讨论
2.1木霉T6和黑曲霉A3的产酶能力和速率比较
从本实验室所保存的木聚糖酶高产菌株中，分别选出了产纤维素酶和木聚糖酶较高的二株木霉T6和黑曲霉A3，进行了固态发酵产酶过程的试验（图1）。
木霉T6和黑曲霉A3菌株相比较，CMC纤维素酶活力较高，在96h产酶达到高峰，酶活力为87.7IU/g干物质，其木聚糖酶活力较低，为600IU/g干物质。黑曲霉A3生长速度较快，产木聚糖酶相当高，其高峰期在72h，此时酶活力为729IU/g干物质；CMC纤维素酶活力为36.6IU/g干物质，A3的产酶高峰期较T6菌株提前了24h。以上分析表明，有可能通过木霉和黑曲霉的混合发酵来改进对培养基组分的利用，并调节产酶周期，从而达到同时提高产生木聚糖酶和纤维素酶活性的能力。
2.2木霉T6和黑曲霉A3固态混合发酵接种比例的优化
木霉和黑曲霉的孢子按不同比例同时接种，研究了接种物配比对产酶的影响。试验结果表明，两菌株之间没有明显的拮抗作用，可以在任何比例混合生长，只是黑曲霉生长较快。从图2可见，当T6:A3为3:7时，72h木聚糖酶活力最高，达到1005IU/g干物质，96h CMC 纤维素酶活力为112IU/g干物质；T6:A3为4:6时，96h CMC纤维素酶活力最高，达到124IU/g 干物质，72h木聚糖酶活力为943IU/g干物质。综合考虑，木聚糖酶活力和纤维素酶活力，
2期 胡奎娟等：固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究 275 在以后的试验中，均采用4:6的接种比例。
2.3木霉T6和黑曲霉A3固态混合发酵接种时间的优化
试验结果如表1所示，先接种T6再接种A3，接种时间间隔均为4～12h ，产CMC 纤维素酶活力前者都高于后者；而产木聚糖酶活力则相反，前者均低于后者。在同时接种T6和A3的情况下，对于CMC 纤维素酶，同时接种的产酶能力都高于错开接种时间的处理；而对于木聚糖酶，同时接种的明显高于先接种T6的酶活力，但略低于先接种A3的酶活力。分析其原因，由于黑曲霉的生长速度较木霉快，它主要产生木聚糖酶，纤维素酶活
表1 不同接种时间对固态混合发酵的影响
Table 1 Effect of different inoculation time on enzyme production from solid-state mixed fermentation
接种时间（h ）
Inoculation time （h ）
木聚糖酶活力 Xylanase activity （IU/g dry matter ）CMC 纤维素酶活力 CMCase activity （IU/g dry matter ） 木霉Trichoderma sp .T6 solitary inoculation
黑曲霉Aspergillus niger A3 solitary inoculation
600.5 729 87.7 36.6 同时接种木霉T6 和黑曲霉A3
A3 and T6 simultaneous inoculation
1017.2 134.6 先接种T6,4h 后接种A3
A3 followed T6, after 4 h interval
629.3 109.4 先接种T6,8h 后接种A3
A3 followed T6, after 8 h interval
666.1 103.1 先接种T6,12h 后接种A3
A3 followed T6, after 12 h interval
648.5 101.1 先接种A3,4h 后接种T6
T6 followed A3, after 4 h interval
1126.5 80.7 先接种A3,8h 后接种T6
T6 followed A3, after 8 h interval
1164.6 87.5 先接种A3,12h 后接种T6
T6 followed A3, after 12 h interval 1220.0 90.3
图2 接种比例对固态混合发酵产酶的影响
Fig.2 Effect of inoculum proportion on enzyme production from solid-state mixed fermentation. 图1 木霉T6和黑曲霉A3的产酶曲线 Fig.1 Curve of enzyme production from Trichoderma
sp .T6 and Aspergillus niger A3 solitary fermentation.
276 菌 物 学 报 26卷 力较低；而木霉则相反，产生的纤维素酶活力较高。因此错开接种时间，先接T6的纤维素酶活力偏高，而先接A3的则木聚糖酶活力高。如果兼顾考虑两种酶的活力，则以同时接种为好。在混合培养条件下，同时接种的产酶能力是远高于单菌纯培养的处理，表明两种菌共培养时，相互竞争生存空间，可以提高它们对营养物质的利用率，从而提高有关酶系的合成能力。
2.4木霉T6和黑曲霉A3固态混合发酵碳源的优化
参考A3产木聚糖酶固态培养条件（蔡敬民等，1997）和T6产CMC 纤维素酶固态培养条件（吴克等，2001，2002）的基础上设计以下5个不同碳源培养基配方。
碳源A ：麦秸3.75g 、麸皮3.75g 、葡萄糖37.5mg
碳源B ：玉米芯3.75g 、麸皮3.75g 、葡萄糖37.5mg
碳源C ：麦秸2.5g 、麸皮2.5g 、玉米芯2.5g 、葡萄糖37.5mg
碳源D ：麦秸2.5g 、麸皮2.5g 、玉米芯2.5g 、淀粉37.5mg
碳源E ：麦秸2.5g 、麸皮2.5g 、玉米芯2.5g
在培养基的碳源组分中，麸皮与玉米芯的比例为1:1并加入少量的速效碳源葡萄糖，对产木聚糖酶的影响比较显著（图3）。但是几种碳源对产纤维素酶的酶活力影响不大（图
4）。这可能与玉米芯和麸皮含有相对较多的可以供黑曲霉生长所利用的其它营养成分有关。发酵过程中产生适量的纤维素酶也可以促进玉米芯等纤维物质的降解。总之，玉米芯和麸皮作为最适迟效碳源，不仅可以保证木聚糖酶的酶活力，而且这两种廉价碳源也有利于木聚糖酶的工业化生产。再伴有速效碳源葡萄糖，适量的添加更有助于菌体早期的生长繁殖，更利于酶活力的提高。
图3 不同碳源对固态混合发酵产木聚糖酶的影响 Fig.3 Effect of different carbon sources on xylanase production from solid-state mixed fermentation.
图4 不同碳源对固态混合发酵产CMC 纤维素酶的影响
Fig.4 Effect of different carbon sources on CMCase
production from solid-state mixed fermentation.
2.5木霉T6和黑曲霉A3固态混合发酵氮源的优化
按照以上优化条件，比较五种含氮率相同的氮源对T6和A3混合产酶的影响。由表2可知：从生长情况来看，以硝酸铵为氮源的菌株生长旺盛，并且生长速度快，酶活力最高。
2期胡奎娟等：固态混合发酵提高木聚糖酶和纤维素酶活力的研究 277
表2 不同氮源对产酶的影响
Table 2 Effect of different nitrogen sources on enzyme production
氮源（0.1%）Nitrogen source（0.1%）
木聚糖酶活力
Xylanase activity（IU/g dry matter）
CMC纤维素酶活力
CMCase activity（IU/g dry matter）
NaNO31025.3153.1
NH4CO31000.7141.1
NH4NO31311.8163.6
蛋白胨Peptone 1133.0149.0
酵母膏Yeast extract 1216.3150.9
2.6培养基优化后固态混合发酵产酶的动态过程
按照图5还原糖消长情况推测，0h的还原糖主要是培养基中添加的葡萄糖。又据显微镜下观察，黑曲霉和木霉的分生孢子在培养液中1h左右即开始萌芽。由此估计发酵12h 左右即开始产生木聚糖酶和纤维素酶，通过这些酶系的作用，降解培养基中的纤维物质，释放出葡萄糖和木糖等单糖及它们的低聚糖，致使基质中的还原糖含量呈直线上升，为黑曲霉和木霉的生长以及蛋白质的合成提供
足够的碳源和能源。至24h，已产生相当量的木聚糖酶和纤维素酶。培养48h基质中的还原糖含量达最大值，由于此阶段菌丝体大量摄取还原糖，并开始由生长旺盛期转入繁殖期，先后出现黑色和绿色的分生孢子，基质中的还原糖呈直线下降，而木聚糖酶、纤维素酶和可溶性蛋白质的合成仍继续上升。72h基质中可溶性蛋白质达最高值，还原糖含量继续下降。84h培养基表面有大量黑色和绿色孢子，木聚糖酶和纤维素酶活力达最高值，还原糖含量迅速下降。96h后，木聚糖酶活力和纤维素酶活力呈明显下降趋势。优化条件下，木霉和曲霉固态混合发酵产生的木聚糖酶和纤维素酶，与纯培养的木霉和黑曲霉相比，木聚糖酶活力提高163%，纤维素酶活力提高79.5%。
图
5 优化条件下固态混合发酵产酶过程
Fig.5 Optimal condition of solid-state mixed fermentation produced enzymatic period.
3结论
木霉T6和黑曲霉A3两个菌种在共培养的条件下，相互利用对方的以及自身所分泌的酶系及其降解产物，既可用于自身的生长繁殖，也为对方的生长繁殖提供营养物质；混合发酵提高了两种酶活力是两种菌产酶协同作用的结果。Gutierrez-Correa等（1999）研究认为两菌种之间的相容性和培养基的营养条件是决定混菌发酵成功与否的关键因素。本实验结果表明，当木霉和黑曲霉按4:6同时接种，以玉米芯3.75g、麸皮3.75g、葡萄糖37.5mg 为混合碳源，Mandels营养盐11.5mL、添加NH4NO3 7.5mg为氮源，在84h产纤维素酶活力
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达到230IU/g干物质，木聚糖酶活力达到1308IU/g干物质，与两菌纯培养相比，纤维素酶活力提高163%，木聚糖酶活力提高79.5%。
试验结果也说明，固态混合发酵制取复合酶制剂，简化发酵工艺，节约原材料成本，提高复合酶制剂的产量，使木聚糖酶和纤维素酶生产成本大大降低。因此利用组合培养的固态发酵模式生产木聚糖酶和纤维素酶在工业上具有较大的应用潜力。
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[附中文参考文献]
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