慢病毒载体介导的BDNF基因与电针对神经病理痛模型大鼠痛阈的影响
NPY 与Y2受体结合后抑制同一神经末梢谷氨酸的释放。NPY 可能通过上述两种机制起到了抗癫痫作用,从而抑制了FOS 蛋白的表达。本实验中大鼠在侧脑室注射外源性NPY 后FOS 表达明显减少,低于生理盐水干预组,有显著性。说明NPY 有抗癫痫作用,可以抑制FOS 表达。
丹参能缓解缺血脑组织单胺类神经递质和神经肽的紊乱,抑制缺血后兴奋性氨基酸的异常升高,减少癫痫样放电及提高惊厥阈[6]。丹参多酚酸盐注射液主要是丹参的水溶性活性成分,可通过改善ATP 酶功能,抑制Ca 2+聚集而减轻脑损伤后海马神经元的损伤,具有很强的抗脂质过氧化和清除自由基的作用。本研究证实,丹参多酚酸盐干预组FOS 表达较生理盐水干预组少,有显著差异。我们认为丹参多酚酸盐可能通过某种机制抑制了FOS 的表达,在一定程度上起到了抗癫痫作用。本实验为研究抗癫痫新药提供了新的思路,阐明了有些中药成分有抗
癫痫作用。
参考文献:
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(收稿日期:2010-09-26)
基金项目:上海市教委资助(08CZ036)*通讯作者
文章编号:1007-4287(2011)06-0959-04
慢病毒载体介导的BDNF 基因与电针
对神经病理痛模型大鼠痛阈的影响
黄爱苹1,谢 磊1,薛纯纯1,李诚女2,谷 桢1,王开强1*
(1.上海中医药大学附属市中医医院疼痛科,上海200071; 2.淳安县人民医院麻醉科)
摘要:目的 观察慢病毒载体介导的BDNF 与电针对神经病理痛模型大鼠热辐射痛阈的影响差别,比较基因与电针的镇痛疗效,探讨BDNF 对疼痛可能的作用机理。方法 本研究采用坐骨神经结扎损伤的神经病理性疼痛大鼠CCI 模型,运用荧光免疫标记法,观察慢病毒载体介导的BDNF 与电针干预后大鼠不同时间点(3d 、7d 、21d)BDNF 在相应节段脊髓内表达的变化。另运用B ME -410C 热痛刺激仪记录大鼠术前(0d)及术后1d 、3d 、5d 、7d 、9d 、14d 、21d,各组的热辐射刺激缩足潜伏期痛阈的变化。结果 大鼠热痛敏阈值的变化:各组大鼠CCI 术前热痛敏阈值均无明显差异。模拟对照组大鼠各时点热痛敏阈值无明显差异。阴性对照组与空白对照组各时点相比无统计学差异。CCI 术后一天各组热痛敏阈值低于模拟对照组(P <0.05)。术后第5天,试验组、电针组热痛敏阈值上升,高于空白及阴性对照组(P <0.05),术后7天,实验组上升至最高点,试验组与电针组无明显差异(P >0.05)。术后9天、14天、21天,实验组热痛敏阈值下降,术后7天、9天、14天电针组热痛敏阙值趋于稳定,均高于空白及阴性对照组(P <0.05),术后9天、14天实验组与电针组有明显差异(P <0.05),术后21天,试验组与电针组无明显差异(P >0.05)。荧光免疫组化观察:空白对照组、阴性对照组及模拟对照组术后第3天、第7天、第21天时点大鼠L4/5段脊髓阳性神经元表达无明显变化(P >0.05),试验组三时点阳性神经元先增加后降低,术后第7天最高,与其他组相比阳性神经元表达明显升高(P <0.05),电针组阳性神经元有所增加,但与阴性对照组无明显差异(P >0.05)。结论 BDNF 参与了大鼠痛敏的过程。可能外源性B DNF 表达有利于受损神经修复。
关键词:BDNF;慢病毒;电针;神经病理痛;热辐射痛阈;大鼠
中图分类号:R741102文献标识码:A
Effects of Pain Threshold between Lentiviral Vector Mediated BDNF and Electroacupuncture on Neuropathic Pain Model for Rat H UANG Ai-p ing,XIE Lei,XUE Chun-chun,et al.(Municipal T C M Hospital Affiliated to Shanghai University o f Traditiona l Chinese Medicine,Shanghai200071,China)
Abstract:Objective To observe the different effects of heat emissi on pain threshold between lentiviral vector mediated BDNF and electroacupuncture on neuropathic pain model for rat,comparing gene and electroacupuncture analgesic effect,studying the poss-i ble mechanism of BDNF for pain treatment,as a result,it provided scientific experimental data for opening up new aeras of curving in-tractable neuropathic pain.M ethods In this study the neuropathic pai n of sciatic constriction injury CCI model for rat was adopted. Im munofluorescence labeling was used.Expression pattern of BDNF in the correspondent spinal cord was observed By inves tigating the lentivi ral vector mediated BDNF and electroacupuncture intervention changes of rats at several time points(3d、7d、21d).Mean-while,by B ME-410C thermal pain stimulation system the chan ges of different groups of thermal radiation paw withdrawal thermal laten-cy(PWTL)was measured before(0d)and at1d、3d、5d、7d、9d、14d、21d after operation.Results Changes of paw withdraw thermal latency for rat:There was no significan t difference for all groups of rats CCI paw withdraw thermal latency before operation. The paw withdraw thermal latency of simulated group for rats were almost the same.There was no significant difference between nega-tive group and control group.The treatment groups of paw withdraw thermal latency after the first day CCI operation ware lower than the si mulated control group(P<0.05).On the fifth day after operation,the model group and electro-acupuncture group of paw with-draw thermal latency rose,higher than control group and negati ve group(P<0.05).On the seventh day,the model group increased to the highest p oint.There was no significant difference between model group and electro-acupuncture group(P>0.05).On the9th day,14th day,21st day after operation the model group reduced,and on the7th day,9th day,14th day,the electro-acupuncture group was tending towards s tability.They were both higher than control group and negative group(P<0.05).On the9th day,14th day,there was significant difference between model group and electro-acupuncture group(P<0.05),but on the21th day the differ-encewas seldom(P>0.05).Immunohistochemistry:On the3th day,7th day,21th day,the difference for expression of posi tive neu-rons in the spinal cord of rat with L4/5part was seldom among control group,negenative group and si mulated group(P>0.05).Pos-i tive neurons of model group first rose and then reduced.On the7th day positive neurons rose significan tly compared to other groups (P<0.05).The posi tive neurons of electro-acupuncture group was up-regulated but compared to negenative group the difference was not significant(P>0.05).Conclusion BDNF contributed to the pain hypersentivity.Expression of probably exogenous BDNF is of great benefit to the repai r of nerve.
Key words:B DNF;lentiviral;electroacupuncture;neuropathic pain;heat emission pain threshold;rats
(Chin J Lab Diagn,2011,15:0960)
脑源性神经营养素(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)属于神经营养因子家族,近年来对于BDNF的深入研究表明无论内源性或是外源性BD-NF对于受损神经系统的神经元保护、修复均有作用而日益受到重视。本实验观察慢病毒载体介导的BDNF与电针对神经病理痛模型大鼠BDNF在相应节段脊神经根与脊髓内表达的变化及对热辐射痛阈的影响差别,比较基因与电针的镇痛疗效,探讨BD-NF在疼痛治疗中可能的作用机理,为治疗顽固性神经病理痛开辟新的领域提供科学的实验数据。
1资料与方法
1.1材料及分组由上海斯莱克动物中心提供雄性健康Sprague Dawley(SD)大鼠,体重250-300g,清洁喂养,参考Bennett等方法,在3%戊巴比妥钠1.6ml/kg腹腔注射麻醉下,俯卧位固定,无菌条件下于左股骨中部作纵向切口分离股二头肌暴露坐骨神经干,用4-0铬制羊肠线每间隔1m m轻度结扎4道,以神经外膜轻轻受压引起小腿肌肉轻度颤动为宜,逐层缝合,关闭创口。术毕每只大鼠肌注青霉素4万单位预防感染。术后第3天测试大鼠术侧后爪的热痛敏阈值,比造模前自身对照要低30%以上,自主行为表现术侧爪内收,轻度外翻及跛行,反应不敏捷等,则模型成功,有瘫痪及自噬行为则剔除。
模拟对照组(Sham组)12只大鼠暴露坐骨神经后于空气中暴露几分钟,不予结扎。造模成功大鼠48只随机分为4组,每组12只,分别为试验组、电针组、阴性对照组、空白对照组。所有大鼠于造模后4日在巴比妥钠麻醉下暴露左侧坐骨神经根部,用10 L l注射器,试验组注入含有BDNF基因的慢病毒10 L l;阴性对照组、空白对照组分别注入空载慢病毒、生理盐水10L l;电针组沿左侧坐骨神经选取针刺点:环跳(后肢髋关节后上缘,直刺7mm);后三里
(膝关节后外侧,在腓骨小头下约5mm 处,直刺7mm)。电针仪选择疏密波,电流1MA,频率F1:2HZ,30分/次,每日1次,6天1疗程,间隔一天,连续3个疗程。1.2 方法
将动物放入测试围栏中待其安静,将I.R.(红外)光源移到正对动物后爪下面,按控制器进行测试,当动物因感觉疼痛将后爪抬起后,记录显示器的时间,精确度为0.1秒,该时间即为热潜伏缩爪阈值(Paw withdrawal thermal latency,PWTL)。设定最长的照射时间为20s,如果20s 仍无缩爪反应记为20s;重复测量3次(间隔5分钟)取平均值为该时点该侧后爪的热痛敏阈值。分别于干预前、干预后1d 、3d 、5d 、7d 、9d 、14d 、21d 测定大鼠左侧后爪痛阈。为保持测定的齐同性,本研究对大鼠热辐射痛阈的测定时间固定在上午8:00-11:00。
分别于干预后3d 、7d 、21d 处死大鼠(每时点n =4),处死前37e 生理盐水快速灌注大鼠,直至体循环血液冲洗干净,肝脏变白,流出清凉的灌流液为
止。再换4e 4%多聚甲醛灌流固定,头2-3min 滴速稍快些150-180滴左右,以后速度放慢,约120滴左右,1h 内完成,至大鼠被固定。同时切取下腰段(L4-L5)脊髓(约1.5cm),并以4%多聚甲醛固定2h,30%蔗糖(pH7.4的0.01mol/L 磷酸盐缓冲液为溶剂)浸泡,4e 过夜。脊髓做连续冰冻横切,片厚20L m 。切片贴于涂有多聚赖氨酸的玻片上,自然晾干。免疫荧光实验按试剂盒说明书操作。每只大鼠随机取5张脊髓及坐骨神经根部免疫荧光切片在Nikon H600L 显微镜下观察并拍照(根据结合的不同荧光物质在不同的激光下观察),用Motic3.2图像分析系统测定BDNF 免疫阳性神经元光密度值。1.3 统计学分析
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析,所有资料
以均数加减标准差(x )
?s )表示,组间同时点比较采用单因素方差分析(ANO V A)。P <0.05认为有差别。2 结果
2.1 大鼠热潜伏缩爪阈值(PWTL)结果 见表1。
表1 各组大鼠CC I 后各时点(d)左后肢PWTL(x )
?s )(单位:s)
分组情况CCI 术前1天CCI 术后1天
术后3天术后5天术后7天术后9天术后14天术后21天空白对照组9.68?0.338.12?0.29w 7.40?0.17w 6.89?0.35w 6.16?0.39w 6.58?0.20w 6.75?0.24w 6.37?0.39w 模拟对照组9.34?0.439.73?0.369.76?0.329.75?0.219.85?0.239.59?0.289.48?0.929.40?0.99阴性对照组9.53?0.347.98?0.16w 7.47?0.13w 6.72?0.37w 6.11?0.18w 6.32?0.33w 6.63?0.31w 6.34?0.18w
电针组9.51?0.318.02?0.21w 7.35?0.28w 7.87?0.10w u 8.00?0.15w u 7.27?0.37w u
7.21?0.34w
u 6.98?0.40w u 试验组
9.52?0.35
7.97?0.19w
7.36?0.16w
7.78?0.26w u
7.89?0.13w u
7.76?0.24w u n 7.82?0.12w
u n
7.17?0.94w u
注:组内比较:与CCI 术前1天比较,w P <0.05;相同时间点组间比较:与模拟对照组比较,w P <0.05;与空白对照组比较u P <0.05;与试验组比较n P <0.05
2.2 BD NF 免疫荧光组化结果 空白对照组、阴性对照组及模拟对照组术后第3天、第7天、第21天时点大鼠L4/5段脊髓阳性神经元表达无明显变化(P >0.05),试验组三时点阳性神经元先增加后降
低,术后第7天最高,与其他组相比阳性神经元表达
明显升高(P <0.05),电针组阳性神经元有所增加,但与阴性对照组无明显差异(P >0.05)(见图1)
。
注:与空白对照组比较n P <0.05;与模拟对照组比较n P <0.05;与阴性对照组比较n P <0.05;与电针组比较n P <0.05
图1 各组大鼠术侧脊髓后角BDNF 光密度趋势图
3讨论
近年来将目的基因高效转染靶细胞并能长期稳定表达成为基因工程研究热点,以往的研究大多使用逆转录病毒和腺病毒作为载体,但各自都存在着种种缺陷,慢病毒载体能感染分裂期及非分裂期细胞;能使目的基因整合至靶细胞基因组从而实现长期表达;转移的基因片段容量大;可向同一细胞引入多种不同的基因,或对同一细胞反复感染;不易诱发宿主免疫反应。
BDNF是一个广谱的神经营养因子,能促进脊髓运动神经元存活、分化及功能的表达,也是一种重要的感觉和运动神经元营养因子,具有刺激诱导轴突再生,促进神经通路及抑制神经细胞凋亡等作用[1,2];BDNF通过调节突触可塑性改变在伤害性疼痛信息传递中发挥重要作用[3]。
我们的研究发现:坐骨神经结扎损伤的神经病理性疼痛大鼠CCI模型,慢病毒载体介导的B DNF 与电针干预后,BDNF在脊髓后角神经元与神经纤维中表达增加,并可明显抑制神经病理损伤诱导的痛阈。这些结果提示BDNF参与了神经病理性疼痛的过程。可能外源性BDNF表达有利于受损神经修复。近期有研究表明,在神经病理性疼痛中,B DNF 在脊髓后角小胶质细胞中表达明显增加[4],ATP通过其受体P2X4促进脊髓后角小胶质细胞内B DNF 的合成与释放增加,这个过程与小胶质细胞内P38-MAPK的活化等有关;BDNF从小胶质细胞内释放后作用于后角神经元,使NMDA受体的磷酸化增加,引起痛觉过敏[5,6]。已有研究证明电针能够促进NTFs的表达,维持周围神经和中枢神经的生长、存活及修复,促进脊髓损伤的修复[7,8]。王新家等[9]通过建立后路渐进性脊髓压迫大鼠模型进行电针治疗,并观察胆碱乙酰转移酶(ChAT)、BDNF及其受体TrkB的免疫组化检测结果,推测电针治疗大鼠慢性脊髓损伤的机制可能是通过增强B DNF的运输及ChAT的表达来实现的。BDNF合成不足是神经再生失败的重要因素之一,外源性BDNF的表达和电针的刺激均对增加BDNF的表达有重要意义,通过BDNF的调节能减缓神经病理性伤害。所以这些方法可能是促进神经再生的有效途径之一。
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(收稿日期:2010-06-09)
病毒载体概述
病毒载体概述 引言 基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗的核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。 用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件: 1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒; 2、介导外源基因的转移与表达; 3、对机体不致病。 然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系,人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。 第一节病毒载体产生的原理 病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期与分子生物学认识的基础之上。研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构与功能有充分的了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒的结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制的影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需的顺式作用元件。 各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量,即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。
基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。最简单的做法就是,将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb的lacZ基因表达盒 (CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒的UL44(糖蛋白C)基因的XbaI位点中,病毒基因组的其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需的,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样的方法,将AAV-2病毒的rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒的UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需的全部辅助功能的辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。 然而,这样的重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA的长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小的病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入的容量就十分小。因此,必须删除更多的病毒基因以腾出位置插入较大的外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA的容量,除了可以删除病毒的非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因的功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。 病毒载体大体上可分为两种类型: 重组型病毒载体:这类载体就是以完整的病毒基因组为改造对象。一般的步骤就是选择性地删除病毒的某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失的必需基因的功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需的顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统的重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)的腺病毒同源序列中,与辅助
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.wendangku.net/doc/1911464315.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.wendangku.net/doc/1911464315.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
病毒性肝炎的基因治疗
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/1911464315.html, 病毒性肝炎的基因治疗 作者：丁雯 来源：《健康必读（上旬刊）》2018年第03期 摘要：病毒性肝炎严重威胁人类健康。全球慢性病毒性肝炎患者众多，而现有的抗病毒治疗只在少数患者显现疗效。探索更为有效的治疗方法已成为迫切需要。基因治疗可以调节病变组织的生物学功能，因此成为一种强大且可塑性极强的治疗工具。越来越多的实验室和临床研究显示了基因治疗在病毒性肝炎治疗中的潜力。本文就近年来病毒性肝炎的基因治疗策略进行综述。 关键词：病毒性肝炎；基因治疗 中图分类号：R51 文献标识码：A 文章编号：1672-3783（2018）03-0134-01 病毒性肝炎是严重危害人类健康的常见传染病，慢性病毒性肝炎可导致肝硬化和肝癌等终末期肝病，部分患者可发生肝细胞大量坏死所导致的暴发性肝衰竭，病死率高达80%～90%。病毒性肝炎严重危害人类的生命健康，但目前尚缺乏十分理想的治疗方法。干扰素α仅对不到40%的慢性HBV感染者和20%～30%的慢性HCV感染者有效。 目前广义的基因治疗是指体细胞基因治疗，即将具有防治潜能的外源基因（目的基因）通过合适载体转移到患者的相关器官组织（靶组织）的细胞内，并获得适当表达，替代、修正、补偿缺陷基因的功能或封闭、抑制异常表达的基因，以达到防治或减轻疾病的目的。因此基因治疗的对象不再局限于单基因缺陷遗传病，还包括传染性疾病在内的多种类型的疾病。研究者对病毒性肝炎基因治疗的研究也取得了许多进展。 1 反义核酸与核酶 早期利用核酸作用于靶RNAs并使其降解的方法是通过DNA寡核苷酸与互补RNAs杂交，从而引起核糖核酸酶H介导的降解作用，也就是众所周知的“反义技术”。继而人们又发现了具有催化活性的RNA分子，即核酶。目前人们可以通过设计各种反义核酸或核酶来降解靶序列。 Nash等将针对HBV衣壳包装信号、X抗原和表面抗原mRNA的锤头状核酶和反义序列克隆于lenti病毒载体，并导入表达HBV的肝细胞中，整合载体持续表达超过4个月，以HBs mRNA为靶标的反义RNA可有效降低转录子的水平，针对X抗原和表面抗原mRNA的核酶 也可有效降低HBV mRNA水平。 通过导入反义核酸或核酶的长效表达载体并使其与宿主基因组整合，一定比例的肝细胞（及其子代细胞）就会被赋予抵抗病毒感染的特性。由于这部分细胞比那些已被病毒感染的细
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
非病毒基因载体
概述 定义 非病毒载体是利用非病毒的载体材料的物化性质来介导基因的转移。 特点 非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。 与病毒载体相比较，具有毒性低、免疫反应低，而且所携带的基因不整合至宿主细胞基因组等优点。 然而，非病毒载体的转导效率低，目的基因只能实现瞬间表达，其运送系统的颗粒较大，容易引发免疫反应和被机体所清除。 2常用材料 脂质体或脂类复合物 脂质体包括阳性、中性和阴性脂质体,其中阳性脂质体研究的最为广泛。自从1987年以来, 众多学者相继合成出许多阳离子脂质体。所有的阳离子脂质体的一端皆拥有1~2条由12~ 18个碳原子组成的疏水链, 使其在水性介质中形成双层结构, 并包裹DNA;另一端为亲水性的N+, 通过静电力与DNA结合以形成脂质复合物。 脂质体或脂质复合物经静脉注射后,很快被血浆清除并在肺组织中积蓄, 蛋白质主要在肺内皮细胞中表达，通常表达时间较短,一般在给药后4~ 24h即达峰, 1周后消失。因此,阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。脂质体或脂质复合物也可直接应用于病变部位以避免静脉给药选择性差的缺点。 目前虽然在阳离子脂质体构效关系研究的基础上,合成了一些新的脂质载体, 但离理想的脂质载体还相距较远,其主要困难在于体内外转染条件的差别, 而且转染效果还取决于给药途径。因此, 只有根据实际的临床应用来个性化设计才能获得较为理想的载体, 这无疑给载体的开发带来困难。脂质体或脂质复合物并没有长期安全性报道。 阳离子多聚物 1、多聚赖氨酸：聚L-赖氨酸和去唾液酸糖蛋白连接的聚合物用于细胞的基因靶向转移, 其基因转染效果较阳离子脂质体差。有研究表明，在有或无靶向配体的情况下，多聚赖氨酸与DNA的聚合物的细胞摄取率和基因转染率都依赖于聚合复合物正电性的存在。 2、聚乙烯亚胺( polyethylenimine, PEI) ：PEI阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物。这种复合物的超分子结构可以描述为一种核-壳结构, 疏水核是部分中和的DNA,外壳则是亲水的阳离子聚合物链段。这种核-壳结构,增加了体系在血液循环中的稳定性, 保护DNA在传递过程中不受DNA酶或巨噬细胞的降解。PEI阳离子聚合物由于其自身具有缓冲容量, 在不需要加入吞噬细胞或溶酶体溶解剂的情况下就显示出较好的基因转染效果。 3、树突状聚合物：树突状聚合物系一定Mr 范围的聚酰胺和含磷树状聚合物的末端氨基通过静电力与DNA结合形成的一种阳离子多聚物非病毒基因载体，聚酰胺树状聚合物的酰胺键在水或乙醇中的水解,可使基因转染率增加50倍, 其原因可能是水解增加了聚合物的柔韧性。故一些可水解的聚酰胺树状聚合物对体内颈动脉的基因转染比支链PEI更有效。 壳聚糖载体聚合物 壳聚糖作为一种天然阳离子聚合物,通过与DNA以静电方式作用使壳聚糖-DNA体系不被降解, 完全进入细胞。作为基因载体, 壳聚糖具有细胞毒性低、生物相容性好、基因免疫性低和转染效率较高等特点。 壳聚糖-DNA复合物按制备方法主要分壳聚糖及其衍生物的DNA复合物、壳聚糖-DNA纳
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用
慢病毒载体的构建及其在基因治疗方面的应用 摘要：慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。经改造的慢病毒作为外源基因载体，具有其独特的特点和优势。基因治疗成功的关键是选择合适的载体系统，慢病毒载体作为一种特殊的逆转录病毒载体，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、转移基因片段容量较大、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗载体研究的热点。近年来对其基础生物学特性、载体改造及其应用等研究均取得了较大进展，笔者对慢病毒载体的构建以及其在人类疾病基因治疗方面的应用做简单的介绍。 关键词：慢病毒载体；载体构建；基因治疗 基因治疗是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。其关键问题之一是如何将目的基因导入靶细胞，得到稳定、高效表达。理想的基因载体应具备：靶向特异性；高度稳定、易制备、可浓缩和纯化；无毒性；有利于基因高效转移和长期表达；容量大，易人工合成，缺乏自动复制载体自身的能力［１］。由于病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚、易于改造和操作、感染效率高、有较高靶细胞特异性，这些都是其他载体系统无法比拟的，而慢病毒载体由于其对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力且转染效率高、靶向性好和持久性表达等特点，病毒载体系统就显得格外引人注目。 1 慢病毒及其载体的简介 慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒。慢病毒除了具有一般逆转录病毒gag、pol和env3个基本结构基因外，还包含4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu 和2个调节基因tat和rev［２］。慢病毒载体（Lentiviral vector，LV）作为外源基因载体，其产生均包括一个遗传割裂基因表达的设计。病毒元件要符合以下条件：①慢病毒组装辅助蛋白至少含有gag-pol基因；②慢病毒转基因载体RNA 包括转基因表达盒；③异质糖蛋白。目前使用不同种属来源的慢病毒载体，包括来源于人类（HIV-1和HIV-2）以及猿猴（SIV）、猫（FIV）等其它物种［３］。 2 病毒载体的构建 由于慢病毒的一些自身因素，我们需对其进行以下的一些改建，使其可以更好地为疾病治疗和科研工作服务。 2.1 最小辅助包装元件 为了减少病毒序列的数量从而减少同源重组的风险，去除了组装慢病毒载体结构中不同辅助元件或用其它的特异序列来代替。其中包括原位癌激活基因序列的调整。另外，去掉附加或调节基因与gag-pol基因一样，已在一些慢病毒载体
基因治疗
基因治疗 【摘要】研究发现，以基因为基础，从疾病和健康的角度考虑，人类疾病大多直接或间接地与基因相关，故有“基因病”概念产生。根据这一概念，人类疾病大致可分为三类：单基因病、多基因病和获得性基因病。随着现代生物科学的发展，基因工程已在多个领域得到广泛应用。基因治疗是利用基因工程技术向有功能缺陷的人体细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其疾病缺陷，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，已经在肿瘤、感染性疾病、心血管疾病和艾滋病等疾病的治疗方面取得进展。它在一定程度上改变了人类疾病治疗的历史进程，被称为人类医疗史上的第四次革命。本文就基因治疗的载体以及基因治疗在肿瘤、艾滋病治疗方面取得的成就作出介绍，并就基因治疗的现状和问题对基因治疗的未来作出展望。 【关键词】基因治疗、载体、肿瘤、p53、IAP、艾滋病、CCR5 【正文】 一、基因治疗背景及概念 1990年9月，美国政府批准实施世界上第一例基因治疗临床方案，对一名患有重度联合免疫缺陷症（SCID）的女童进行基因治疗并获得成功，从而开创了医学的新纪元。自此以来，基因治疗已从单基因疾病扩大到多基因疾病，从遗传性疾病扩大到获得性疾病，给人类的医疗事业带来革命性变革。 基因治疗（gene therapy）是指通过一定的方式，将正常的功能基因或有治疗作用的DNA 序列导入人体靶细胞去纠正基因突变或表达失误产生的基因功能缺陷，从而达到治疗或缓和人类遗传性疾病的目的，它是治疗分子疾病最有效的手段之一。 基因治疗包括体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。但由于用生殖细胞进行治疗会产生伦理道德问题，因此通常采用体细胞作为靶细胞。其基本内容包括基因诊断、基因分离、载体构建和基因转移四项。根据功能及作用方式，用于基因治疗的基因可分为三大类：（1）正常基因：可通过同源重组方式置换病变基因或依靠其表达产物弥补病变基因的功能，常用于矫正各种基因缺陷型的遗传病；（2）反义基因：通过其与病毒激活因子编码基因互补，或与肿瘤mRNA互补，从而阻断其表达，常用于治疗病毒感染或肿瘤疾病；（3）自杀基因：能将无毒的细胞代谢产物转变为有毒的化合物，用于治疗癌症。 二、基因治疗载体
人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则
人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则 一、引言 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的医学治疗。目前仅限于体细胞。 基因治疗的技术和方式日趋多样性。按基因导入的形式，分为体外基因导入（exvivo）及体内基因导入（invivo）两种形式。前者是在体外将基因导入人细胞，然后将该细胞注入人体。其制品形式是外源基因转化的细胞，适合在具有专门技术人才和GMP条件的医疗单位进行。后者则是将基因通过适当的导入系统直接导入人体，包括病毒的与非病毒的方法。其制品形式是基因工程技术改造的病毒或者是重组DNA、或者是DNA复（混）合物。基因治疗制剂种类较多，因此，本指导原则不可能用一个模式来概括，只能提出一个共同的原则，具体的方案应根据这些原则，确定研究技术路线。其基本原则：一是必须确保安全与有效，要充分估计可能遇到的风险，并提出相应的质控要求；二是要促进基因治疗的研究，并加强创新。对一些新的治疗技术路线的相应质控要求，可有一定的灵活性，应注意到基因治疗本身的特点以及它与经典的化学合成药物或基因工程药物的差别。目前，一些基因治疗研究相对比较成熟，而一些则不够完善，更加要求研究者在使用该技术指导原则时不可生搬硬套。为此，研究者应加强咨询和论证，提出一个科学可行的研究方案，最终获得确保安全有效的基因治疗制品。 在向国家药品监督管理局申报临床试验时，除须按本指导原则中"研究内容和制品质量控制"准备材料外，同时需提供下述材料： （1）国内外研究现状和进展（综述）。包括： 1．所用基因的研究现状和进展； 2．所用载体的研究现状和进展； 3．所用基因导入系统和方法的研究现状和进展； 4．该研究或制品相关的体外有效性实验资料； 5．该研究或制品相关的动物试验安全性和有效性资料； 6．该研究或制品相关的临床试验安全性和有效性资料； 7．该研究或制品的生产工艺现状； 8．该研究或制品的质量控制现状；
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
慢病毒系统简介及应用
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选；
用于基因治疗的慢病毒载体(一)
用于基因治疗的慢病毒载体(一) 基因治疗有望成为治疗遗传病、肿瘤、病毒感染及其它难治性疾病的有效手段，但目前基因转移方法的局限性成为实现这一希望的最大障碍。非病毒学的基因转移方法效率较低；已用于人体试验的基因治疗方案绝大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录病毒载体和腺病毒载体最为成熟。常用的逆转录病毒载体从小鼠白血病病毒(MLV)改造而来，虽可使目的基因整合至靶细胞基因组、实现稳定表达，但只能转导分裂细胞，目前主要用于基因治疗的离体方案；腺病毒载体既能转导分裂细胞，亦可转导静止细胞，转导效率也较高，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身某些抗原的表达可引起人体免疫反应，阻止其重复转导；其它一些病毒载体如腺相关病毒(AAV)载体、单纯疱疹病毒(HSV)载体亦因各种原因不能令人满意。 理想的病毒载体能同时提供高效的基因转移、长期稳定的基因表达及生物安全性。近来，一些研究者把目光投向了以Ⅰ型为人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒。研究表明〔1-5〕，以HIV-1为基础构建的这类慢病毒载体具有可感染非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达、免疫反应小等优点，适于体内基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。本文即对该类载体的研究进展做一简介。 1HIV-1基因组的基本结构〔6〕 HIV-1DNA前病毒的主要结构基因及其排列形式与其它逆转录病毒相同，均为5＇LTR-gag-pro-pol-env-3＇LTR。其中gag基因编码病毒的核心蛋白，pol基因编码病毒复制所需的酶类，env基因编码病毒的包膜糖蛋白，pro基因则编码切割蛋白前体所需的蛋白酶。与其它逆转录病毒不同的是，HIV-1基因组尚有较多调节基因，其中属于HIV-1基因复制所必需的tat基因和rev基因，分别编码两个反式激活因子Tat蛋白和Rev蛋白，前者在HIV-1基因组复制和转录延伸过程中发挥重要作用，后者则可促使HIV-1基因的表达由早期向晚期转化。非HIV-1复制所必需的调节基因有nef、vif、vpr和vpu。这些基因的编码产物都有各自的功能，有些尚未完全阐明，在此不一一赘述。 2构建HIV-1载体系统的基本原理〔7〕 HIV-1载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5＇LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3＇LTR换成SV40polyA等。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。图1所示为Trono等建立的HIV-1载体系统中的一种〔1〕。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 3HIV-1载体系统的改进 近年来，已有多个实验室建立了复制缺陷的HIV-1载体系统，用于不同目的的研究，如分析病毒的感染力〔8〕、筛选抗病毒药物〔9〕、评价Env糖蛋白的不同区域在介导病毒进入细胞中的作用〔10〕等。而目前对于以基因治疗为目的的HIV-1载体系统，研究的焦点集中在如何扩大其嗜性范围、确保其安全性及提供其滴度和转导能力上。1996年以来，Trono领导的课题组发表了一系列令人鼓舞的研究结果〔1～3〕，主要包括以下几方面的改进。 3.1包膜蛋白 最初的HIV-1载体颗粒，均由其本身的包膜蛋白Env所包裹，仅对CD4+的细胞具有亲嗜性。1996年，Trono课题组的Naldini等〔1〕设计的HIV-1载体系统(见图1)采用表达水疱性口炎
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】