反转录试剂盒TAKARA 6210A操作步骤

Code No. 6210A 研究用

PrimeScript? II 1st Strand

cDNA Synthesis Kit

说明书

目录

内容页码

●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 1 ●1st-strand cDNA合成反应 2 ●RT-PCR反应 2 ●RNA样品的制备 3 ●相关产品 3

●制品说明

本制品是使用PrimeScript II RTase从Total RNA或Poly (A)＋ mRNA合成1st Strand cDNA的试剂盒。含有1st Strand cDNA合成所需的全部试剂。

以结构复杂的RNA或长链RNA为模板进行cDNA合成时，cDNA合成受到抑制的主要原因是RNA高级结构与反转录酶的非特异性结合。并且，由于反转录酶的错配引起的非特异性延伸，对RT-PCR或全长cDNA的合成极为不利。PrimeScript II RTase是对PrimeScript RTase进行进一步改良的反转录酶，本反转录酶可以极大限度地抑制RNA高级结构与反转录酶的非特异性结合。

本制品使用了PrimeScript II RTase，利用Oligo dT从PolyA开始进行延伸反应，使用标准反转录温度42℃，不仅能维持PrimeScript RTase原有的卓越的cDNA合成效率和cDNA合成速度，同时可以合成本底低、纯度高、完整性好的cDNA。另外，反转录反应液配制时所产生的非特异性延伸是抑制cDNA合成的主要原因，本制品能有效控制这一现象。反应液配制后，冰上放置直至反转录反应开始，不会发生抑制cDNA合成的现象。

合成的1st Strand cDNA可广泛应用于2nd Strand cDNA合成、杂交、PCR法扩增等。特别适用于全长cDNA文库制作、高纯度全长cDNA合成等。

●制品内容(50次量)

PrimeScript II RTase (200 U/μl) 50 μl

5×PrimeScript II Buffer 200 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) 25 μl dNTP Mixture (10 mM each) 50 μl Oligo dT Primer (50 μM) 50 μl Random 6 mers (50 μM) 100 μl RNase free dH2O 1 ml

【各种引物序列】

* 该序列与RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (Code No. RR019A)中的Oligo dT Adaptor Primer

不同，不含有与M13 Primer M4匹配的序列。

【本Kit以外需准备的主要试剂及仪器】

1. 水浴锅

可用DNA扩增仪代替。

TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient/Standard (Code No. TP600/TP650)。

2. 电泳用凝胶

Agarose L03 (Code No. 5003), NuSieve? 3: 1 Agarose (Lonza), etc.

3. 电泳仪

4. 微量离心机

5. 微量移液器和枪头(高压灭菌)

●保存：-20℃。

●1st-Strand cDNA合成反应

1. 在Microtube中配制下列反应混合液。

2. 65℃保温5 min后，冰上迅速冷却。

(注：上述处理可使模板RNA变性，提高反转录效率。)

3. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20 μl。

4. 缓慢混匀。

5. 按下列条件进行反转录反应：

(30℃10 min) (使用Random 6 mers时)

42℃(～50℃)*2 30～60 min

6. 95℃5 min*3 (酶失活)后，冰上冷却。

*1：2 kb以下的cDNA合成时，Random 6 mers的使用量为1～2 μl；2 kb以上的cDNA合成时，Random

6 mers的使用量为0.4～1 μl。也可使用Gene Specific Primer，此时，其在反应体系中的终浓度为

0.1 μM。

*2：PrimeScript II RTase对具有复杂二级结构的模板同样具有良好的延伸性能，通常可在42℃下进行反应。使用特异性下游引物进行反转录时，有时会因错配而产生非特异性扩增。此时可将反转录温度升到45～50℃，可能会减少非特异性扩增。

*3：进行长片段cDNA扩增时，为了避免1st cDNA链的破损，请进行70℃、15 min的失活反应。

●RT-PCR反应

1st Strand cDNA合成反应液，可直接作为PCR反应的模板使用，其加入量为PCR反应液量的1/10以下。模板加入量会对PCR的扩增效率有影响，建议参照PCR酶的说明书，进行最适模板量的研讨。

在RT-PCR反应中，产生非特异性扩增或无扩增产物时，将cDNA合成反应液用RNase H处理可改善PCR扩增结果。

【推荐使用的PCR酶】

高扩增效率：TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Ex Taq HS

长链DNA扩增：TaKaRa LA Taq、TaKaRa LA Taq HS

高保真PCR扩增：PrimeSTAR Max DNA Polymerase

● RNA 样品制备

RNA 的纯度会影响cDNA 的合成量，而制备RNA 的关键是要抑制细胞中的RNA 分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA 分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA 分解酶的污染。 【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列(1)或者(2)方法进行处理。 (1)干热灭菌 (180℃，60 min)

(2)用0.1% DEPC (焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC 。

RNA 实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 【试剂配制】

用于RNA 实验的试剂，需使用干热灭菌 (180℃，60 min)或用上述方法进行DEPC 水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水需用0.1%的DEPC 处理后进行高温高压灭菌。 RNA 实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 【制备方法】

建议使用GTC 法 (异硫氰酸胍法)制备的高纯度RNA 。RNA 提取试剂盒如RNAiso Plus (Code No. 9108/9109)也可以用于分离高纯度RNA 。纯化的RNA 样本应溶解于灭菌蒸馏水或TE buffer 中。

● 相关产品

【相关试剂盒】

高效率、高灵敏度、长链扩增的2 Step RT-PCR 试剂盒： PrimeScript? RT-PCR Kit (Code No. RR014A/B) 高灵敏度的长链One Step RT-PCR 试剂盒：

PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Code No. RR055A/B) 【相关PCR 酶】 高效的PCR 酶：

TaKaRa Ex Taq ? (Code No. RR001A/B) TaKaRa Ex Taq ? HS (Code No. RR006A/B) 长链DNA 扩增酶：

TaKaRa LA Taq ? (Code No. RR002A/B)

TaKaRa LA Taq ? Hot Start Version (Code No. RR042A/B) PrimeSTAR ? GXL DNA Polymerase (Code No. R050A/B) 高保真酶：

PrimeSTAR ? Max DNA Polymerase (Code No. R045A)

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