青霉素高产菌株的理性筛选

遗传育种与生物合成

文章编号:1001-8689(2007)07-0403-02

青霉素高产菌株的理性筛选

娄忻　张莉　刘靓　张玉莲　陈丽华　刘静　贺建功

(华北制药集团新药研究开发有限责任公司　微生物药物国家工程研究中心,　石家庄050015)

摘要:　以青霉素生产菌种87117#为出发菌种,采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法,结合限氧条件下的摇瓶筛选,从177支前体抗性株中筛出XY -137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定,单位菌丝产物合成能力强。XY -137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证,其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。

关键词:　紫外诱变;　动态后处理;　理性筛选;　青霉素高产菌株中图分类号:T Q 465.1 文献标识码:A

Rational screening of penicillin high producing strain

Lo u Xin,　Zhang Li,　Liu Liang,　Zhang Yu-lian,　Chen Li-hua,　Liu Jing and H e Jian-g ong

(N ew Dr ug R&D Co.,L td of N or th China Phar macentical Co rp.,

N ational Eng ineering Resear ch Center of M icro bial M edicine ,　Shijiazhuang 050015)

ABSTRACT U sing Penicillium chry sogenum #87117as starting strain ,a penicillin high yield str ain #XY-137w as obtained by U V irr adiation com bined w ith precurso r-resistant strain in shake flask selection metho d under lim ited o xyg en.Penicillin potency of strain #XY-137w as increased by 8.8%cultured in shaking flasks.Average pr oductivity o f about 100batches ferm entation level w as increased by 2.69%～5.66%than that of strain #87117in 100-ton ferm entor .

KEY WORDS U V m utagenesis;　Dynamic po st-treatment;　Rational screening ;　Penicillin high-pr oducing strain

收稿日期:2007-03-15 修回日期:2007-05-08

作者简介:娄忻,女,生于1963年,高级工程师。主要从事微生物药物产生菌的遗传育种研究。

由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛,世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平,降低生产成本以增强企业的竞争力,而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。

随着青霉素菌种生产能力的提高,传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理,根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计筛选方法,定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念,参照现有生产条件设立基本筛选模型,采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构,再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选,达到选育高产菌株的目的。1　材料与方法1.1　出发菌种

　青霉素生产菌种P enicillium chry sogenum 87117#。

1.2　培养基

(1)分离及斜面培养基　蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl 、CaSO 4、微量元素、琼脂。(2)种子培养基　以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。

(3)发酵培养基　以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源,加无机盐类组成。1.3　菌种诱变与筛选

(1)紫外诱变　将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm 处照射90s 。

(2)前体动态后处理　定量吸取经过紫外线照射后的孢子液,分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中,使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h 左右,然后稀释分离在固体培养基平板上。

(3)前体抗性菌落检出　平板置25℃恒温培养

?

403?中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期

8d 。从耐受不同浓度前体处理后长出的抗性菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养,以备摇瓶筛选。

(4)摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株　将摇瓶机转速由通常的220r /m in 降至160r /m in ,在低通气条件下进行摇瓶筛选。后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。

摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量(packed m ycelial v olume ,pm v )。1.4　样品检测

发酵液倒入刻度离心管中,3000r/min 离心10m in 。取上清液,用美国OI 公司Flow Solution Ⅳ化学自动分析仪检测其中的青霉素效价(u/m l)。沉淀部分所占体积与发酵液体积的比值即为pmv (%)。2　结果

2.1　XY -137#高产突变株的选育

出发菌株87117#先经过两次自然选育,然后采用紫外线复合前体动态后处理,挑取177支抗性株,在限氧条件下进行摇瓶筛选。于3.84%前体耐受浓度下获得XY -137#高产突变株,以87117#为对照,其5d 和7d 摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%,摇瓶效价平均提高了8.8%。

2.2　XY -137#菌株特性考察

(1)菌种纯度　XY-137#菌株自然分离后正常型菌落达96.3%,符合上生产罐的要求。

(2)斜面周期　XY -137#与出发菌株相比其斜面外观有所改变,孢子长势较弱,颜色明显变浅。若仍按原周期培养斜面,则种子瓶的培养时间需延长4～6h 。经过试验比较,将斜面培养周期推后1d,种子瓶生长正常,且摇瓶前期发酵效价略有提高。

(3)单位菌丝产物合成能力　由图1可知,与出发菌种相比XY-137#菌株的摇瓶效价有显著提高,而菌丝量较低,说明XY-137#菌株单位菌丝产量明显优于87117#

对照菌种。

1:87117#

相对效价;　2:XY -137#相对效价;

3:87117#菌丝生长量;　4:XY-137#菌丝生长量

图1 XY -137#与87117#菌种摇瓶相对效价和菌丝量比较

(4)稳定性试验　XY -137#菌株经斜面传代后进行摇瓶考察,F 1～F 4代相对效价依次为100%、98.9%、101.1%和99.7%,证明其稳定性良好。2.3　XY -137#菌株摇瓶工艺优化

(1)培养基改良　进行了多轮均匀设计试验。种子瓶经回归分析得到的最优配方中,减少了质量不易控制的玉米浆加量,增加适量的无机氮源,碳源比例也稍做了增加,优化后种子瓶的菌浓明显增大,发酵效价提高了7.5%。

发酵培养基则基于大罐的用料和配比,尝试添加适量固形有机氮源来稳定摇瓶效价。经摇瓶发酵试验,在多种有机氮源中最终选择加入少量的麸质粉,摇瓶效价提高了6%左右。

(2)增加前体补入量　考虑到XY-137#系耐前体突变株,故欲增加前体补入量,以满足高产菌株的需要。结果显示将前体浓度调高3%,补入体积不变,XY-137#菌株摇瓶效价提高了9.4%(表1)。

表1

前体增量试验结果

前体浓度　pH 菌丝生长量(%)

相对效价(%)

对照+3%

7.0233109.4对照

6.95

32

100.0

2.4　XY -137#菌株生产试验

XY-137#菌株在100m 3

罐中考察其生产能力及对原材料和工艺条件的适应性。经统计,该菌株放罐95批,在发酵周期短4h 、主要原材料消耗没有增加的情况下,XY-137#菌株的放罐效价、发酵指数、罐批产量比同期87117#菌株分别提高了3.83%、5.66%和2.69%。

上罐试验同时还证实XY-137#菌株不仅具备高产能力,而且发酵液粘度比87117#有所降低,可以减少动力消耗。3　讨论

对于青霉素这样产量已达较高水平的老品种,其产生菌久经人工选育,不论在遗传背景或生理特性方面都发生了复杂的变化。因此在做进一步诱变育种时,不但要考虑诱变剂的选择,更重要的是对筛选方法作合理的设计,使变异株产量的提高和主要性状的改变能明显地表达出来。有报道根据青霉素的生物合成途径在固体培养基上加入缬氨酸、6-氨基青霉烷酸、苯乙

酸等底物进行抗性筛选[1,2]

;或采用原生质体融合技术,使两株营养缺陷型菌株融合,筛选融合子[3]均取得了一定的效果。

(下转第446页)

?

404?青霉素高产菌株的理性筛选　娄忻等

种葡萄球菌菌群以凝固酶阴性葡萄球菌在门诊感染方面占有较大的分量。本文头孢硫脒对138株各种葡萄球菌的敏感率为99.3%,仅次于万古霉素,其抗菌活性明显优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、米诺环素、左氧氟沙星、红霉素。说明头孢硫脒对葡萄球菌有优异的抗菌活性。

耐甲氧西林葡萄球菌是近年来基层门诊、社区医院的重要病原菌,几乎所有的临床标本中都能检出。本医院门诊检测了138株各种葡萄球菌菌群,M RS的总检出率为50.7%,与梅亚宁等报道的56%[3]相同,其中凝固酶阴性葡萄球菌在M RS中所占比例最大,达到95.7%,而其中又有表葡菌所占的比例最大(32.86%),这与国内同期文献[4]报告基本相同,应该引起临床医生的足够重视,一定要重视检查,根据检查结果合理、规范使用抗菌药物,预防和减少耐药菌株的产生。

糖肽类抗生素仍然是目前临床上公认的治疗M RS感染首选抗生素[5],且疗效甚佳,几乎没有耐药菌株产生。本医院门诊检测了头孢硫脒对M RSA和M RCNS的敏感率分别为100%和98.5%,仅次于万古霉素,对M RSA的抗菌活性优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、红霉素等,对M RCNS的抗菌活性明显优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、米诺环素、左氧氟沙星和红霉素。因此,头孢硫脒对M RSA和M RCNS的作用仅次于万古霉素,与杜梅等的报道相符[6]。

头孢硫脒是我国自行研制并首先用于临床的头孢菌素,为半合成头孢菌素类抗生素,属第一代头孢菌素,它主要作用于细菌的中膈细胞壁,抗菌谱广,抗菌作用强,是强杀菌药,适用于对该药敏感的革兰阳性球菌和部分革兰阴性杆菌所引起的呼吸道感染、创伤及外科感染、皮肤及软组织感染、尿路感染、耳鼻喉感染、心内膜炎和败血症等,尤其适用于金葡菌、表葡菌、链球菌和肠球菌等革兰阳性球菌所引起的各种中、重度感染的治疗[7]。本次检测显示头孢硫脒对M RSA和M RCNS有一定的抗菌活性,虽不如万古霉素,但明显优于苯唑西林、头孢唑林、头孢曲松、克林霉素、红霉素等,建议用头孢硫脒治疗革兰阳性球菌(包括M RSA 和M RCNS)引起的各种感染。

参考文献

[1]马越,李景云,张新妹,等.2002年临床常见细菌耐药性监

测[J].中华检验医学杂志,2004,27(1):38

[2]万向农,胡建华,毛文义,等.284株凝固酶阴性葡萄球菌

替巧拉宁药敏试验分析[J].江西医学检验,2006,24(4): 325

[3]刘培跃.慢性前列腺炎表皮葡萄球菌感染耐药性研究[J].

江西医学检验,2003,21(1):53

[4]梅亚宁,戎国栋,陈友华.革兰氏阳性球菌对替巧拉宁的耐

药性分析[J].临床检验杂志,2003,21(5):319

[5]张秀珍,陈东科,胡云建,等.国产利福霉素对耐甲氧西林

葡萄球菌及其它致病菌抗菌活性研究[J].中华医院感染杂志,2001,11(1):18

[6]杜梅,马新秀,王莉敏.69株革兰阳性球菌对抗菌药物的

体外敏感度测定[J].医药导报,2005,24(11):1067

[7]王文梅.我国自行研制的头孢菌素——头孢硫脒[J].世界

临床药物,2003,24(3):179

(上接第404页)

前体对青霉素产生菌有毒性,能抑制其孢子发芽和菌丝的分支[4]。筛选以前体为标记的耐前体高产突变株,不仅可以解除毒性,而且使前体直接掺入抗生素的生物合成而提高产量[5]。由于动态后处理有富集正变株的作用[6],故可以增加高产株的筛出几率。

确定筛选条件决定着菌种选育的方向。特别是生产菌种,定向筛选的目标皆应来自大生产的需要。在发酵工业中,降低氧耗、降低动力消耗对生产成本的降低有着重要意义。本试验在低通气条件下筛选菌丝量较少的高产菌株,使选育到的菌株更具实际应用价值。

生产实践证明,XY-137#高产菌株特性达到理性筛选设计要求。

参考文献

[1]赵作祺,孙萍,曹冬莲,等.青霉素高产菌株的推理选育

[J].中国医药工业杂志,1999,30(10):437

[2]韩斌,韩峰,董艳峰.青霉素高产菌种的推理选育[J].中国

抗生素杂志,2004,29(7):433

[3]翁艳军,赵作祺,徐建国,等.青霉素产生菌的原生质体融

合[J].中国抗生素杂志,2003,28(3):129

[4]刘颐屏.抗生素菌种选育的理论和技术[M].北京:中国医

药科技出版社,1992:52

[5]施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学(第二版)[M].福州:

福建科学技术出版社,2003:245

[6]胡立勇,宋有礼,童村.杆菌肽产生菌的推理选育[J].中国

抗生素杂志,1988,13(6):395

?

446

?中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期

实验一腐乳产蛋白酶菌株的筛选1

实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取

湖南省湘潭市2019届高三二模考试理综生物试题(答案+解析)

湖南省湘潭市2019届高三二模考试理综 一、单选题 1.下列有关细胞及其结构的叙述，正确的是 A. 菠菜根尖细胞的增殖需要中心体的参与 B. 没有光合色素的细胞不可能将无机物合成有机物 C. 溶酶体内合成的水解酶可用于分解衰老的细胞器 D. 哺乳动物成熟红细胞中的血红蛋白是由核糖体合成的 【答案】D 【解析】 【分析】 1、硝化细菌属于原核生物，其能通过化能合成作用合成有机物，属于自养型生物； 2、蓝藻属于原核生物，其能通过光合作用合成有机物，属于自养型生物。 3、绝大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA，所以说酶合成的场所多数在核糖体上，少数在细胞核、线粒体和叶绿体中。 【详解】菠菜根尖细胞属于高等植物细胞，无中心体，故其增殖不需要中心体的参与，A错误；没有光合色素的细胞也可能将无机物合成有机物，如硝化细菌可以进行化能合成作用，B错误；溶酶体不能合成水解酶，水解酶在核糖体上合成，C错误；哺乳动物成熟红细胞中的血红蛋白，是在红细胞未成熟的时候，在其核糖体合成的，D正确；故选D。 2.下列叙述正确的是（） A. 酶降低活化能是指降低了分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需的能量 B. 无氧呼吸的两个阶段都释放出能量 C. 真核细胞中基因的遗传一定遵循孟德尔遗传规律，原核细胞中的一定不遵循 D. 细胞中有氧呼吸的第二阶段，丙酮酸和水在线粒体基质中彻底分解成CO2和[H] 【答案】A 【解析】 【分析】 真核细胞有氧呼吸分为三个阶段（各阶段均需酶催化）： 第一阶段：细胞质的基质：C6H12O6→2C3H4O3(丙酮酸)+4[H]+少量能量(2A TP)；

第二阶段：线粒体基质：2C3H4O3(丙酮酸)+6H2O→20[H]+6CO2+少量能量(2ATP)； 第三阶段：线粒体的内膜：24[H]+6O2→12H2O+大量能量(34A TP)。 【详解】A、酶降低活化能是指降低了分子从常态转变为容易发生化学反应的活跃状态所需的能量，A正确； B、无氧呼吸只在第一阶段释放能量，B错误； C、进行有性生殖的真核细胞中的核基因遵循孟德尔的遗传规律，原核细胞中的一定不遵循，C错误； D、真核细胞中有氧呼吸的第二阶段，丙酮酸和水在线粒体基质中彻底分解成CO2和[H]，D 错误。 故选：A。 【点睛】识记酶的作用原理、细胞呼吸等相关知识，根据题干情境准确作答。 3.下列关于细胞的物质跨膜运输的叙述，正确的是 A. 动作电位产生时，神经细胞才进行Na+、K+的跨膜运输 B. 酵母菌无氧呼吸的终产物是通过自由扩散的方式运出细胞的 C. 细胞通过主动运输方式吸收物质的速率与细胞呼吸强度始终呈正相关 D. 浆细胞合成、分泌抗体的过程依靠膜的流动性即可完成，不消耗能量 【答案】B 【解析】 【分析】 考查物质的跨膜运输： 小分子： 此外，大分子物质跨膜运输的方式是胞吞或胞吐。

1---从杂交育种到基因工程历年高考题

1---从杂交育种到基因工程历年高考题 2013年 1.（2013全国卷大纲版）下列实践活动包含基因工程技术的是 A.水稻F1花药经培养和染色体加倍，获得基因型纯合新品种 B.抗虫小麦与矮秆小麦杂交，通过基因重组获得抗虫矮秆小麦 C.将含抗病基因的重组DNA导入玉米细胞，经组织培养获得抗病植株 D.用射线照射大豆使其基因结构发生改变，获得种子性状发生变异的大豆 2.（2013上海卷）25．研究者从冰川土样中分离获得了具有较高脂肪酶活性的青霉菌菌株，为了在此基础上获得脂肪酶活性更高的菌株，最可行的做法是 A．用紫外线照射青霉菌菌株，再进行筛选B．将青霉菌菌株与能高效水解蛋白质的菌株混合培养，再进行筛选 C．将能高效水解蛋白质的菌株的基因导入青霉菌菌株，再进行筛选 D．设置培养基中各种营养成分的浓度梯度，对青霉菌菌株分别培养，再进行筛选 3.（2013浙江卷）32．（18分）在玉米中，控制某种除草剂抗性（简称抗性，T）与除草剂敏感（简称非抗，t），非糯性（G）与糯性（g）的基因分别位于两对同源染色体上。有人以纯合的非抗非糯性玉米（甲）为材料，经过EMS诱变处理获得抗性非糯性个体（乙）；甲的花粉经EMS诱变处理并培养等，获得可育的非抗糯性个体（丙）。 请回答：（1）获得丙的过程中，运用了诱变育种和________育种技术。 （2）若要培育抗性糯性的新品种，采用乙与丙杂交，F1只出现抗性非糯性和非抗非糯性的个体；从F1中选择表现为____的个体自交，F2中有抗性糯性个体，其比例是_____。 （3）采用自交法鉴定F2中抗性糯性个体是否为纯合子。若自交后代中没有表现型为 _______的个体，则被鉴定个体为纯合子；反之则为杂合子。请用遗传图解表示杂合子的鉴定过程。（4）拟采用转基因技术改良上述抗性糯性玉米的抗虫性。通常从其它物种获得________， 将其和农杆菌的________用合适的限制性核酸内切酶分别切割，然后借助_________连接，形成重组DNA 分子，再转移到该玉米的培养细胞中，经筛选和培养等获得转基因抗虫植株。 2014年 1.（江苏卷）13.下图是高产糖化酶菌株的育种过程，有关叙述错误 ．．的是 A.通过上图筛选过程获得的高产菌株未必能作为生产菌株 B.X射线处理既可以引起基因突变也可能导致染色体变异 C.上图筛选高产菌株的过程是定向选择过程 D.每轮诱变相关基因的突变率都会明显提高 2.（2014重庆卷.4.）题4图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是 A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上 C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异 3.（2014天津卷. 4.）为达到相应目的，必须 ．．通过分子检测的是 A.携带链霉素抗性基因受体菌的筛选 B.产生抗人白细胞介素－8抗体的杂交瘤细胞的筛选 C.转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定 D.21三体综合征的诊断 4.（课标Ⅰ卷）32.（9分）现有两个纯合的某作物品种：抗病高杆（易倒伏）和感病矮杆（抗倒伏）品种。已知抗病对感病为显性，高杆对矮杆为显性，但对于控制这两对相对性状的基因所知甚少。回答下列问题： （1）在育种实践中，若利用这两个品种进行杂交育种，一般来说，育种目的是获得具有优良性状的新品种。 （2）杂交育种前，为了确定F2代的种植规模，需要正确的预测杂交结果。若按照孟德尔遗传定律来预测杂交结果，需要满足3个条件：条件之一是抗病与感病这对相对性状受一对等位基因控制，且符合分离定律；其余两个条件是 。 （3）为了确定控制上述这两对性状的基因是否满足上述3个条件，可用测交实验来进行检验。请简要写出该测交实验的过程。 2015年 1.（2015年江苏卷.15．）经X射线照射的紫花香豌豆品种，其后代中出现了几株开白花植株，下列叙述 错误 ．．的是

微生物综合试验——产淀粉酶细菌菌株的筛选和培育

产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育 邢大鹏 （合肥工业大学生物与食品工程学院2008级食品科学与工程专业08-1班） 摘要：从合肥工业大学校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生理生化特征测定结果表明，菌株与芽孢杆菌属(Bacillaceae)中的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCohn)种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一定量的枯草芽孢杆菌，最后利用DNS法测定其产酶活力。 关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌 Amylase production screening and selection of bacteria strains Xing Dapeng Abstract: From the Hefei University of Technology campus in the A strain of soil amylase producing bacteria strains. Morphological, physiological and biochemical characteristics of test showed that, strains and Bacillus (Bacillaceae) in Bacillus subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the same kinds of characteristics. Then use the train crossed separation and enrichment of preparation of certain bacillus subtilis, finally, using the DNS method for determining the enzyme production vigor. Key words: amylase, enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis. 芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在1835年，Ehrenberg所描述的“Vibriosubtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn于1872年正式命名的，现作为芽孢杆菌属(Bacillaceae)的模式菌株[1]。从生物学特性来讲，枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特征，其细胞呈直杆状，大小(0.8-1.2)μm×(1.5-4.0)μm，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动(周生鞭毛)；芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型好氧菌[2]。 1997年，Kunst F.等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将结果发表在《Nature》杂志上[3]。

实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013

实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术

, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作

青霉素高产菌株的理性筛选

遗传育种与生物合成 文章编号:1001-8689(2007)07-0403-02 青霉素高产菌株的理性筛选 娄忻　张莉　刘靓　张玉莲　陈丽华　刘静　贺建功 (华北制药集团新药研究开发有限责任公司　微生物药物国家工程研究中心,　石家庄050015) 摘要:　以青霉素生产菌种87117#为出发菌种,采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法,结合限氧条件下的摇瓶筛选,从177支前体抗性株中筛出XY -137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%,且遗传特性稳定,单位菌丝产物合成能力强。XY -137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证,其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 关键词:　紫外诱变;　动态后处理;　理性筛选;　青霉素高产菌株中图分类号:T Q 465.1 文献标识码:A Rational screening of penicillin high producing strain Lo u Xin,　Zhang Li,　Liu Liang,　Zhang Yu-lian,　Chen Li-hua,　Liu Jing and H e Jian-g ong (N ew Dr ug R&D Co.,L td of N or th China Phar macentical Co rp., N ational Eng ineering Resear ch Center of M icro bial M edicine ,　Shijiazhuang 050015) ABSTRACT U sing Penicillium chry sogenum #87117as starting strain ,a penicillin high yield str ain #XY-137w as obtained by U V irr adiation com bined w ith precurso r-resistant strain in shake flask selection metho d under lim ited o xyg en.Penicillin potency of strain #XY-137w as increased by 8.8%cultured in shaking flasks.Average pr oductivity o f about 100batches ferm entation level w as increased by 2.69%～5.66%than that of strain #87117in 100-ton ferm entor . KEY WORDS U V m utagenesis;　Dynamic po st-treatment;　Rational screening ;　Penicillin high-pr oducing strain 收稿日期:2007-03-15 修回日期:2007-05-08 作者简介:娄忻,女,生于1963年,高级工程师。主要从事微生物药物产生菌的遗传育种研究。 由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛,世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平,降低生产成本以增强企业的竞争力,而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 随着青霉素菌种生产能力的提高,传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理,根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计筛选方法,定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念,参照现有生产条件设立基本筛选模型,采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构,再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选,达到选育高产菌株的目的。1　材料与方法1.1　出发菌种 　青霉素生产菌种P enicillium chry sogenum 87117#。 1.2　培养基 (1)分离及斜面培养基　蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl 、CaSO 4、微量元素、琼脂。(2)种子培养基　以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 (3)发酵培养基　以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源,加无机盐类组成。1.3　菌种诱变与筛选 (1)紫外诱变　将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm 处照射90s 。 (2)前体动态后处理　定量吸取经过紫外线照射后的孢子液,分别加入含有不同剂量的前体(苯乙酸胺)的种子培养基试管中,使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h 左右,然后稀释分离在固体培养基平板上。 (3)前体抗性菌落检出　平板置25℃恒温培养 ? 403?中国抗生素杂志2007年7月第32卷第7期

高考生物 热点题型和提分秘籍 专题21 从杂交育种到基因工程(解析版)

专题二十一从杂交育种到基因工程 【高频考点解读】 1.生物变异在育种上的应用 2.转基因食品的安全 【热点题型】 题型一遗传育种的方法及原理 例1、如图表示某种农作物品种①和②培育出⑥的几种方法，有关说法错误的是( ) A．培育品种⑥的最简捷途径是Ⅰ→Ⅴ B．通过Ⅱ→Ⅳ过程最不容易达到目的 C．通过Ⅲ→Ⅵ过程的原理是染色体变异 D．过程Ⅵ常用一定浓度的秋水仙素处理萌发的种子或幼苗 【提分秘籍】 1.诱变育种与杂交育种相比，前者能产生前所未有的新基因，创造变异新类型；后者不能产生新基因，只是实现原有基因的重新组合。 2．在所有育种方法中，最简捷、常规的育种方法——杂交育种。 3．杂交育种选育的时间是F2，原因是从F2开始发生性状分离；选育后是否连续自交取决于所选优良性状是显性还是隐性。

4．杂交育种是通过杂交培育具有优良性状且能稳定遗传(纯合子)的新品种，而杂种优势则是通过杂交获得种子，一般不是纯合子，在杂种后代上表现出多个优良性状，但只能用杂种一代，因为后代会发生性状分离。 5．诱变育种尽管能提高突变率，但处理材料时仍然是未突变的远远多于突变的个体；突变的不定向性和一般有害的特性决定了在突变的个体中有害仍多于有利，只是与自然突变相比较，二者都增多。 6．杂交育种与杂种优势的区别 (1)杂交育种是通过有性生殖，使不同的优良性状组合到后代的一个个体中，从而选育出优良品种的方法。 (2)杂种优势是指基因型不同的个体杂交产生的杂交一代，在适应能力等方面优于两个亲本的现象。 7．不同育种目的的杂交育种的基本步骤及特点 (1)培育杂合子品种——杂种优势的利用 在农业生产上，可以将杂种一代作为种子直接利用，如水稻、玉米等。 ①基本步骤：选取双亲P(♀、♂)→杂交→F1。 ②特点：高产、优质、抗性强，但种子只能种一年。 (2)培育纯合子品种 ①培育隐性纯合子品种的基本步骤 选取双亲P(♀、♂)→杂交，F1→自交→F2→选出表现型符合要求的个体种植推广。 ②培育双显纯合子或隐—显纯合子品种的基本步骤 选取双亲P(♀、♂)→杂交→F1→自交→F2→选出表现型符合要求的个体自交→F3→……→选出稳定遗传的个体推广种植。 ③特点：操作简单，但需要的时间较长。 【举一反三】 在实验田中偶然出现了一株抗旱、抗盐的玉米，设想利用该植株培育能稳定遗传的抗旱、抗盐水稻品种，用到的育种方法和技术应有( ) ①诱变育种②单倍体育种 ③转基因技术④组织培养技术 A．①②③B．②③④ C．①③④D．①②④

实验室常用菌株及特性

一、实验室常见菌株简介 Xl1-Blue菌株 基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F?[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。 特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。 用途：分子克隆和质粒提取。 BL21(DE3)菌株 基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。 特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达。 BL21(DE3)ply菌株 基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cm R)。 特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 用途：蛋白质表达 DH5α菌株 基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ– 特点：一种常用于质粒克隆的菌株。其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC 载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 JM109菌株 基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F? traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。 特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑 筛选。 用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。 DH10B菌株 基因型： F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 endA1 recA1 deoR Δ(ara,leu)7697 araD139 galU galK nupG rpsL λ- The most widely used E. coli strain for BAC cloning is DH10B 。 host for pUC and other α-complementation vectors; pBR322

产蛋白酶乳酸菌的筛选【开题报告】

毕业论文开题报告 食品科学与工程 产蛋白酶乳酸菌的筛选 一、选题的背景与意义 乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB)指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。相当多的乳酸菌是益生菌，是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前，随着人们生活水平的不断提高，乳酸菌在农业、医学、兽医以及食品工业等方面发挥越来越重要的作用。 乳酸菌蛋白酶的主要作用：第一，分解蛋白质分子产生多肽、氨基酸，利于宿主的消化吸收；第二，利于分解牛乳生成的乳酸增加胃内酸度提高胃蛋白酶的活性，利于胃肠道内乳酸菌等有益菌的生长；第三，借助蛋白酶敏感机制，促进损伤的肠黏膜上皮修复，防止致病菌在肠上皮细胞间移位。因此，乳酸菌蛋白质水解能力是影响乳酸菌益生作用的重要因素和开发含有乳酸菌的乳制品时，筛选性质优良，稳定性强的工业生产菌株的重要指标。但目前关于乳酸菌代谢产物的研究报道却很少，尤其是关于产蛋白酶乳酸菌的研究报道只有寥寥几篇。产蛋白酶乳酸菌的筛选工作还远未涉及到所有乳酸菌，还具有很大的发展空间。通过对乳酸菌产蛋白酶能力进行筛选可以为乳酸菌开发利用过程中筛选出品质优良、性质稳定的乳酸菌菌种提供依据；可以为蛋白酶的生产提供依据；可以为鲳鱼饲料的生产提供依据……总之，产蛋白酶乳酸菌的筛选可以为我国乳酸菌相关行业提供有力的支持，会大大促进我国乳酸菌相关行业发展。 二、研究的基本内容与拟解决的主要问题： 1、研究基本内容 ①从泡菜、酸奶、豆腐乳等实验材料中分离纯化乳酸菌； ②将分离出的乳酸菌进行增值培养； ③对增值培养的乳酸菌进行产蛋白能力测定，筛选出产蛋白能力最强的乳 酸菌菌种； ④菌种鉴定。 2、拟解决的主要问题 ①乳酸菌菌种的来源； ②菌种鉴定方法。 三、研究的方法与技术路线：

青霉素高产青霉菌的工艺研究课稿

青霉菌高产青霉素的工艺研究Penicillium Technology Research of High Yield of Penicillin 13生工杨雅娴1308301001

目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。高产青霉素的菌种需经菌种的选育，青霉素的生产包括发酵和提取两部分。工艺流程大致如下：菌种的保藏、孢子制备、种子制备、发酵、提取和精制。 Worldwide for the production of penicillin producing strain were mostly produced for Penicillium chrysogenum strains, obtained through different ways of improvement. High-yield breeding of penicillin subject to strains of bacteria, penicillin production including fermentation and extraction in two parts. Process flow is as follows: the preservation of species, spore preparation, seed preparation, fermentation, extraction, and refining. 关键词：青霉素、高产、选育方法、工艺 一青霉素菌种选育方法 抗生素产生菌的菌种选育工作是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌株，从而促进生产发展。所谓菌种选育，就是利用菌种遗传变异的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传性状，经筛选获得新的适合生产的突变株，提供生产，以稳定提高抗生素产量或得到新的抗生素产品。提高抗生素产生菌的抗生素产量是菌种选育技术的最基本的任务。抗生素是微生物生物合成的产物，由于微生物新陈代谢的特殊性，抗生素发酵生产的原料与抗生素产量并不像化学合成一样有严格的计量关系，采用具有高产优质代谢特性的菌株作为生产菌株，可以在不增加或少增加原料、设备的情况下，大大提高抗生素产量，增加经济效益。 菌种选育技术随着分子生物学、分子遗传学的发展也在不断提高，不断丰富着新的内容。育种技术有自然育种、诱变育种和杂交育种等，随着抗生素合成途径的阐明，菌种选育由诱变结合随机筛选发展成理性筛选，大大提高了筛选频率。 1.1 自然选育 菌种选育最早是利用菌种的自发突变来自然选育，应用菌种自发突变，提高了抗生素生产水平。自然选育是一种纯种选育方法，它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选，排除衰退型菌株。以此来达到纯化菌种、复壮菌种、稳定生产的目的。自发突变是指在没有人工干预下生物体自然发生的突变。微生物以10-6左右的突变率进行自发突变。生产上将该方法又称为自然分离。在制药企业，一般情况下生产上采用的选育方法为自然选育方法，利用每年的春季、秋季进行菌种的自然分离，从中挑选高产稳定菌株，制备砂土管或深冷管保藏。自然选育的方法经济实用，技术难点低；缺点是正突变率太低，难以大幅提高生产水平。 1.2 紫外诱变选育 紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复合酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用

2020年人教版高考生物专题强化测试卷 《生物的变异和进化》(含答案解析)

《生物的变异和进化》专题优化测评卷 一、选择题（每小题6分，共12小题，共72分。在每小题给出的四个选项中，只有一项符合 题目要求，请将正确答案的字母代号填入下表相应题号的空格内） 题号 1. 2. 3. 4. 5. 6.7.8.9.10.11.12. 选项 1.除草剂敏感型的大豆经辐射获得抗性突变体，且敏感基因与抗性基因是1对等位基因。下列叙 述正确的是（） A.突变体若为1条染色体的片段缺失所致，则该抗性基因一定为隐性基因 B.突变体若为1对同源染色体相同位置的片段缺失所致，则再经诱变可恢复为敏感型 C.突变体若为基因突变所致，则再经诱变不可能恢复为敏感型 D.抗性基因若为敏感基因中的单个碱基对替换所致，则该抗性基因一定不能编码肽链 2.下列关于染色体变异的叙述，正确的是（） A.染色体增加某一片段可提高基因表达水平，是有利变异 B.染色体缺失有利于隐性基因表达，可提高个体的生存能力 C.染色体易位不改变基因数量，对个体性状不会产生影响 D.通过诱导多倍体的方法可克服远缘杂交不育，培育出作物新类型 3.图甲表示雄家兔细胞内的一对同源染色体。一个精原细胞进行细胞分裂时得到了图乙所示的情 况，另一个精原细胞进行细胞分裂时得到图丙所示的情况。下列相关说法中不正确的是（） A.图乙所示情况发生在精原细胞进行减数分裂的过程中 B.图丙所示情况发生在精原细胞进行有丝分裂或减数分裂的过程中 C.乙、丙两图所示的变异一定能遗传给子代 D.乙、丙两图所示的变异类型分别属于基因重组和染色体结构变异 4.大豆植株的体细胞含40条染色体。用放射性60C O 处理大豆种子后，筛选出一株抗花叶病的植株X，取其花粉经离体培养得到若干单倍体植株，其中抗病植株占50％。下列叙述正确的是（） 题号一 二 总分 13 14 得分 （时间45分钟满分100分）

从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案解析

土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案 一、综述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研 【】究的一种酶。从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用1。 常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽 【】【】孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌2、凝结芽孢3。由于芽孢杆菌属 是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】和植物体表面及水体中4。所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。 二、实验目的要求 1．了解生物分离提纯的原理和方法技术 2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法 3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法 4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力 5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。 三、实验原理 自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的 【】土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少5。 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

(完整word版)菌种筛选方法

菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberella fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化 反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图5.6.1。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图5.6.1 平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。 4) 生长圈法利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。

青霉素生产菌种的制备与保藏方法

青霉素生产菌种的制备与保藏方法 生命科学学院生物10-2 赵鑫指导教师：朴永哲 摘要：青霉素发酵属单一纯菌种发酵，青霉素生产菌种的制备是青霉素发酵过程的关键环节，生产菌种的质量是影响发酵生产水平的重要因素。在生产过程中既要有优良的菌种，又要有良好的培养条件才能获得高质量的种子。本文将对青霉素生产菌种的制备与保藏方法进行介绍。 关键词：产黄青霉；青霉素；制备工艺；保藏方法 1.概述 1.1 青霉素的定义 青霉素（Benzylpenicillin / Penicillin）又被称为青霉素G、peillin G、盘尼西林、配尼西林、青霉素钠、苄青霉素钠、青霉素钾、苄青霉素钾。青霉素是抗菌素的一种，是指从青霉菌培养液中提制的分子中含有青霉烷、能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素，是第一种能够治疗人类疾病的抗生素。 1.2 青霉素的应用 青霉素类抗生素的毒性很小，由于β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，而人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的过敏反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，是化疗指数最大的抗生素。 临床应用：主要控制敏感金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引起感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。青霉素针剂和口服青霉素能分别治疗肺炎、肺结核、脑膜炎、心内膜炎、白喉、炭疽等病。 工业应用：可用于生产柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸等有机酸和酶制剂。 2.菌种及保藏方法介绍 2.1 菌种介绍 产黄青霉属无性型真菌，一种属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科青霉属的真菌。分布于土壤、空气及腐败的有机材料等基物。最适生长温度为20-30°C。产生青霉素、多种酶类及有机酸，是重要的工业用真菌，也产生真菌毒素。 产黄青霉的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且加上其他抗生素的广泛使用，比如像磺胺药物，使人类的平均寿命，再次延长了四岁。此外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸

高考生物专题6变异育种和进化专点17理解变异原理掌握育种流程复习题

考点17 理解变异原理，掌握育种流程 1．育种方式及原理辨析 (1)诱变育种原理 原基因A(a)――――→诱变产生基因突变新基因a(A) ↓ ↓ 原性状 目标性状 (2)单倍体育种与杂交育种的关系

(3)多倍体育种的原理分析 注意多倍体育种中秋水仙素可处理“萌发的种子或幼苗”，单倍体育种中秋水仙素只能处理“单倍体幼苗”，切不可写成处理“种子”。 2．不同需求的育种方法的选择与分析 (1)若要求培育隐性性状的个体，可用自交或杂交，只要出现该性状即可。 (2)若要求快速育种，则应用单倍体育种。 (3)若要求大幅度改良某一品种，使之出现前所未有的性状，则可利用诱变育种的方法。 (4)若要求提高品种产量，提高营养物质含量，可运用多倍体育种。 (5)若要求将两亲本的两个不同优良性状集中于同一生物体上，可用杂交育种，亦可利用单倍体育种。 (6)若实验植物为营养繁殖，则只要出现所需性状即可，不需要培育出纯种。 (7)若要求克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改变现有性状，则可以选择基因工程育种。 (8)若要培育原核生物，因其不能进行减数分裂，则一般采用诱变育种。 3．花药离体培养≠单倍体育种 (1)花药离体培养仅获得单倍体幼苗。 (2)单倍体育种包括花药离体培养和诱导单倍体染色体加倍。 题组一辨析育种相关的原理 1．(2015·天津，9)白粉菌和条锈菌能分别导致小麦感染白粉病和条锈病，引起减产。采用适宜播种方式可控制感病程度。下表是株高和株型相近的小麦A、B两品种在不同播种方式下的试验结果。

注：“＋”的数目表示感染程度或产量高低；“－”表示未感染。 据表回答： (1)抗白粉病的小麦品种是________，判断依据是____________________________。 (2)设计Ⅳ、Ⅴ两组试验，可探究_____________________________________________。 (3)Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ三组相比，第Ⅲ组产量最高，原因是______________________________。 (4)小麦抗条锈病性状由基因T/t控制，抗白粉病性状由基因R/r控制，两对等位基因位于非同源染色体上。以A、B品种的植株为亲本，取其F2中的甲、乙、丙单株自交，收获子粒并分别播种于不同处理的试验小区中，统计各区F3中的无病植株比例。结果如下表： 据表推测，甲的基因型是________，乙的基因型是________，双菌感染后丙的子代中无病植株的比例为________。 答案(1)A Ⅰ、Ⅱ组小麦未感染白粉病 (2)植株密度对B品种小麦感病程度及产量的影响 (3)混播后小麦感病程度下降 (4)Ttrr ttRr 18.75%(或3/16) 解析(1)从Ⅰ和Ⅱ组的试验结果可知抗白粉病的小麦品种是A。(2)分析Ⅲ、Ⅳ两组试验，

产淀粉酶菌株筛选综述

微生物与转基因技术 摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。 关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体 1引言 转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取 特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。 2微生物与转基因技术 1.微生物与转基因工具酶 转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。 DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中Taq DNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。 依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。 核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA 的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。 核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。 2.微生物与转基因载体