大鼠二型糖尿病造模方法
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论
专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517
摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。
关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ，
糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。
糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病
（Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。
2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
类。主要表现为在基因缺陷基础上的组织的胰岛素抵抗（IR）、胰岛β细胞机能障碍导致胰岛素分泌相对不足，区别于自身免疫β细胞破坏所致的1型糖尿病[2,,3]。IR是由遗传和环境因素导致的，机体对胰岛素生理作用的反应性降低，即胰岛素促进葡萄糖摄取作用受损，导致代偿性胰岛素分泌增多，其重要标志为高胰岛素血症。主要表现为外周组织对胰岛素敏感性下降，以及对葡萄糖的利用障碍[4]。
致病机制主要有：遗传缺陷、获得型器官官能障碍(AcquiredOrganDysfunction)和生活习惯三大因素。糖尿病是多基因相关的疾病，可能存在很多糖尿病易受性基因[2]，只有如线粒体基因组缺陷和某些特殊糖尿病可以较明确的用基因遗传解释[1]。近年来，生活习惯的影响愈加显着，不良的生活习惯导致、加重胰岛素抵抗，削弱胰岛素分泌从而引发糖尿病，过度肥胖和胰岛素抵抗伴随的过量的脂肪酸会联合过高的血糖使β细胞功能进一步恶化。中国农村的糖尿病发病率为%～%，而城市超过5%[5]。
2型糖尿病特征：病程前期长；中老年人群高发；血浆胰岛素水平仅相对降低，糖刺激后延迟释放（有时肥胖病人空腹血浆胰岛素基值可偏高，糖刺激后胰岛素亦高于正常人，但比相同体重的非糖尿病肥胖者为低）；HLA（白细胞抗原）、ICA（胰岛细胞抗体）呈阴性；胰岛素效应低；可用口服抗糖尿病药物控制血糖[3]。降糖药物作用不佳时可使用胰岛素[9]。2型糖尿病患者通常需要长年服用降糖药物，常用一线降糖药只针对消除血糖高现象，未从病因着手，因此患者依然会出现胰岛细胞功能逐渐下降和各种并发症，患者生活质量较低，寿命缩短，经济压力大。
因此，为能更深入研究糖尿病的发病机理、潜在治疗因素；更好的创新、研发治疗2型糖尿病药物，构建尽可能与人类有相同2型糖尿病（T2DM）特点的，简单、稳定、经济的动物模型有重要意义。
一、模型
.造模方法
1、2型糖尿病实验性动物模型通常用物理或化学方法致胰腺或胰岛β细胞损伤，从而使胰岛素分泌功能发生障碍，造成胰岛素缺乏[6]。
以下为常用造模法：
（1）、催肥法：通过对动物模型使用药物刺激（如注射金硫葡萄糖），使其贪食、嗜睡，逐渐提高实验动物的体重，达到增肥目的。并得到高血糖、高胰岛素血症和有胰岛素产生抵抗的动物模型。但此方法成模率低，动物死亡率高。
（2）、部分胰腺切除法1889年Minkowski切除犬胰腺成功制作出糖尿病
的模型。但造模需手术且不稳定因素多。只从单一方面展现治病因素。现使用较少。
（3）、化学诱导法：此类方法操作简单，成本较低，较好控制应用较多。常见三类：①四氧嘧啶（Alloxan）和链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)：四氧嘧啶可抑制葡萄糖激酶和诱导活性氧簇，从而诱发糖尿病。STZ已不对人使用的广谱抗生素，对胰岛β细胞有高选择性毒性作用[7,8]。②烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和小剂量STZ模型：NAD为抗氧化剂清除体内自由基作用从而而降低STZ对胰岛β细胞的细胞毒性。成年Wistar大鼠先腹腔注射NAD，15min后尾静脉注射STZ，形成血浆胰岛素水平维持在正常水平，而伴有稳定的非空腹高血糖症的2型糖尿病模型[9]。③STZ诱导糖尿病：大剂量给予STZ诱导成年大鼠1型糖尿病模型；小剂量给予STZ诱导成年大鼠2型糖尿病模型。单次较大剂量STZ(80～100mg/kg)诱导新生大鼠成年后发展为2型糖尿病。用来研究有关于β细胞的再生、β细胞功能衰减及胰岛素作用缺陷的机制[10]。
但单一化学药物通常需较大剂量，毒副作用大，容易引起动物死亡。
（4）、高糖高脂联合STZ法：高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗，之后注射低剂量STZ破坏部分胰岛β细胞功能。胰岛β细胞由于胰岛素抵抗等因素进一步损害，发展为胰岛素分泌功能失偿，出现葡萄糖耐量受损，发展为2型糖尿病[11，12]。此方法构建的模型可以较好的模拟人类II型糖尿病的特点和发展情况，并且成本较低，操作方便[12,13,14]。
.动物选择
诱发糖尿病的机理有种属差异，不同物种之间的诱发机理差别很大。可用做糖尿病模型的动物种类包括猴、小羊、狗、兔、大鼠、小鼠、仓鼠等，其中鼠类应用最多。除以上实验性2型糖尿病鼠类模型外，另有两大类：(1)自发性2型糖尿病模型；(2)转基因动物模型[15]。
自发性糖尿病动物模型
在自然条件下或基因突变发生通过遗传育种保留的动物模型。疾病的发生、发展与人类糖尿病非常相似，应用价值高，但较少考虑环境因素，来源较少，种类有限，价格昂贵。
①ob/ob小鼠：瘦素基因缺乏，常用于减肥药和抗糖尿病药物的研究和检测。
②db/db小鼠：瘦素受体基因缺陷，发病过程与人类二型糖尿病非常相似，出生约一个月后逐渐出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病症状，研究中应用较多。
③KK糖尿病小鼠：胰岛素不敏感，对葡萄糖耐量小，糖尿病发病率高，有
轻度胰岛素抗性，易表现糖尿病肾病特点。特点为：轻度肥胖、高血糖症、高胰岛素抵抗
④NSY(Nagoya-shibata-yasuda)小鼠：具有年龄依赖性，糖尿病发展速度较缓慢。给予高脂食物能够加速其发生过程，且会出现胰岛素分泌不足及胰岛损伤。
⑤其他：Zucker大鼠和非肥胖自发性2型糖尿病大鼠：GK(Goto-Kakizaki)大鼠，CD(Cohendiabetic)大鼠。
转基因动物模型
已有多种转基因或基因剔除小鼠糖尿病模型。相关基因位点：胰岛素受体(insulinreceptor，IR)、胰岛素受体底物(insulinreceptorsubstrate，IRS）：IRS-1、IRS-2、胰岛素分泌相关的GLUT-2、胰岛素样生长因子-1受体、葡萄糖转运蛋白GLUT-4、过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ等[1]。二、高糖高脂饮食联合STZ法
材料
链脲佐菌素（STZ）是从无色链霉菌提取出的广谱抗生素，可抗菌、抗肿瘤但因对胰岛β细胞具有高度选择性的杀伤毒性[6]已不使用。STZ注射后迅速作用于胰岛β细胞的特异性毒性、对机体毒性较小使其成为国内外广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂[16,17]。
STZ引起的糖尿病的机制未完全清楚，主要为DNA和线粒体破坏：①含亚硝基，可诱导一氧化氮的合成，通过一氧化氮(NO)和自由基两种途径损伤胰岛β细胞DNA，增加胰岛β细胞的氧化侵袭，诱导多聚ADP核糖基化作用，消耗β细胞内NAD+和ATP，导致β细胞大量坏死[4，5]；②经葡萄糖转运体2(GLUT2)进入β细胞造成DNA烷基化损伤，诱导多聚ADP核糖基化作用[3]。③胰岛β细胞损伤后，激活自身免疫，胰岛β细胞受免疫攻击[21,8]。同一种系动物中STZ致β细胞损伤程度取决于STZ剂量，低剂量诱导大鼠胰岛素细胞（INS-1）调亡，高剂量致β细胞坏死[19]。
给药途径为：静脉注射(iv)、皮下注射（sc）、腹腔注射(ip)、心内注射（ic）等[11]。因腹腔注射操作容易、准确快速，现多采用腹腔注射法。
高脂饮食使动物肥胖，胰岛素所需量增加，β细胞因过度负荷致细胞衰退，出现高血糖、高血脂等糖尿病症状[19]。
（1）、大鼠品系、性别、年龄（体重）均有影响。
①Wistar大鼠成模率低于SD大鼠且死亡率均高于SD大鼠[20]；杨亦彬等人报道：wistar大鼠空腹成模率为%，SD鼠为%，非空腹组成模率仅10%，未成模大鼠空腹下追加小剂量STZ不能成模。成模鼠肾胰显示特征性改变。不同时点
血糖值差异大[21]。
②年龄影响大鼠对STZ的敏感性，现成年大鼠模型多用200～250g的大鼠制备[1]。
③雄性大鼠比雌性大鼠成模率高，稳定性好，耗时短。单纯高糖高脂饮食喂养的雄性、雌性大鼠，血糖血脂无差异，但注射STZ后，雌性鼠对STZ敏感性弱于雄性鼠，雄性大鼠血糖升高并稳定在较高水平，而雌性需要再一次注射STZ，模型才能相对稳定[1,22]。
（2）、成模后动物状态：
糖尿病SD大鼠在注射STZ后第2即逐渐出现多饮、多食、多尿和体重减轻的“三多一少”症状，且可以一直维持到实验结束。随着病程的发展，逐渐出现毛发竖立无光泽、脱毛、蜷卧拱背、活动减少、伤口易感染和白内障等表现，严重者有尾部僵硬、烂尾、趾端破溃感染[16,22]。
胰腺组织变化普通大鼠的胰腺外分泌细胞及胰岛内细胞形态正常，分界清楚。注射STZ的糖尿病大鼠，胰腺外分泌细胞充血，分界不清，明显炎性浸润，细胞核破碎、溶解；胰岛内细胞大量破裂，细胞核变形溶解，残存细胞核
。胰岛变小，密度减低，胰岛分布稀疏，胰岛细胞数数量少，明显分布不均
[11]
量减少、肿胀，胞质着色浅，细胞核固缩[20]。
应注意，建模5个月后，大鼠会出现食欲不振、极度消瘦，精神萎靡，行动迟缓，饮水量、尿量明显增加[16]。应在适当时间遵循《关于善待实验动物的指导性意见》进行适当处理并在试验后进行安乐死[23]。
指标
除以上描述大鼠成模后体征状态变化，大鼠项指标也会出现变化。基本变化为：建模后约1个月，大鼠各指标异常，空腹血糖值、胰岛素含量、三酰甘油及总胆固醇呈逐渐上升趋势、胰岛素敏感指数呈逐渐下降趋势至实验结束[16]。说明模型存在胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱。
指标变化情况[22,11]：
血清中胰岛素(INS)
空腹血糖（FBG）：FBG≥L或FBG≥L
胰岛素敏感性指数（ISI)：ISI=ln[1/(FBG×INS)]（HOMA法）[24]低
于正常动物（说明胰岛素抵抗）。
血浆胰岛素（FINS）：升高
甘油三脂（TG、CHO）：升高
胆固醇（TC)：升高
游离脂肪酸（FFA）：升高
低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)：升高
高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)：降低
糖化血红蛋白（HbA1c）：红细胞内的血红蛋白与血糖不可逆结合产物
胰腺中胰岛素的储存量：减少，＜40%[25]。
郭学军等报道，葡萄糖耐量测试(OGTT)比空腹血糖监测更有诊断意义：实验前禁食12h，用20%葡萄糖溶液(2g/kg)灌胃，于空腹、服糖后30、60和
120min定时鼠尾采血测定血清葡萄糖含量[24]空腹血糖高于L，和试验后2小时内随机血糖高于L即为糖尿病[20]。
血清胆碱酯酶活性低，存在肝代谢功能异常[26]。
因FBG≥L时糖尿病微血管并发症发生的危险性明显增加，1997年美国糖尿病协会建议将糖尿病诊断标准降至L[19]。之后有学者提出FBG不够全面，建议将餐后随机血糖纳入到成模标准，随机血糖＞L纳入成模标准[27]。造模组中以FPG＞7mmol/L作为成模标准的成模率比以随机血糖＞L作为标准的成模率少很多[28]。
因此符合①体征如上文描述伴且有“三多一少”症状；②空腹血糖高于L，和OGTT试验后2小时内随机血糖高于L；③胰岛素敏感指数显着低于正常大鼠或单高糖高脂喂养大鼠的对照组(P≤，也显着低于自身注射STZ前的水平，明模型组大鼠已产生胰岛素抵抗。并且各指标稳定2周以上者则说明成功诱导糖尿病模型[28,25,29]。大鼠在造模后48h时体重较造模前明显减少的特点，可以在尾静脉采血测血糖前大略估计成模率[30]。
2型糖尿病动物模型在STZ注射后的7天后到实验结束或给予治疗药物之前，FBG水平一直很高，且维持稳定；同时，ISI仍明显低于正常对照大鼠（存在胰岛素抵抗）。并始终有三多一少特点，可以认为2该模型长期稳定[24,18]。讨论
影响因素
①成模后因注意将疑似1型的大鼠尽量排除出组。
1型糖尿病模型组一次成膜，血糖升高效果一直非常稳定，维持到实验结束，而且在实验过程中出现明显高血糖损害症状，如眼部损害（眼底出血、失明），坏尾及死亡等；2型糖尿病模型组则需两次甚至三次给药，同时其血糖在第一次给药后有所恢复，再次给药才逐渐稳定。2型糖尿病主要病变是胰岛素抵抗，胰岛病理改变大都较轻，血浆胰岛素水平有双向变化，即有时增高或分泌延时，高血糖及低血糖可交替出现[31]，从而血糖也一直低于1型糖尿病模型[26]。
②STZ对大鼠体重有较大影响。注射STZ2后，模型大鼠体重会出现下降，小剂量STZ注射后大鼠胰腺β细胞破坏，迅速出现高血糖、多尿等代谢紊乱症状，致使体重下降[22,19]。并且，饲料中油脂含量过高加上大鼠分泌的胆汁不足以把大量的油脂转化吸收，使TG低于正常大鼠[19]。
③2型糖尿病具有的胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍两要素，按表现先后和轻重可将病程分为三期：一期，有胰岛素抵抗和高胰岛素血症，血浆葡萄糖得以维持正常；二期，胰岛素抵抗加重，虽有高胰岛素血症，但胰岛素愈高，受体愈不敏感，虽有高胰岛素血症，仍出现餐后高血糖症；三期，胰岛素抵抗仍存在，但胰岛素分泌降低，导致空腹高血糖症。胰岛分泌功能会随持久的高血糖毒性作用进一步恶化。通过此标准可划分模型所处的病程[3]。
④肥胖是一种典型的环境因素与遗传因素相互作用导致能量摄入与消耗失衡所造成的慢性疾病。在同样的饮食条件下，有些人容易发展成为肥胖，而有些人则仍能维持正常体质量。高脂饮食加腹腔注射小剂量链脲佐菌素方法中，高脂饮食仅能诱发一部分大鼠发生胰岛素抵抗和肥胖，另一部分则不发生胰岛素抵抗和肥胖[28]。在注射小剂量链脲佐菌素前，食源性肥胖性大鼠血糖虽无明显升高，但体质量、血脂和血清胰岛素浓度显着上升，胰岛素敏感性显着下降，即产生胰岛素抵抗[28]。
张松筠等报道：实验中50只高脂饮食大鼠仅24只出现明显的摄食增加，变的肥胖，同时伴有高胰岛素血症和胰岛素抵抗纳入食源性肥胖组，其余26只无明显体质量增加和胰岛素抵抗。虽然SD大鼠对食物营养成份敏感，但存在一定易感性差异，因此，仍有一部分大鼠的摄食量明显低于食源性肥胖大鼠，维持正常体质量，具有肥胖抵抗的特性[21]。这类大鼠成模率较低即使最终成模，也更加类似1型糖尿病。因此，建议先筛选食源性肥胖大鼠作为2型糖尿病造模对象。但由于两种大鼠几乎各占一半且筛选时间过长导致造模费用过高并用时过长[28]。
⑤2型糖尿病的形成与环境因素造成的氧化应激、自由基防御机能紊乱密切相关。放射线对细胞的生物化学损伤主要是电离辐射导致多种自由基对细胞的功能和结构损伤。一些患者的血糖空腹期 指标如：丙二醛（MDA）、晚期糖基化终末产物（AGEs）含量升高，超氧自由基的清除剂（SOD）的活性下降。氧化应激诱发胰岛素抵抗，胰腺必需分泌足够高的胰岛素来克服胰岛素抵抗，长期的高胰岛素分泌，导致IGT的发生，IGT造成的血液黏度升高、微血管灌注不良进一步促进自由基的形成，加重了氧化损伤程度[25-10]。升高的血糖水平加之机体的氧化应激环境，能够加速AGEs的生成，2型糖尿病患者的血管病变进展迅速与AGEs影响血管壁的自稳态有关[25,32]。从而，提出在糖高脂饮食联合小剂量STZ造模时辅以抗氧化剂的去除，可以使模型对葡萄糖刺激的反应更接近2型糖尿病患者胰岛素分泌的两相性特点，同时胰腺中胰岛素也有一定的贮存量[25]。 剂量 在国内外报道中STZ在25mg/kg到45mg/kg的小、中剂量之间成模效果较好。成模大鼠均具有多饮、多食、多尿、体质量减轻等表现。胰腺破坏超过40%时，才会出现高血糖症，而大鼠之间存在个体差异，所以，同样低剂量STZ 注射，可表现出不同程度的高血糖症[18]。 其中，单词注射STZ剂量在25mg/kg至35mg/kg之间长期稳定性较差且成模率较低，但对大鼠毒性伤害较小，单词注射STZ剂量在35mg/kg至 45mg/kgSTZ之间，成模率高于25mg/kg至35mg/kg之间，且死亡率低于剂量达到50mg/kg的模型，血糖能维持在较高水平且稳定性较好[11]，糖耐量异常和空腹糖耐量受损情况的指标较稳定[19]。也有研究人员使用两次小剂量注射STZ建立成模率较高、稳定性较好且死亡率较小的2型糖尿病模型[33，20]。 胰岛中β细胞的损伤激活了胰腺导管中的干细胞，从而影响实验动物成模的稳定性，小剂量连续应用链脲佐菌素可以克服胰岛β细胞代偿性增殖的影响，同时，实验动物成模后应继续予以高糖高脂饲料喂养，可以使血糖逐渐升高，长期高糖血症的糖毒性会损害胰岛β细胞，导致INS分泌下降，达到维持2型糖尿病动物模型稳定的效果[34]。 多次小剂量给予STZ不会造成胰腺胰岛素水平的急剧下降，大鼠胰腺中胰岛素的量可以维持在略小于40%处，胰腺保留一定分泌胰岛素的功能，这一点与2型糖尿病患者的临床症状相似[25]。这种2型糖尿病大鼠模型的特点为：①链脲佐菌素的剂量很低，不会引起胰岛B细胞严重破坏和其它脏器的损坏(小剂量链脲佐菌素引发凋亡，大剂量链脲佐菌素则引起胰岛B细胞坏死)[28,35]②血糖持续升高，提示该模型稳定和有效。③成功模拟了2型糖尿病的自然发病过程，在长期胰岛素抵抗之后胰岛B细胞失代偿性功受损，胰岛素分泌减少。[28]。 动物饲养护理 造模后大鼠体质较差，死亡率很高，常常会影响实验结果。糖尿病是一种 慢性炎性反应疾病，其固有免疫炎症细胞的功能障碍涉及全身各个系统[36,37]创面愈合过程中巨噬细胞早期进入创面的数量减少，而晚期则持续停留于创面，同时伴随着生长因子表达量的下降和相关炎症因子表达量的改变，从而导致创面愈合困难。表现为M1型巨噬细胞的数量和比例增高［21］，且其分泌的炎症因子水平上升，但其刺激活化后的炎症因子表达能力和吞噬能力却明显减弱［6，22，27］。刘宸等人实验显示：糖尿病大鼠创面中的巨噬细胞早期浸润数量较低与创面愈合率具有正相关性，而晚期残留巨噬细胞数量较多且与创面愈合率具有负相关性。糖尿病状态下的巨噬细胞吞噬速度较正常慢5倍以上［30］，可能导致创面坏死组织及调往细胞清除较慢持续趋化巨噬细胞浸润，同时已趋化至创面的巨噬细胞也无法顺利完成凋亡过程，并且由于炎症因子的分泌功能下降，糖尿病创面不能形成有效的负反馈机制抑制炎症反应，最终导致了愈合后期创面巨噬细胞的浸润增多、炎症反应增强。而愈合晚期增强的炎症反应不利于创面的愈合，可以导致创面上皮化的失败和血管化的困难，因此，尾静脉采血法测量血糖时，要注意采血部位的局部消毒[36]。 建立2型糖尿病SD大鼠模型应注意方面：①STZ要求保存在-20℃冰箱中，其水溶液极其不稳定使用时，现用现配，加入L枸橼酸缓冲液中，配好后在 10min内用完，注意低温、避光放置[30,38]；②用来造模的大鼠应有良好的营养状态及较强的抵抗力，体重应在190g-230g之间为佳；③动物饲养密度不宜过大（小于5只/笼）④注射STZ前大鼠应空腹12h以上；⑤造模成功后大鼠尿量明显增加，故每天应换2~3次垫料，以保持鼠笼清洁，干爽；⑥造模后大鼠抵抗力较差，易发生肺炎等疾病，实验室应保持适宜、恒定的温度和湿度，并保持良好通风；⑦造模后大鼠需多次测量血糖，推荐采取尾静脉采血法，因眼眶静脉丛采血或断尾法取血法对大鼠损害较大（且断尾过于残忍已不采用），易合并感染，故要特别注意采血部位的消毒，避免感染[30]。 三、参考文献： [1]李秀丽.2型糖尿病的治疗药物研究进展[J].赤峰学院学报(自然科学 版),2008,01:123-125. 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在试验中，通过较长时间给予大鼠过量的高糖高脂饮食，发现能够诱导出较满意的T2DM大鼠模型，从而能为进一步研究奠定良好的基础。目前认为其机理可能是高糖高脂饲料会导致胰岛B细胞超负荷，进而使胰岛细胞发生损伤、萎缩甚至死亡，胰岛的功能因此下降，继而建立起伴胰岛素抵抗的T2DM模型。鲁瑾[1]等采用61%的高脂饮食，饲养大鼠7周后，大鼠就出现了高胰岛素血症，且形成了明显的胰岛素抵抗，是一个十分可靠的胰岛素抵抗模型。张丽锋[2]等给予W istar大鼠脂肪热比为59%的饲料, 喂养4周，均出现胰岛素抵抗，多项研究试验表明高脂饮食可以诱发产生可靠的糖尿病大鼠模型。 1.2 应用STZ药物诱导产生的大鼠模型由于高糖高脂饲料相对用时较长，且饲料成本相应较高，因此合理使用链脲菌素(STZ)是目前许多研究者所推崇的 大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020 大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两 实验流程 1、末次灌胃后，大鼠禁食不禁水12h，与麻醉前进行称重，行腹腔注射3%戊巴 比妥钠，0.3ml/100g 2、腹主动脉取血，留取全血标本。 3、取肝、脾、肾、胃、心脏及脑。 4、称肝、脾、肾、胃、心脏及脑组织，并分装各个组织，放入-80℃冻存。其中 肝组织剪取1g肝脏，送至肝均浆；肝10%甲醛固定做HE染色，每组5只； 肝4%戊二醛固定做电镜，每组一只； 5、小肠10%甲醛固定做HE染色，每组5只；小肠4%戊二醛固定做粪便电镜，每 组1只；其余肠组织-80℃冻存。 6、肝；制成肝均浆，1g肝脏加入9ml冰生理盐水，制成肝均浆液，离心后，取 上清液，于-80℃冻存。 7、全血标本静置30min后，进行离心，分离血清，血清和血浆均放入-80℃冻存。检测指标： 1、肝脏组织 1.1HE染色观察肝脏组织的病理学改变。 1.2透射电镜观察肝脏超微结构变化 1.3电感耦合等离子体质谱（ICP-MS） 1.4试剂盒测肝均浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶 （GSH-Px）、ROS活性氧水平 1.5检测肝脏组织中Western blot、NF-kB、COX-2表达情况，计算其阳性表达 率 2、血清（血浆） 2.1全自动化分析仪测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷氨转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶TG 2.2酶联免疫吸附法检测血浆中肠结合脂肪酸蛋白（FABp2）、D-乳酸（D-LA）及二胺氧化酶（DAO）水平评价大鼠大肠粘膜损伤 2.3试剂盒测血浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛（MDA）、4-HNE（羟基壬烯醛）、 谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）评价大鼠氧化应激水平 2.4酶联免疫吸附试验（ELISA）检测大鼠血浆中α肿瘤坏死因子（TNF α）、肿瘤坏死因子β（TNF-β）、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、细胞间粘附因子-1(ICAM-1)浓度 3、肠道菌群 进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响 实验目的： 1.熟悉常用的糖尿病大鼠造模方法 2.掌握血糖仪的使用方法 3.掌握组织样品的制备方法 4.了解血清胰岛素水平检测方法 5.熟悉肝糖原提取、鉴定的方法与原理 6.通过本实验探讨临床糖尿病患者不同进食状态对血糖的影响 实验用品： 一、器材： 普通离心机，酶标仪，恒温水浴箱，分光光度计，0.01g电子天平、0.1g电子天平，血糖仪，棉签，干棉球，剪刀2把，镊子2把，研钵2个，白磁盘，试管架，拆条酶标板，吸水纸，5ml离心管，试管，烧杯，漏斗，玻璃棒，刻度吸量管，EP管，滤纸，1000μl微量可调取液器，50ml容量瓶3个，注射器，白瓷反应板，塑料手套，布手套，抹布，记号笔 二、试剂： 5%三氯乙酸溶液，蒸馏水，生理盐水，碘试剂，95％乙醇，标准葡萄糖溶液（50mg/L），98%浓硫酸，30%KOH溶液，0.2%蒽酮显色剂，柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液（PH4.4），1%链脲佐菌素（STZ）溶液，10%水合氯醛溶液，大鼠胰岛素（INF）ELISA检测试剂盒 实验步骤： 一、标记： 二、造模： A、抓取大鼠并称重。（结果见表一） B、大鼠先禁食12小时后（此部分为老师帮忙完成），进行血糖检测。然后抓取大鼠单次腹腔注射按1%STZ溶液（65mg/Kg），注射后一小时，给予自由饮食、饮水。 具体抓取大鼠方法：用右手将鼠尾抓住提起，放在较粗糙的台面或鼠笼上，抓住鼠尾向后轻拉，左手紧抓两耳和头颈部皮肤，余下三指紧捏鼠背部皮肤，如果大鼠后肢挣扎厉害，可将鼠尾放在小指和无名指之间夹住。 C、以后每天安排人员进去喂养动物，记录饮食量和更换垫料。 D、待72小时后大鼠尾静脉采血再次检测血糖，以餐后血糖≥16.7mmol/L为大鼠糖尿病模型造模成功的判定标准。 血糖检测具体步骤：将血糖检测专用试纸插入血糖分析仪中，待血糖仪显示屏上显示滴血标记时，方可使用。用剪刀剪断大鼠尾尖约＜0.5cm，挤出的第一滴血用棉球擦掉不要，第二滴血滴在试纸上。待血糖仪显示屏上显示稳定的数值后记录。（血糖检测结果见表二） 三、麻醉： 大鼠称量后，通过计算每只大鼠所需麻醉量（0.3ml/100g），抓取大鼠，腹腔注射。 四、血清胰岛素水平检测： 麻醉后摘除大鼠眼球，取血约1ml于EP管中，静置一小时以上，由于实验顺序要求先进行接下来的肝糖原检测并鉴定实验，所以静置后将EP管放入冰箱内冷藏一天，第二天进行实验时，将EP管对称放入离心机中，进行2000r/min离心15分钟，分离血清100μl。采用大鼠胰岛素ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒步骤进行血清胰岛素水平检测。 板37°C温育30分钟。 3．洗涤5次，每孔加入酶标试剂50μl，37°C温育30分钟。 4．洗涤5次，每孔加入显色液A,B各50μl，37°C避光显色10分钟。 2型糖尿病大鼠模型的建立及其验证论著 燕娟1 郭巍伟1 梁执群1 李志国1 郭永昌2 (山西医科大学1人文社会科学学院;2实验动物中心 山西 太原 030001) 【摘要】 目的 制备一种发病过程类似人类2型糖尿病的动物模型。方法 雄性S D成年大鼠高糖高脂饲料喂养 1个月,诱发出胰岛素抵抗,给予小剂量链脲佐菌素(STZ)25mg/kg,腹腔注射,建立2型糖尿病大鼠模型。结果 试验 组大鼠血糖升高,对胰岛素敏感性下降,从生化指标和形态学方面证实造模成功。结论 本实验2型糖尿病大鼠模型 造模成功,它具有中度高血糖、胰岛素抵抗、成功率高等特点,是人类2型糖尿病及其药物研究的理想动物模型。 【关键词】 糖尿病 动物模型 大鼠 Type2d i a betes ra t m odel and its ver i f i ca ti on.YAN Juan,G UO W ei-w ei,L I ANG Zhi-qun,et al.ShanxiM edical U niversity,College O f Hu2 m anities A nd Social Science,Taiyuan Shanxi030001,China. 【Abstract】 O bjecti ve Preparati on of a disease si m ilar t o human type2diabetes ani m al model.M ethods Male S D adult rats fed high- fat high-sugar a month,induced insulin resistance,given l ow-dose strep t ozot ocin(STZ,25mg/kg,intraperit oneal injecti on),set up in type2 diabetic rat model.Results Test gr oup of rats increased bl ood glucose,insulin sensitivity decreased,fr om the bi oche m ical indices and mor phol ogy confir med the successful model.Conclusi on The experi m ental rat model of type2diabetes model successfully,it has moderately high bl ood sug2 ar,insulin resistance,the success rate is high,are of human type2diabetes and its drug research ideal ani m al model. 【Key words】 D iabetes;Ani m al model;Rat 糖尿病与心脑血管疾病、肿瘤是当前威胁人类健康的三大非传染性疾病,已成为全球性的卫生问题。随着我国人民生活水平的提高、人口老化、生活方式的改变以及诊断技术的进步,糖尿病的发病率呈现迅速上升趋势,2型糖尿病是糖尿病人群的主体,占糖尿病发病率的90%以上。因此,研制2型糖尿病动物模型具有重要的医学研究意义。在国外2型糖尿病的研究中,采用的动物模型多为遗传相关模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠及肥胖型Zucker大鼠等,其特点是遗传因素在发病过程中占主导作用,不完全与临床相符,且十分昂贵,不利于国内研究的开展[1]。本研究结合前人经验,应用高糖高脂饲料结合小剂量链脲佐菌素(STZ)建立了2型糖尿病大鼠模型,较符合人类普通型2型糖尿病发病机制,有利于进行2型糖尿病及其并发症的相关研究[2,3]。1 材料和方法 1.1 动物和材料 清洁级雄性S D大鼠40只,体质量(180±20)g,由山西医科大学实验动物中心提供,每笼4～5只,饲以普通饲料,自由摄食摄水,除实验应激外无其他不良刺激。STZ由美国Sig m a公司生产。胰岛素、胰高血糖素放射免疫分析药盒为解放军总医院科技开发中心放免所产品,购自北京普尔伟业生物科技有限公司。 1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 在大鼠适应期后,随机取10只作为正常对照组,其余30只给予高糖高脂饲料(在标准全价混合饲料的基础上添加蔗糖、炼猪油和蛋黄,热能含量21.6kJ/kg)。高糖高脂饲料组喂养4周后,腹腔注射STZ(临用前溶解在pH=4.0的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液内,25mg/kg,1次/d,连续2d),正常对照组普通饲料喂养4周,再注射等量柠檬酸缓冲液,1次/d,连续2d。注射药物两天后间隔1d血糖测试仪测查大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)即注射后血糖,以血糖含量16.7mmol/L为2型糖尿病大鼠模型判定标准,随机选取10只糖尿病大鼠为模型组。继续普通饲料喂养4周。 1.3 指标测定 1.3.1 一般状况观察 包括大鼠的精神状态、体质量、饮水量、食量、大小便。 1.3.2 血糖测定 腹腔注射STZ或柠檬酸缓冲液2 d后及实验结束时分别进行空腹状态下剪尾取血,测其血糖值,为注射后血糖。4周后处死大鼠测其血糖为终血糖。 1.3.3 血清胰岛素、胰高血糖素水平测定 实验结束时禁食12h,20%的乌拉坦腹腔麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清后放射免疫分析法测定。 1.3.4 胰岛素敏感指数(I SI)的计算 参照李光伟等[4,5]的方法,I SI=ln[1/F BG×F I N S],F BG为空腹血糖,F I N S为空腹胰岛素。 1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理,数据以均数±标准差( x±s)的形式表示,用t检验分析。 2 结果 2.1 两组大鼠一般状况 对照组大鼠生长良好,体质量持续增加,无其他症状。模型组大鼠在注射STZ后体质量呈缓慢增长、逐步较前下降、消瘦走势,观察发现有 ? 5 ? 临床和实验医学杂志 2009年4月 第8卷 第4期 7 摘要：目的探讨链脲佐菌素（STZ ）建成可靠、稳定的1型大鼠糖尿病模型情况。方法选取 SDF 级雄性Wistar 大鼠70只，分成3个实验组，各20只和对照组10只，实验组大鼠一次性腹腔注射STZ 30、65、100mg /kg ，对照组10只大鼠腹腔注射枸橼酸缓冲液，用拜安易血糖仪检测血糖，7d 后血糖＞16．65mmol /L 判定为1型糖尿病动物模型。观察大鼠的血糖、体质量、饮水量、胰岛素和C 肽等指标。结果大鼠注射STZ 65mg /kg 7d 后，大部分血糖值达到成模标准，并出现糖尿病表现，持续观察7周，有18只大鼠成模，未见糖尿病转复，糖尿病症状明显。结论腹腔一次性注射STZ 65mg /kg 剂量可成功制备1型糖尿病大鼠模型。 关键词：链尿佐菌素；1型糖尿病模型；大鼠 Establishment and Observation of Type I Diabetic Rat Models ZHANG Ju-biao 1， SU Xiu-lan 2，OUY-ANG Xiao-hui 1 ．（1．Department of Tumor Surger ， Inner Mongolia Autonomous Region People's Hospital ，Hohhot 010010，China ；2．Central Lab of Inner Mongolia Medical University ，Hohhot 010010，China ） Abstract ：Objective To establish type I diabetic rat models by intraperitoneal injection of streptozoto-cin and observe the stability of diabetic changes in rats．Methods 70male Wistar rats were divided into 3experiment groups of 20rats each and 1control group of 10rats．The experiment groups were intraperitoneally injected by 30mg /kg ，65mg /kg ，and 100mg /kg STZ respectively ，while the control group was injected cit-rate buffer．Bayer blood glucose meter was adopted to test the blood glucose ，setting ＞16．65mmol /L after 7d as the type 1diabetic animal model．The fasting blood glucose level ，body weight ，water intake ，insulin and C-peptide of the rats at different time points were observed /measured．Results In the group of injection by 65mg /kg STZ ，after 7days most rats reached the model blood glucose standard and had diabetic manifes-tation ，after continuous observation of 7weeks ，18rats were qualified as the model with obvious symptoms and without conversion．Conclusion With the dose of 65mg /kg of STZ through one intraperitoneal injection ，type 1diabetic rat models can successfully established． Key words ：Streptozotocin ；Type 1diabetic models ；Rat 糖尿病已成为严重威胁人类身体健康和生命的 疾病。它是一种以持续性高血糖为特征的内分泌障碍疾病，可导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经和心血管等器官的慢性进行性病变，最终引起功能损伤及衰竭。1型糖尿病及其并发症的病因、发病机制尚未完全阐明，预防和治疗仍不完善，干细胞（stem cells ）是体内存在的一类特殊细胞，有自我更新和不断增生的能力，又具有多向分化的潜能，只要掌握了胰腺干细胞的特异标志、转化调控机制、培养及分离技术，就可以体外操纵干细胞，进行大量扩增和定向诱导分化，最后将得到能分泌胰岛素的胰岛 样细胞［1-2］，用于治疗1型糖尿病。因此，建立较理 想的动物模型研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前，国内外普遍使用STZ 制备糖尿病大鼠 动物模型。该项实验根据吴清洪报道的方法［3］ ，采用简单的腹腔一次注射的方法制备稳定并且可靠的动物模型。1材料与方法 1．1实验动物的选择和喂养SDF 级成熟Wistar 雄性大鼠70只（体质量220 280g ），购自内蒙古大学实验动物中心，饲养室内氨浓 度＜20g /L ， 相对湿度40% 70%，室温18 25℃，保证良好的通风，避免增加造模后大鼠的感染概率，普通饲料喂养，饮水自由。 1．2主要仪器和试剂拜安易血糖检测仪及试纸（美国Bayer 公司）；STZ （美国Sigma 公司）；胰岛素、C 肽放射免疫分析药盒（均购自内蒙古泽生耗材）。 1．3主要实验试剂的配制STZ 液称取STZ 粉剂0．2g ，溶于pH 4．5，浓度为0．1mmol/L 的枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液20mL 中，制成1%溶 液，经0．22μm 滤器过滤除菌，要求5min 内配制完成，配好后，10min 内用完，STZ 和枸橼酸缓冲溶液低温保存，新鲜配制。 1．4实验分组和大鼠糖尿病模型的制备采取国内外普遍使用的STZ 制备糖尿病大鼠模型，根据徐 华等［4］ 报道， 雄性大鼠易于成模，且成模后血糖稳定性好，故选取成熟雄性大鼠用于实验。将所有大鼠（70只）使用代谢笼单只喂养，适应性喂养1周， 1周内注意观察大鼠的饮食情况、体质量等健康状况， 1周后，选取空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠为实验对象。将空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠随机分为4组，实验组（60只）分别接受STZ 液一次性腹腔注射，剂量为30、65、100mg /kg ，对照组（10只）注射枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液。实验前 大鼠禁食、水12h 。分别于注射后3、 7、14、28d 采用剪尾法采集血样，用拜安易血糖仪检测空腹血糖，7d 后空腹血糖＞16．65mmol /L ，出现多饮、多食、多尿 · 533·医学综述2013年1月第19卷第2期Medical Recapitulate ， Jan．2013，Vol．19，No．2 糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义(一) 【摘要】目的：建立糖尿病大鼠模型，探讨糖尿病大鼠尿中nephrin的检测、动态变化及意义。方法：SD大鼠腹腔注射链脲佐菌素制成糖尿病模型，正常对照组注射等量枸橼酸缓冲液，动态检测各组大鼠24h尿微量白蛋白及肾功能，以Western-Blot方法动态检测尿中nephrin。结果：正常大鼠尿中无nephrin排泄，而糖尿病大鼠尿中可检测出nephrin，诱模早期（2周）即可出现，随着病程的延长，nephrin逐渐增多，8周达高峰后，nephrin的排泄又逐渐减少。结论：糖尿病肾病早期nephrin即可从尿中排泄，尿nephrin可作为糖尿病肾病的早期诊断指标之一，还将有助于监测、判断糖尿病肾病的病程进展。 【关键词】糖尿病肾病；大鼠；微量白蛋白;尿nephrin 〔Abstract〕Objective:Diabeticratswereinducedtoexplorethedetectionofurinarynephrinindiabeticrats,itsdyna micchangesandclinicalsignificance.Methods：SDratsweredividedinto2groups.Diabeticratsmodelwereinducedbysingleintraperitonealinjectionof streptozocin(STZ),whilethoseofnormalcontrolgroupwereinjectedwithequaldosageofcitricacidbuffe rsolution.Twentyfourhoursurinarymicroalbuminandrenalfunctionwereambulatorilymonitored,and UrinaryNephrinwasmeasuredwithWestern-Blot.Results：Thetestshowedthatnourinarynephrinwerefoundinnormalcontrolgroup,butitwasdectetedoutindia beticratsgroup,anddiscoveredattheearlystage(2weeksafterSTZinjection).Withtheextensionofcours e,urinarynephringraduallyincreased,andthengraduallydecreasedafterreachingitspeakbyweek8.Co nclusion：Thenephrincouldbeexcretedoutfromurineattheearlystageofdiabeticnephropathy.Urinarynephrinc ouldnotonlyberegardedasaspecificindexfortheearlydiagnosisofdiabeticnephropathy,butalsobeben ificialtoclinicalmonitoringandevaluatingthedegreesoftheDN. 〔Keywords〕diabeticnephropathy;rats;microalbumin;urinarynephrin 糖尿病肾病(diabetesnephropathy，DN)是糖尿病微血管病变之一，是终末期肾衰的重要原因，早期诊断和治疗可延缓其发展。DN起病隐匿，早期诊断困难，目前公认的诊断早期DN的指标是尿微量白蛋白，但也仅使DN诊断提早到依据Mogensen建议的Ⅲ期。部分糖尿病患者当发现微量白蛋白尿时，肾脏的结构损害已很明显〔1〕。因此不能单以尿微量白蛋白的出现来判断早期DN。 蛋白尿的发生与肾小球滤过屏障密切相关，nephrin是新近发现由足细胞表达、特异定位于肾小球足细胞裂孔隔膜的蛋白分子，参与肾小球滤过屏障的形成并维持其正常功能〔2〕。研究表明，实验性糖尿病模型及人类蛋白尿相关的肾小球疾病均有nephrin表达的改变，且nephrin可从尿中排泄〔3〕。而尿中nephrin排泄量增加是否可敏感反映糖尿病早期肾脏损害，目前国内尚未有报道。本文对糖尿病大鼠尿蛋白排泄率(AER)及尿液nephrin进行动态观察，旨在探讨尿nephrin在DN中的变化规律及其对早期DN的诊断意义。 1对象与方法 1.1实验动物及分组 雄性SD大鼠76只，体质量230～280g，购自江苏大学医学院实验动物中心，血糖正常。试验期间，室温控制在18～20℃，湿度48%，12小时交替照明，大鼠自由饮水进食，保持垫料干燥。实验共分对照组（n=36），糖尿病组（n=40）。对照组0周处死6只，再与糖尿病组随机分为2，4，6，8和12周5个亚组，分别于DM诱模后2，4，6，8和12周处死。 1.2糖尿病模型的建立 所有大鼠适应性喂养1周，随机取40只，禁食12h后，空腹状态下，链脲佐菌素（STZ）按55mg/kg一次性腹腔注射制备糖尿病模型，STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1mmol/L,pH4.2) 大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约8.3%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至5.92亿。在2013年，全球约有3.82亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为1.14亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达19.6%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g ~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type 1 diabetes）和2型糖尿病（Type 2 diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependent diabetes STZ诱导的大鼠糖尿病模型 糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏导致的以高血糖为主要特征表现的代谢紊乱综合征，易发生心、脑、肾等并发症。糖尿病状态下血浆游离脂肪酸异常增高，心肌耗能增加，葡萄糖代谢下降，脂肪酸代谢增加，心脏内过量的脂肪酸摄取和氧化导致心肌内脂肪代谢产物的积聚引起心脏脂质毒性，并在此基袖上出现氧化应激，导致细胞调亡、内皮功能紊乱、炎症反应增加，同时出现心肌的损伤，心肌的结构和功能均发生改变，最后导致糖尿病患者的死亡。 1.实验动物 SPF级SD小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为180g~200g。 2.实验分组： 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3. 模型周期 4W 4.主要试剂及配制方法 柠檬酸、柠檬酸三钠、链脲佐霉素(Streptozocin, STZ) 1. 柠檬酸钠缓冲液配制：将 2.10 g柠檬酸加入双蒸水100 ml配成柠檬酸母液，称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100 ml配成柠檬酸钠母液，称为B液；将A、B液按1:1.32比例混合，pH计测定pH值，调定溶液pH=4.0，即是所需配制STZ的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。 2. STZ溶液的配制：将STZ溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成10 mg/mL浓度的STZ溶液，并用0.22μm滤菌器过滤除菌。注意避光配制，现用现配。 5.建模方法 1.术前12h禁食 2. 模型组小鼠按照55 mg/kg 剂量的STZ 进行腹腔注射，对照组给予给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液。 3. STZ注射7 d后，测空腹血糖，选择血糖为13.5-25mmol/L纳入正式实验。 4. STZ注射后，每周测血糖，称体重，观察体重血糖变化。 5. 第4周检测各组大鼠的体重和空腹血糖值后，摘眼球采血，室温静置2h 后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取黄脂，皮下脂肪，骨骼肌，白脂，肝脏，肺脏，心脏，肾脏用于病理和分子生物学检测。 6.模型评价 1. 大体观察：正常组大鼠体型适中，精神状态良好，动作自如，反应灵敏，毛发平伏有光泽。而糖尿病大鼠体重变轻，精神萎靡，反应迟钝，毛竖无光泽，动作迟缓，弓背捲体，尿量显著增加。糖尿病大鼠较正常组体重显著减轻，心脏系数、肝脏系数较正常组有显著增加，且有统计学意义。 2. 空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇水平的变化： 正常对照组的空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇水平在实验前后均无显著差异；DM组的空腹血糖、甘油三酯和总胆固醇水平显著高于对照组， 3.糖尿病大鼠心脏组织形态学的变化 经HE染色可见正常对照组大鼠心肌纤维排列整齐，致密，结构清晰，细胞核染色质分布均匀，细胞外间质较少，微血管结构正常，可见少量成纤维细胞，间质无明显的炎症细胞浸润；DM模型组大鼠心肌纤维排列紊乱，心肌细胞肥大，细胞间隙增大，结构不清晰，有的细胞核膜皱缩，核固缩，并有炎症细胞浸润，肌细胞间也可见成纤维细胞浸润 4.糖尿病大鼠肺脏组织形态学的变化 HE染色显示，对照组大鼠肺组织结构清晰，肺泡分布均勾，肺泡隔、支气管 壁完整，肺间质分布均勻，少见炎性细胞浸润；DM组大鼠肺组织结构紊乱，部分肺泡腔萎缩、塌陷，可见肺大泡，支气管壁增厚，肺间质和血管周围细胞外基质增多，成纤维细胞增多，并有大量炎症细胞浸润， 5.糖尿病大肾脏组织形态学的变化 HE染色显示，DM组大鼠肾小球肥大增生，肾小球系膜基膜增厚，肾小管空泡变性，胞质空亮。 6.糖尿病大鼠肝脏组织形态学的变化 经油红O染色可见DM组大鼠肝内脂滴较大，红色脂滴明显，肝脏可见显著的 2型糖尿病动物模型研究概况高秀娟马会霞江春花 (华北煤炭医学院中医学系河北唐山063000) [关键词]2型糖尿病动物模型研究进展 [中图分类号]R25[文献标识码]A [文章编号]1008-6633(2009)06-783-03 糖尿病是一种慢性代谢紊乱疾病,世界范围内约有1.7亿患者,其中2型糖尿病(T2D M)占整体糖尿病的90%以上,可靠的动物模型是研究T2D M发生机制及新的干预措施的重要手段。目前制备T2D M模型应用的动物种类多种多样,动物种属的选择非常重要,其中鼠科动物由于具有体积小,生殖周期短,容易通过饲料、药物处理或遗传方法诱导疾病等优势,被广泛的应用于T2D M模型的制备中,它是人类研究T2D M的强有力的工具。下面就应用鼠科动物制备T2D M模型的研究进展作一综述,仅供参考。 1自发性动物模型 1.1自发性2型糖尿病大鼠主要包括G/K大鼠(Goto-K ak2 izaki R at)、OLETF大鼠(O tsuka Long Evans To kushi ba F atty R at)、Z DF大鼠(Zuke r d i abe ti c fatty R a t)等,这类动物多数肥胖,有明显的高胰岛素血症,类似人类2型糖尿病的发病特征,国外研发口服抗糖尿病及并发症的新药多选用这类动物[1]。 1.1.1G/K大鼠。G/K大鼠是日本的一大鼠品系,是一种常用的自发性非肥胖型T2D M实验动物模型,其特点是高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗出现早[2]。其发病机制可能是骨骼的糖元合成酶不能有效地将多余的葡萄糖转化为糖元贮存起来,从而使动物出现高血糖。G/K大鼠的特征有,葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损,B细胞数目减少,肝脏对胰岛素的敏感程度降低导致肝糖生成过多等,此外具有与人类T2D M微血管并发症相似的改变。骨组织形态学和生物力学分析显示,非肥胖的2型糖尿病G/K大鼠有明显的骨代谢紊乱,骨强度明显降低[3]。近来的研究表明G/K大鼠子一代的胰岛及胰腺血流量的增加有赖于迷走神经[4]。G/K大鼠子一代轻度高血糖、葡萄糖耐受受损伤。在病理性的腹腔葡萄糖耐量出现后一周测其胰岛及整个胰腺的血流量,发现其血流量增加、胰岛所占胰腺血流量增加,切断腹腔双侧迷走神经,胰岛及胰腺血流量降低。 Pa rt haB认为G/K是研究糖尿病最好的动物模型,但是其发病过程中B细胞数目降低后有一个增殖的过程,这与人类发病情况有很大不同,也是限制G/K大鼠应用的关键[5]。 1.1.2OL ETF大鼠。OLETF大鼠是最近常用的T2D M动物模型。其特点是:轻度肥胖、高胰岛素血症、高甘油三酯血症。史红莉等[6]研究发现14周的OL ETF大鼠已存在胰岛素抵抗,体重和腹内脂肪重量增加,同时存在三酰甘油和胆固醇的增高。大鼠在24周龄时发病率为100%。组织学研究发现此种大鼠胰腺呈进行性纤维化,并可出现肾脏并发症,其与T2D M患者的病理变化极为相似。 1.1.3Z DF大鼠。Z DF肥胖T2D M大鼠是良好的肥胖型T2D M 的动物模型。该动物易发展为肾微血管病变。此种大鼠由于瘦素受体突变导致多食、肥胖,同时伴有高血糖、高胰岛素血症、高脂血症、中度高血压,较接近于人的胰岛素抵抗同时伴有高血压的患者,可作为胰岛素抵抗的动物模型。一般8~10周出现糖尿病,有糖尿病的典型症状如多饮、多尿、体重增加缓慢等,并可出现神经病变[7]。对fa/fa ZDF的胰岛分离,测其磷酸肌酐(P I)水解及胰岛素分泌反应,结果磷酸脂酶C调节的胰岛P I水解和高血糖刺激的胰岛素释放增加,这二者的增加能先于糖尿病被检测出来。因此P I水解的变化可能是Z DF大鼠胰岛素抵抗的原因[8]。 1.1.4肥胖。W istar糖尿病大鼠(o beseW i star fa tty rats)该品系动物T2D M实验动物模型的特征为甘油三酯生成过量,但机体对其分解的能力却受到了损伤,这种损伤是因低密度脂蛋白不易移去甘油三酯和机体不易移去低密度脂蛋白-甘油三酯,另外果糖能够进一步增加肝甘油三酯产生,导致高甘油三酯恶化[9]。 1.2自发性T2D M小鼠主要包括D i abetes(DB)小鼠、Obese (OB)小鼠、Toronto-KK(T-KK)小鼠、Nagoya Shi bata Yasuda (NS Y)小鼠等。 1.2.1db小鼠。db小鼠是l epti n受体基因缺陷导致的先天肥胖性T2D M小鼠,其发病过程与人T2D M非常相似,是国际上广为采用的研究T2D M的动物模型[10]。其瘦素受体基因失去功能,在出生后2周内就发生高胰岛素血症,3~4周发展为肥胖,4 ~8周后就发展为非常严重的高血糖症,其间有胰岛素抵抗发生,B细胞功能衰竭,一般在10个月内死亡,可发生明显的肾病。 1.2.2ob小鼠模型。o b小鼠模型是一种瘦素受体与瘦素基因均发生变异的模型,属常染色体隐性遗传,表现为饮食过量,3~ 4周发展为高胰岛素血症伴发胰岛素抵抗,最后发展为非常严重的糖尿病。 1.2.3KK糖尿病小鼠。1941年K#Ko ndo用日本商人的小鼠原种(Kansukabe群)培育而成的,该动物对胰岛素不敏感,对葡萄糖耐量小,糖尿病发病率高,以具有轻度肥胖、高胰岛素抵抗和高血糖症的特征。KK小鼠对胰岛素有轻度抗性,易于出现类似糖尿病肾病的肾脏损害[11]。 1.2.4NSY小鼠(Nagoya-sh i bata-yas uda)。NS Y小鼠发展为糖尿病的速度相对较为缓慢,具有年龄依赖性,年龄在糖尿病的发展过程中占有重要作用,12周龄后,胰岛素抵抗也不是很明显,其与人类疾病情况相似,减肥食谱的摄入能减轻其疾病状态,高脂食品能够加速疾病的发生过程,并且会出现胰岛素分泌不足及胰岛素作用受损现象[12]。胰岛素含量36周龄后显著增加,NS Y小鼠将有助于人们对T2D M遗传学倾向及病理发生的进一步研究。 2诱发性动物模型 2.1高脂饲料喂养近年来实验研究发现高脂膳食可诱发T2D M,为深入研究T2D M的发病机制,阐明营养因素与糖尿病的关系提供了重要线索及实验依据,也为广泛开展T2D M的实验研究提供了良好的动物模型。高脂饮食可诱发糖尿病的报道 1 材料与方法 1. 1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠39只, 10周龄, 体重180~200 g。 1. 2 试剂与高脂饲料配方 STZ购自Sigama公司, 胆固醇、胆酸钠由上海蓝季科技发展有限公司提供。 高脂饲料配方: 2%胆固醇, 0. 3%三号胆盐,20%蔗糖, 10%猪油, 67. 7%基础饲料。 1. 3 动物分组与饲养 SPF级雄性3周龄SD大鼠39只, 体重180g~200g, 适应性饲养一周后, 随机分为正常对照组10只, 模型组34只。模型组大鼠禁食12h后, 单次腹腔注射35mg /kg的STZ。STZ用灭菌的0. 1mmo l/L, pH4. 4d的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配成2%溶液, 现配现用。正常组只注射等量的缓冲液。72h后取尾静脉血测空腹血糖高于7. 0mmo l/L 和餐后血糖均高于11. 1mmo l/L为糖尿病模型建立。一次注射未成模, 立即仍按原剂量补注一次STZ, 未成者淘汰,成模但缓解者淘汰。糖尿病大鼠成模后给予要付治疗，分别是药物A+多糖1组（25ug/ml/天，灌胃给药）10只；药物B+多糖1组（25ug/ml/天，灌胃给药）5只；药物C+多糖1组（25ug/ml/天，灌胃给药）5只；药物A+多糖2组（25ug/ml/天，随饮水给药）5只；药物B+多糖2组（25ug/ml/天，随饮水给药）5只；药物C+多糖2组（25ug/ml/天，随饮水给药）5只；正常对照组（5只），多糖组和二甲双胍组给予每天灌胃，七叶皂甙钠组给予腹腔注射。除 正常对照组外其他SD大鼠给予高脂高糖饲料喂养。 1. 4 标本采集 4周后，除取材组外，其他大鼠进行尾静脉取血，约300微升，30min 后用3000r /min 离心15min, 分离血清。并且对糖尿病模型组3只，正常对照组1只进行取材（肾脏、胰腺、血管和心脏），动物称重后，分别于空腹状态下予水合氯醛麻醉（1ml/kg）,腹主动脉脉采血10mL, 30min后用3000r /min 离心15min, 分离血清。其他组织分为两部分，一部分组织于-80°C冻存，另一部分组织生理盐水清洗后，用4%多聚甲醛固定固定24h, 常规脱水包埋, 连续切片4μm, 切片固定于载玻片上, HE染色,免疫组化，并进行光镜观察。 8周后正常对照组2只，糖尿病模型组3只进行尾静脉取血，约300微升，30min后用3000r /min 离心15min, 分离血清。其余大鼠进行取材（肾脏、胰腺、血管和心脏），称重后，分别于空腹状态下予水合氯醛麻醉（1ml/kg）,腹主动脉脉采血10mL, 30min后用3000r /min 离心15min, 分离血清, 用于备检胰岛素含量。其他组织分为两部分，一部分组织于-80°C冻存，另一部分组织生理盐水清洗后，用4%多聚甲醛固定固定24h, 常规脱水包埋, 连续切片4μm, 切片固定于载玻片上, HE染色,免疫组化，并进行光镜观察。 12周后对正常对照组2只和糖尿病模型组3只进行取材，称重后，分别于空腹状态下予水合氯醛麻醉（1ml/kg）,腹主动脉脉采血10mL, 30min后用3000r /min 离心15min, 分离血清, 用于备检胰岛素含量。其他组织分为两部分，一部分组织于-80°C冻存，另一部分组织生理2型糖尿病大鼠模型研究概况
大鼠二型糖尿病造模方法
糖尿病大鼠指标
进食状态对糖尿病大鼠血糖及肝糖原的影响
2型糖尿病大鼠模型的建立及其验证
1型糖尿病大鼠模型的建立及观察_张巨彪
糖尿病大鼠尿nephrin 的检测及意义(一)
大鼠二型糖尿病造模方法
STZ诱导的大鼠糖尿病模型
2型糖尿病动物模型研究概况
糖尿病大鼠造模过程